Биотехнология растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

Глава 1. Биологические особенности ремонтантной малины

1.1 Ремонтантная малина как культура

1.2 Особенности клонального микроразмножения плодово-ягодных культур

1.3 Этапы клонального микроразмножения ремонтантной малины

1.4 Характеристика фитогормонов и регуляторов роста растений, применяемых при культивировании ремонтантной малины

Глава 2. Материалы и методы исследований

2.1 Описание сорта Бабье лето-2

2.2 Состав питательной среды, применяемой для культивирования ремонтантной малины in vitro

Литература

Введение

Селекционная практика свидетельствует, что на создание нового сорта малины с учетом всех этапов его формирования в лучшем случае требуется 12-15 лет. Значительно оптимизировать селекционно-генетические исследования, а также ускорить размножение исходных форм и сортов можно путем применения современных биотехнологических методов. Так метод клонального микроразмножения позволяет получать в сравнительно короткий срок необходимое количество генетически идентичных растений, освободив при этом культивируемый материал от патогенов.

Перспективным направлением в решении этих проблем является создание сортов ремонтантного типа, формирующих основной урожай на побегах текущего года во второй половине лета - начале осени, генетический потенциал и необычный способ возделывания которых обеспечивают максимальную механизацию по уходу за насаждениями, включая уборку урожая.

Культивируемая на полях малина подвержена абиотическим стрессам, нападениям насекомых, вирусному и грибному заражению. Тем не менее, попытки повысить продуктивность с помощью биотехнологических подходов важны для защиты от насекомых-вредителей и пестицидов, для улучшения качества ягод[4]. Культуральные аспекты выращивания различных сортов малины и проблемы проведения пограничных этапов (введение in vitro и адаптация ex vitro) изучаются достаточно широко.

Методика клонального микроразмножения ремонтантной малины была разработана и адаптирована для сортов отечественной селекции (Нам, 1998). Актуальной проблемой является то, что при культивировании ремонтантной малины in vitro состав сред, концентрация гормонов для размножения, укоренения и многое другое для разных генотипов и сортов изменяются. Существуют проблемы на различных этапах культивирования in vitro, в том числе на стадии укоренения, а также на стадии адаптации пробирочных растений к условиям внешней среды. Более того, при одной и той же схеме экспериментов у разных видов можно получить разные результаты. Эти различия и взаимодействие разных факторов пока остаются непонятными. Для укоренения часто применяются фитогормоны. Ауксины считаются одними из основных гормонов растений.

Регуляторы роста представлены широким спектром природных и синтетических веществ, оказывающих воздействие на все этапы онтогенеза растений (Муромцев Г.С. и др., 1987). Среди них особое место занимают природные фитогормоны и их синтетические аналоги (Кулаева О.Н., 1973, 1982; Кефели В.И., 1974, 1989), направленно регулирующие процессы, протекающие в растениях, что позволяет использовать их в биотехнологиях in vitro (Муромцев Г.С. и др., 1987; Шевелуха B.C., 1992).

Так, при микроразмножении некоторых видов растений на этапах введения эксплантов in vitro и собственно размножения пробирочных растений применяются цитокинины пуринового ряда - 6-БАП, реже кинетин и зеатин, а на этапе индукции ризогенеза - ауксины ИУК, ИМК или НУК.

Регуляторы роста широко используются при возделывании многих сельскохозяйственных культур, при этом они стимулируют рост и развитие растений, увеличивают их продуктивность и устойчивость. В настоящее время таких препаратов известно довольно много. Многие из них не являются аналогами фитогормонов или имеют весьма отдаленное сходство с ними. Механизмы и особенности их действия на растения изучены в недостаточной степени. Поэтому возникает задача исследования влияния фитогормонов и РРР и их взаимодействия.

Исходя из этого, целью данной работы являлось изучение активности и взаимодействия различных фитогормонов и регуляторов роста растений при укоренении микрорастений ремонтантной малины сорта Бабье лето - 2. Для решения поставленных целей решались следующие задачи:

Изучить длину корней у пробирочных растений ремонтантной малины сорта Бабье лето-2 при использовании фитогормонов и РРР в различных концентрациях.

Изучить количество корней у пробирочных растений ремонтантной малины сорта Бабье лето-2 при использовании фитогормонов и РРР в различных концентрациях. малина ремонтантный фитогормон

Определить влияние совместного действия фитогормонов и РРР на длину корней растений ремонтантной малины сорта Бабье лето-2.

Определить влияние совместного действия фитогормонов и РРР на количество корней растений ремонтантной малины сорта Бабье лето-2.

Усовершенствовать схему укоренения ремонтантной малины сорта Бабье лето - 2

Глава 1. Биологические особенности ремонтантной малины

1.1 Ремонтантная малина как культура

Малина обыкновенная - ветвистый многолетний полукустарник с прямостоячим стеблем, высотой до 180 см. Побеги первого года зеленые, бесплодные, усажены шипами, второго - плодоносящие, слегка одеревеневшие. Листья очередные, непарноперистые, с 3--5, иногда 7 листочками, сверху голые, снизу беловойлочные. Цветки невзрачные, зеленовато-белые, пятилепестные, собранные в пазушные кисти. Плод - малиново-красная сложная костянка, легко отделяющаяся от конического цветоложа.

Цветет в июне--июле. Плоды созревают в июле--августе.

Малина обыкновенная широко культивируется в центральных и северных областях, на Урале и в Сибири. В диком виде малина распространена в лесной и лесостепной зонах европейской части СНГ, в Западной Сибири, на Кавказе, в Крыму и некоторых районах Средней Азии.

Ягоды малины богаты клетчаткой (4,8-5,1%), которая стимулирует работу кишечника и способствует выведению вредных веществ из организма. Благоприятно влияет на пищеварение и содержащийся в ягодах пектин. Ценная составная часть плодов - биологически активные вещества: аскорбиновая кислота (до 50 мг), катехины (до 80 мг), антоцианы (100-250 мг), витамины В 9, В 12, Е и др. Из минеральных соединений в малине довольно много железа (1200 мг), цинка (200 мг), меди (170 мг) и марганца (210 мг на 100 г сырого продукта) (Казаков, 2007).

В плодах малины обнаружено особое вещество - бета-ситостерин, которое предупреждает отложение холестерина в стенках сосудов и, следовательно, возникновение склероза. По содержанию бета-ситостерина эта ягода уступает только облепихе. Доказано и высокое кроветворное влияние ее плодов, употребление которых помогает предупредить лейкемию.

Целебными свойствами обладают не только ягоды малины, но и листья, соцветия, стебли, корни. В листьях малины, например, содержание витамина С в 8-10 раз выше, чем в ягодах. Чай из цветков рекомендуется пить при простудных заболеваниях, он снижает температуру и снимает интоксикацию.

Малина - скороплодная и урожайная культура. Урожайность лучших её сортов может достигать 12-15 т ягод с гектара и более. Однако в производственных условиях такие результаты получают крайне редко. Это связано не только с низким уровнем агротехники, но и с недостаточной адаптацией существующих сортов к неблагоприятным факторам внешней среды (подмерзание растений в экстремальные зимы, снижение продуктивности в жаркие, засушливые сезоны вегетации, повреждение вредителями и болезнями и др.). Кроме того, возделывание малины сопряжено с высокими трудовыми и энергетическими затратами.

В последние годы увеличивается потребительский спрос на посадочный материал новых, высокопродуктивных сортов малины. Особой популярностью пользуются сорта ремонтантного типа, генетический потенциал и необычный способ возделывания которых позволяют внедрить экологически безопасную и низкозатратную технологию, обеспечить максимальную механизацию по уходу за насаждениями, включая уборку урожая. Ремонтантность - это способность к непрерывному (в течение всего вегетативного сезона) плодоношению, в отличие от обычных ремонтантные сорта следом за первым урожаем выбрасывают соцветия, цветут и вновь плодоносят. Таким образом, плодоношение идет практически непрерывно.

Первые сорта ремонтантной малины были получены около ста лет назад. Современные ремонтантные сорта, созданные российскими учеными, не имеют аналогов в мире. Плоды этих сортов начинают созревать в начале августа, разгар их плодоношения приходится на конец августа - начало сентября (Казаков, 2007).

Выращивание ремонтантных сортов малины имеет ряд преимуществ. В первую очередь это возможность применения низкозатратной технологии их возделывания путем поддерживания однолетнего цикла развития растений и формирования урожая (Казаков, 2000). Т.о. исчезает проблема зимостойкости побегов, так как надземную часть малины осенью срезают до уровня земли. Кроме того, создание ремонтантных сортов с неполегающими под тяжестью урожая стеблями обеспечивает максимальную механизацию ухода за насаждениями, что позволяет сократить материальные и трудовые затраты (Казаков, 1995). Упрощается уход за посадками, поскольку отпадает необходимость в вырезке отплодоносивших стеблей, пригибании побегов к земле и укрытии под зиму. Невысокие кусты (до 1,5 м) ремонтантной малины не нуждаются и в установке шпалеры и подвязке к ней побегов. В-третьих, убирая осенью отплодоносившие стебли из сада, удаляют значительную часть инфекции и зимующих вредителей. Все это позволяет выращивать ремонтантную малину без применения или с ограниченным использованием химических средств и тем самым получать экологически чистую ягоду.

Популярность ремонтантной малины, в первую очередь, объясняется тем, что она лишена многих недостатков, которыми обладает малина обыкновенная. В отличие от малины обыкновенной, развивающейся в двухлетнем цикле (первый год - рост однолетних побегов, второй год - плодоношение перезимовавших и ставших уже двухлетними стеблями), малина ремонтантная - культура с однолетним циклом развития надземной части. За один сезон она успевает вырасти и дать урожай. Отплодоносившие стебли при этом поздно осенью или рано весной срезают до уровня почвы, вывозят с участка и уничтожают. Вместе со стеблями с участка увозятся и уничтожаются большинство вредителей и болезней, которые на обычных сортах малины зимуют именно на надземной части растений. Это одно из главных достоинств ремонтантной малины. В отличие от обыкновенной, ремонтантная малина значительно меньше повреждается болезнями и вредителями.

В связи с тем, что малина ремонтантная очень слабо повреждается болезнями и вредителями, проявляются и другие ее достоинства. Во-первых, она не нуждается в различных химических обработках и связанных с этой операцией затратах средств и времени. И, во-вторых, как следствие отсутствия обработок химикатами опасными для здоровья, на малине ремонтантной созревает экологически чистый урожай.

Основные задачи селекции малины - создание высокоурожайных сортов, адаптированных к неблагоприятным факторам внешней среды, имеющих высокие вкусовые, товарные и технологические качества ягод, пригодных для механизированной уборки урожая.

При селекции ремонтантной малины одна из основных задач - повышение урожайности ее сортов. Созданием ремонтантных сортов малины, пригодных к машинной уборке урожая, решается задача получения генотипов, имеющих пряморослый габитус куста, высокую плотность ягод, хорошее отделение их от плодоложа и дружное созревание. В результате созданы более 20 первых отечественных сортов малины ремонтантного типа, из которых восемь (Абрикосовая, Августина, Бабье лето, Бабье лето-2, Бриллиантовая, Геракл, Золотые купола, Элегантная) включены в Госреестр селекционных достижений РФ, допущенных к использованию. Остальные проходят государственное и производственное испытание (Казаков, 2007).

Ремонтантные сорта малины дают от 1,7 до 3,7 кг ягод с куста. При благоприятных почвенных и погодных условиях особой урожайностью - более 20 т с гектара - отличаются сорта Атлант, Брянское диво, Рубиновое ожерелье, Элегантная. В межвидовом потомстве малины удалось выделить ремонтантные гибриды, урожай которых полностью созревает в конце августа - первой половине сентября. Особый интерес представляют сорта Бабье лето-2, Брянская юбилейная, Надежная, Евразия и Пингвин, совмещающие раннее созревание ягод с обширной зоной осеннего плодоношения и другими ценными признаками (Казаков, 2001).

1.2 Особенности клонального микроразмножения плодово-ягодных культур

Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения.

В полевых условиях технология выращивания и размножения ремонтантной малины достаточно сложна. Однако успешно для ее культивирования достаточно успешно применяется метод клонального микроразмножения (Нам, 1998).

Клональное микроразмножение - получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность.. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения (Говорова,1966):

ь получение генетически однородного посадочного материала;

ь освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

ь высокий коэффициент размножения (105 - 106 - для травянистых, цветочных растений, 104 - 105 - для кустарниковых древесных растений и 104 - для хвойных);

ь сокращение продолжительности селекционного процесса;

ь ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

ь размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

ь возможность проведения работ в течение всего года;

ь возможность автоматизации процесса выращивания.

Методы клонального микроразмножения

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

1. Активация пазушных меристем.

2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.

3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.

4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.

5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем.

Основное преимущество клонального микроразмножения - получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях больных растений впервые было высказано в 1936 г. Чунгом, а позднее, в 1943 г., и Уайтом. В 1949 г. этот факт был подтвержден экспериментально.

Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. В России работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Под руководством чл.-корр. РАН, академика РАСХН Бутенко Р.Г. были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов.

Сейчас технологии клонального микроразмножения in vitro на лабораторном уровне разработаны в мире более чем для 2400 видов растений (А.Сассон, 1987). В настоящее время в Европе и США клональное микроразмножение постепенно вытесняет традиционные способы вегетативного размножения. В США, Италии, Франции, Великобритании, Голландии, Новой Зеландии имеются производственные лаборатории, работа которых по выпуску оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур поставлена на промышленную основу (Полевой,1982) .

1.3 Этапы клонального микроразмножения ремонтантной малины

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100-200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4-24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4-5 мг/л), дитиотриэтол (1-3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2-5 мг/л), поливинилпирролидон (5000-10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5-1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап - собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов - ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

3 и 4 этапы - укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два раза (Горьковцева,1991), а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта (Стахеева,1998), уменьшают количество сахара до 0,5-1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют в-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК или их комбинации, например НУК с ИМК. Иногда применяют феруловую или хлорогеновую кислоты (Острейко,1981; Поликарпова,1984).

Многие авторы процесс индукции корнеобразования с помощью ауксинов рекомендуют проводить в темноте, объясняя это усилением поглощения регулятора роста.

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Эту операцию целесообразно проводить с конца марта-начала апреля, когда у растений начинается активный рост (Хасси,1987).

Растения земляники, вишни, малины и других культур вполне удовлетворительно переносят пересадку в обычный автоклавированный субстрат (песок, торф, почва в соотношении 1:1:1 или торф и песок 3:1) (Высоцкий,1996).

Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Это связано с тем, что микрорастения, выращенные в культуре in vitro, имеют ряд анатомических и физиологических особенностей. Для них характерны более мелкие и тонкие листья, слабо развитая кутикула, нарушение работы устьиц, ксилемные ткани в регенерантах могут образовать закрытую систему, поскольку побеги образуются до образования корней. Кроме того, тип питания микрорастений миксо- или гетеротрофный, но не автотрофный.

Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85--90° С в течение 1--2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1).

Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20--22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65--90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.

Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость. В связи с этим главная задача этого этапа - акклиматизация микрорастений в условиях in vivo.

В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники (транспирационный-аэрационный). Он основан на постепенном увеличении объема воздуха, используемого растением, также облегчает адаптацию устьичного аппарата растений к пониженной влажности воздуха (Жуков и др., 1998). Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям.

1.4 Характеристика фитогормонов и регуляторов роста растений, применяемых при культивировании ремонтантной малины

Гормональная система - важнейший фактор регуляции и управления у растений [7-10]. Фитогормоны - ауксин (индолил-3-уксусная кислота), цитокинины (зеатин, изопентениладенин), гиббереллины, абсцизовая кислота, этилен - сравнительно низкомолекулярные органические вещества с высокой физиологической активностью, присутствующие в тканях в очень низких концентрациях (пикограммы и нанограммы на 1 г сырой массы), с помощью которых клетки, ткани и органы взаимодействуют между собой.

Как правило, фитогормоны вырабатываются в одних тканях, а действуют в других, однако в некоторых случаях они функционируют в тех же клетках, где образуются. Характерной особенностью фитогормонов, отличающей их от других физиологически активных веществ (витаминов, микроэлементов), является то, что они включают физиологические и морфогенетические программы, например такие, как корнеобразование, созревание плодов и т.д.

Исследование свойств фитогормонов легло в основу нового направления физиологии растений - культуры изолированных клеток, тканей и органов. Фитогормоны находят существенное применение в сельском хозяйстве и биотехнологии. Новейшие достижения в области изучения механизма действия фитогормонов привели к открытию рецепторов некоторых из них, хотя в этом направлении еще предстоит большая работа.

Все фитогормоны объединяют некоторые общие свойства: они синтезируются в самом растении и являются высокоэффективными регуляторами физиологических программ. Их действие проявляется в крайне низких концентрациях ввиду исключительно высокой чувствительности.

Как показали Скуг и Миллер, для деления клеток необходимы два фитогормона: ауксин и цитокинин. В их опытах было также установлено, что корнеобразование у каллуса вызывает ауксин, а дифференцировку побегов цитокинина-зеатина. Так в опытах Скуга и Миллера были разработаны основы современной культуры изолированных клеток и тканей растений и найдены пути регенерации целых растений из недифференцированных клеток каллуса.

К наиболее значимым регуляторам синтеза вторичных соединений в клеточных культурах растений относятся такие компоненты питательных сред, как гормоны и гормоноподобные соединения. В качестве ауксинов обычно используют 2,4-Д или 1-НУК. К настоящему времени становится все более очевидным, что они не являются взаимозаменяемыми соединениями. Это проявляется в различиях их действия на физиологические и биохимические процессы, происходящие в культивируемых in vitro клетках растений. (Нам И.Я.,2003)

Известны синтетические аналоги ауксинов, в частности 2,4-дихлор-феноксиуксусная кислота (2,4-Д), 2-метил-4-хлорфеноксиуксусная кислота (2М-4Х), 1-нафтилуксусная и 2-нафтоксиуксусная кислоты. Они используются чаще, чем индолилуксусная кислота в сельском хозяйстве. Дело в том, что ИУК под действием фермента ИУК-оксидаза растения непрерывно разрушается, тогда как синтетические соединения не подвержены ферментативному разрушению, и потому малые их дозы способны вызывать заметный и долго сохраняющийся эффект.

Ауксины и их синтетические заменители используются:

1. Для усиления корнеобразования у черенков (Р.Х. Турецкая). Обработка нижних концов черенков ИУК в концентрации 50 мг/л или ее синтетическими аналогами (индолилмасляной, а-нафтилуксусной кислотой) вызывает приток к ним питательных веществ, при этом процесс корнеобразования усиливается. Этот прием широко применяется при вегетативном размножении растений.

2. Для усиления корнеобразования и восстановления корневой системы при пересадке растений. Для этого саженцы окунают в пасту из глины с добавлением ИУК или ИМК.

3. Для образования партенокарпических плодов, повышения урожая томатов и некоторых других культур. Опрыскивание цветков томатов раствором синтетических регуляторов роста типа ауксина (например, трихлорфеноксиуксусной кислотой в концентрации 50 мг/л) приводит к образованию партенокарпических бессемянных плодов. Плоды растут быстрее и характеризуются более высоким содержанием Сахаров. Одновременно с усилением роста плодов в результате перераспределения питательных веществ рост вегетативных органов (пасынков) замедляется. К недостаткам этого приема следует отнести большую подверженность образующихся плодов различного рода заболеваниям.

4. Для предохранения плодов от предуборочного опадения. При большом количестве завязавшихся плодов часть их опадает до созревания. Регуляторы типа ауксина, вызывая дополнительный приток питательных веществ к плодам, препятствуют образованию отделительного слоя.

5. Для ускорения прорастания семян некоторых растений. Этот прием дает благоприятные результаты лишь на мелкосемянных растениях, поскольку крупные семена содержат достаточное количество собственных гормонов.

6. В высоких концентрациях регуляторы роста типа ауксина, например 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), могут применяться как селективные гербициды. Поскольку для разных видов растений оптимальные концентрации фитогормонов различны, то это позволяет использовать 2,4-Д в качестве селективного гербицида для борьбы с сорняками в посевах злаковых культур. Гербицидное действие основано на том, что повышенные концентрации ауксинов, искусственно создаваемые в растении, вызывают неумеренный его рост, нарушают обмен веществ, что и приводит к его гибели; при этом широколиственные растения более чувствительны к ауксинам, чем злаки.

Исследованиями (Ю.В. Ракитин, В.А. Земская) показано, что различная устойчивость растений к 2,4-Д связана с различиями в скорости ее детоксикации (обезвреживания) в растительном организме.

Сходным с ИУК воздействием на растения обладают некоторые синтетические соединения, что позволило отнести их к синтетическим аналогам ИУК. Выделяют три группы синтетических аналогов ИУК.

1. Это, прежде всего, производные индола - индолил-3-пропионовая (ИПК) и индолил-3-масляная (ИМК) кислоты. В растениях они встречаются крайне редко, но проявляют ауксинную активность и применяются для ускорения корнеобразования. Их преимуществом является более высокая устойчивость в тканях растений.

2. Очень сильной ауксинной активностью обладают некоторые хлорзамещенные феноксипроизводные: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (1,4,5-Т) и др. Эти соединения очень устойчивы к разрушению и связыванию в тканях растений, и поэтому так высока их активность.

3. Третья группа синтетических ауксинов - производные нафтилалкилкарбоновых кислот: 1-нафтилуксусная кислота (1-НУК), ее калиевая соль (КАНУ), 2-нафтоксиуксусная кислота (2-НОУК). По сравнению с ИУК эти соединения также обладают большей устойчивостью к разрушению.

Итак, ауксины были открыты в связи с изучением роста растений, однако их функции гораздо шире. Они являются участниками процессов деления, роста, дифференциации клеток. Причем особенно активно влияют на корнеобразование. Однако ауксины характеризуются неоднозначностью воздействия на растения. Так, известен их тормозящий эффект на процессы старения клеток. Именно поэтому обработка слабо развивающихся плодов 2,4-Д или 1-НУК предотвращает их преждевременное опадение и усиливает рост. Кроме того, ауксины способствуют усилению двигательной и функциональной активности у растений.

Наибольшей корнеобразовательной активностью с мягким действием в широком диапазоне концентраций обладает ИМК. Полученные в результате обработки черенков этим препаратом растения отличаются мощной корневой системой и хорошей облиственностью побегов. По сухой массе корней наибольший положительный эффект проявляется после обработки черенков в растворе 0,001%-й концентрации (в 2,6 раза выше, чем в контроле). Нафтилуксусная кислота (НУК) и амид НУК по своему действию отличаются от ИМК и ИУК. Эти соединения очень активны, в повышенных концентрациях обладают токсическим действием, вызывая торможение роста побегов, аномалии в развитии корневой системы, наплывы каллусных масс и растрескивание черенков. (http://vinograd.info/info/raznoe/primenenie-regulyatorov-rosta-v-vinogradarstve-4.html)

Глава 2. Материалы и методы исследований

Для выполнения поставленных задач проводились эксперименты по укоренению ремонтантной малины Бабье лето-2 при использовании различных концентраций и их сочетания фитогормонов и регуляторов роста растений.

2.1 Описание сорта Бабье лето-2

Ремонтантная малина сорта Бабье лето-2 - однолетняя, кустовая, селекции И.В. Казакова, полученный от скрещивания сортов Оттом Близ и Бабье лето (рис. 1). Данный сорт - это улучшенный и дополненный вариант первого сорта. Бабье лето-2 - высокоурожайный сорт малины с сочными вкусными ягодами красивой рубиновой окраски. Ягоды среднего размера (масса 3-3,5гр), широко-тупоконические, хорошо отделяются от плодоложа. Ягоды кисло-сладкие, десертные, с нежной, сочной мякотью, пригодны для потребления в свежем виде и всех видов переработки. Продуктивностью 2,0-2,5 кг с куста, или 12т/га, начало созревания ягод - в первой декаде августа, плодоношение продолжительное. Ягоды универсального значения. Отличается высокой толерантностью к основным грибковым болезням и устойчивостью к малинному клещу, почти полным созреванием урожая до наступления осенних заморозков. Куст среднерослый, слабороскидистый. Побегообразовательная способность умеренная (4-5 побегов).

Сорт Бабье лето-2 пользуется популярностью за обильное осеннее плодоношение, раннее созревание урожая и хорошее качество плодов. Рекомендуется для возделывания в центрально-чернозёмном регионе России. Эта малина способна отдавать 80-90% потенциального урожая в условиях центра европейской части России. Ягоды среднего размера (масса 3-3,5 г), начинают созревать в первой декаде августа. Урожай - 2-2,5 кг с куста, побеги крепкие и не полегают под тяжестью урожая.

Рис. 1 - Плодоношение ремонтантной малины сорта Бабье лето-2

2.2 Состав питательной среды, применяемой для культивирования ремонтантной малины in vitro

Одно из основных условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов состоит в соблюдении строгой стерильности. Тщательная стерилизация необходима, так как на искусственных питательных средах, предназначенных для культивирования растительных тканей и клеток, хорошо развиваются и микроорганизмы, что создает опасность для культивируемого материала. Стерилизуют бокс, инструменты, посуду, растительный материал, питательные среды, ватные пробки и все другие материалы, необходимые для работы.

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы, витамины, углеводы, фитогормоны. В качестве источников ауксинов в питательных средах обычно используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 1-10 мг/л, а также индолилуксусную кислоту (ИУК) - 1-30 мг/л, и -нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0,1-2 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д.

Стерильные проростки выращивают с целью получения асептических растений и получения эксплантов in vitro.

В процессе культивирования стерильные культуры могут заражаться бактериями, грибами и другими организмами. Известны способы снижения контаминации путем предварительной промывки источников эксплантов, их стерилизации различными химическими препаратами и соблюдением стерильности при операциях введения эксплантов в стерильную культуру и пересадках для субкультивирования.

Известен способ, уменьшающий эараженность культур во время длительного культивирования, заключающийся во включении в питательные среды антибиотиков, в частности тетрациклина, что снижает выживаемость отдельных микроорганизмов, случайно попавших на поверхность питательной среды во время пересадок. Известны способы, препятствующие расселению клещей в культивационных помещениях и перезаражению культур, заключающиеся в фумигации лабораторных помещений и различных видах наружного применения химических препаратов (Высоцкий,1992).

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы, витамины, углеводы, фитогормоны. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, повышающие доступность железа для клеток в широких пределах рН.

Углеводы выступают необходимым компонентом питательных сред при культивировании изолированных клеток и тканей, так как они не способны к автотрофному питанию. Обычно в качестве источника углеводов используют сахарозу или глюкозу в концентрациях 20-40 г/л.

Регуляторы роста необходимы для дифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. В качестве источников ауксинов в питательных средах обычно используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 1-10 мг/л, а также индолилуксусную кислоту (ИУК) - 1-30 мг/л, и нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0,1-2 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д.

Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар-полисахарид, получаемый из морских водорослей

При микроразмножении in vitro часто используют среды Мурасиге-Скуга, Линсмайера и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге-Скуга, которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза.

Для культивирования растений малины in vitro, а также для проведения экспериментов по укоренению пробирочных растений, применялась среда Мурасиге-Скуга (Murashige). Состав питательной среды указан в таблице № 1.

Таблица 1. Среда Мурасиге и Скуга, рН 5,6-5,8

Компоненты	Содержание, мг/л	Компоненты	Содержание, мг/л
NH4NO3	1650	Fe2SO4 7H2O	27,8
KNO3	1900	Na2-ЭДТА 2H2O	37,3
CaCl2 . 2H2O	440	Тиамин - HCl	0,1
MgSO4 . 4H2O	370	Пиридоксин - HCl	0,5
KH2PO4	170	Никотиновая кислота	0,5
MnSO4 . 4H2O	22,3	Мезо-инозит	100
CoCl2 . 6H2O	0,025	Глицерин	2,0
ZnSO4 . 7H2O	8,6	ИУК	2,0
CuSO4 . 5H2O	0,025	Кинетин	0,2
Na2MoO4 . 2H2O	0,25	Сахароза	30.000
Kl	0,83

Общая сводная таблица

Гормон	Концентрация	Длина корня	Количество корней
ИМК	0,1	3,57	2,57
ИМК	0,5	4,75	2,4
ИМК	1	3,45	4,1
ИМК	1,5	2,87	4,4
ИМК	2	1,94	5,4
НУК	0,05	2,68	4
НУК	0,2	2,32	2,65
НУК	0,6	3,26	3,26
НУК	1	2,7	3,26
НУК	1,5	1,16	2,74
2,4 D	0,005	2,35	2,29
2,4 D	0,01	1,95	1,62
2,4 D	0,08	1,48	1,95
2,4 D	0,15	1,9	1,35
2,4 D	0,2	1,72	1,55
контроль		1,56	1,65

Известно, что влияние экзогенных и эндогенных фитогормонов различно [12]. В этой связи хотелось бы подчеркнуть, что обработка фитогормонами всегда должна сопровождаться определением их эндогенного баланса. для цитокининов это особенно важно, поскольку в растения вносится синтетический аналог фитогормона. вместе с тем, как известно, действие отдельных групп фитогормонов взаимосвязано. между ними наблюдаются все типы взаимных влияний: от антагонизма до синергизма между тем исследований по влиянию экзогенных фитогормонов на их баланс недостаточно. Большинство работ проводилось на изолированных органах. При этом изучалось не содержание, а активность какого-либо одного гормона.

Это привлекает внимание ученых к исследованию их роли и механизма действия. К настоящему времени уже имеется детальная картина начальных этапов сигнализации ауксина. R. Napier (Великобритания) дал описание механизмов связывания ауксинов рецепторами TIR1 и ABP1. Ауксин-связывающий белок 1 (АВР 1) был обнаружен более 30 лет назад. Затем было установлено, что АВР 1 контролирует начальные этапы ответа клеток на ауксин, включая активацию и дезактивацию ионных каналов (К+, анионы) или транспортеров (Н+ - АТФаза).

Н.Г. Холодный заложил основы науки о фитогормонах, еще когда был известен только один гормон ауксин. Но уже тогда он говорил о многогранности ("поливалентности") действия этого фитогормона - возможности опосредовать различные эффекты в зависимости от концентрации и мишени действия, о локализации синтеза и о транспорте фитогормонов, о наличии большого разнообразия данных веществ, влияющих на различные процессы морфогенеза растений. Н.Г. Холодный впервые показал, что фитогормоны могут не только стимулировать, но и блокировать рост растений; впервые продемонстрировал морфогенетические эффекты фитогормонов и высказал идею о влиянии комплекса фитогормонов на процессы цветения. Н.Г. Холодный был убежден, что фитогормоны и их синтетические аналоги найдут широкое применение в сельскохозяйственном производстве. Последующее открытие комплекса гормонов растений и широкое применение их и их аналогов в современном растениеводстве полностью подтвердило правоту ученого.

Методы микроразмножения основаны на подавлении апикального доминирования, которое достигается либо удалением верхушечной почки, либо повышением содержания цитокининов в питательных средах.

Гормон	Концентрация	Количество растений	Vср.,мл	Vконц.
ИМК	0,1	20	40	0,8
ИМК	0,5	20	40	4
ИМК	1	20	40	8
ИМК	1,5	20	40	12
ИМК	2	20	40	12
НУК	0,05	20	40	0,4
НУК	0,2	20	40	1,6
НУК	0,6	20	40	4,8
НУК	1	20	40	8
НУК	1,5	20	40	12
2,4 D	0,005	20	40	0,1
2,4 D	0,01	20	40	0,2
2,4 D	0,08	20	40	1,6
2,4 D	0,15	20	40	3
2,4 D	0,2	20	40	4
контроль		20	40	-

Размещено на Allbest.ru

Литература

1. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.

2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.

3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.

4. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.

5. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

6. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.

7. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.

8. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.Н., Прокофьев М.И.. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., ВО Агропромиздат, 1990.

9. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. М., Наука, 1983.

10. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев, Наукова думка, 1984.

11. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М., Наука, 1988.

Размещено на Allbest.ru

...