Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пероксидное окисление липидов, антиоксидантная Система и оксид азота при послеродовых нарушениях сократительной функции матки у коров

Пасько Надежда Валериевна

На правах рукописи

03.00.04 - биохимия

Воронеж 2009

Работа выполнена в отделе клинической биохимии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН.

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Рецкий Михаил Исаакович

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Беляев Василий Иванович

кандидат биологических наук

Венцова Инна Юрьевна

Ведущая организация ФГОУ ВПО Курская государственная сельскохозяйственная академия им. И.И. Иванова

Защита состоится __ ________ 2009 года в __ часов на заседании диссертационного совета_ДМ 006.004.02 в ГНУ Всероссийский НИВИ патологии, фармакологии и терапии РАСХН (394087, г.Воронеж, ул.Ломоносова 114-б)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИВИПФиТ.

Автореферат разослан «__» __________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета канд.биол.наук Г.Н. Близнецова

Общая характеристика работы

окисление липид антиоксидантный корова

Актуальность темы. Противоречивые сведения о характере течения инволюционных процессов, этиологии, патогенезе и клиническом проявлении функциональных расстройств в половых органах после родов сдерживают разработку эффективных методов ранней диагностики, лечения и профилактики патологии послеродового периода.

Среди всех акушерских заболеваний, регистрируемых у животных в послеродовый период, одним из наиболее распространенных является субинволюция матки. В основе данного заболевания матки лежат нарушение тонуса и ослабление её сократительной функции (Нежданов А.Г., Мисайлов В.Д., 1996). На фоне субинволюции могут развиваться гнойно-катаральный и гнойный септический эндометриты, различные функциональные расстройства яичников и матки, приводящие к длительному бесплодию животных (Нежданов А.Г., 1982; Шахов А.Г. с соавт., 2006).

Согласно современным представлениям универсальными регуляторами функций любых физиологических систем организма являются процессы свободнорадикального окисления и система оксида азота (L-аргинин-NO) и существует тесная взаимосвязь между процессами свободнорадикального окисления (СРО), инициаторами которого являются активные формы кислорода (АФК), антиоксидантной системой и системой оксида азота (Зенков Н.К. с соавт., 2001).

Свободнорадикальная природа NO (Halliwell B. et al, 1997) позволяет ему, как активировать цепные свободнорадикальные реакции, так и ингибировать их (Laskin J.D. et al., 2001). При этом защитные эффекты NO связаны с его способностью увеличивать активность антиоксидантных ферментов и экспрессию кодирующих их генов (Gromadzinska J., Zachara B., 1992) и замедлять свободнорадикальное окисление липидов (Wu S. et al, 2000). Оксид азота может быть вовлечен и в механизмы повреждения наряду с процессами свободнорадикальной модификации белков и нуклеиновых кислот активными формами кислорода (Laskin J.D. et al., 2001). В зависимости от природы действующего фактора эти повреждающие эффекты возможно могут быть обусловлены либо гипо-, либо гиперпродукцией АФК, а избыточный или недостаточный синтез NO в организме является одним из факторов патогенеза различных заболеваний (Зенков Н.К. с соавт., 2001).

Дисбаланс прооксидантных и антиоксидантных процессов в организме приводит к формированию оксидативного стресса (Осипов А.Н. с соавт., 1990; Naziroglu M. et al., 2000), который является основным метаболическим синдромом, способствующим развитию многочисленных морфофункциональных нарушений в организме (Меньщикова Е.Б. с соавт., 1994).

Имеются данные о том, что оксид азота участвует в расслаблении гладких мышц матки, тормозит сокращения матки при беременности и играет роль релаксанта цервикального канала в родах (Garfield R.E. et al., 2001).

Все это позволяют предполагать важную роль процессов свободнорадикального окисления, состояния антиоксидантной системы, а также системы L-аргинин-NO в патогенезе послеродовых нарушений сократительной функции матки у коров. Выяснение этой стороны патогенетических механизмов может быть перспективно и в плане поиска и разработки фармакологических средств снижающих проявление нарушений сократительной функции матки в послеродовый период.

К сожалению работ, посвященных изучению роли процессов пероксидного окисления липидов, системы антиоксидантной защиты и интенсивности образования оксида азота в период беременности и после родов у коров, а также их связи с развитием послеродовой патологии и, в частности, с нарушением сократительной функции матки крайне мало. Это и определило общую направленность работы, выбор методологических подходов и экспериментальных моделей.

Цели и задачи. Основной целью исследования является изучение роли свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантной системы, а также оксида азота в развитии послеродовых нарушений сократительной функции матки у коров.

В соответствии с указанной целью на разрешение ставятся следующие задачи:

Изучить показатели, характеризующие интенсивность свободнорадикального окисления липидов в разные периоды до и после отела у здоровых коров и коров с субинволюцией матки.

Изучить показатели, характеризующие состояние ферментативного звена антиоксидантной системы в разные периоды до и после отела у здоровых коров и коров с субинволюцией матки.

Изучить динамику уровня стабильных метаболитов оксида азота в предродовый и послеродовый период у здоровых коров и коров с субинволюцией матки.

Выявить характер взаимосвязи динамики половых гормонов и оксида азота у коров с нормальным и патологическим течение послеродового периода.

Определить биохимические критерии риска развития у коров нарушений сократительной функции матки в послеродовый период.

Научная новизна. Впервые комплексно изучены процессы пероксидного окисления липидов, состояние антиоксидантной системы и генерации оксида азота в течение беременности и в послеродовый период у здоровых коров и животных с послеродовым нарушением сократительной функции матки. Установлено, что по мере приближения родов различия в уровне функционального состояния ферментативного звена системы антиоксидантной защиты и интенсивности течения процессов пероксидного окисления липидов между животными с нормальным и патологическим течением послеродового периода усиливаются. Впервые изучено влияние уровня генерации в организме оксида азота во время беременности и после родов на сократительную активность миометрия у клинически здоровых коров и коров с субинволюцией матки. Выявлена взаимосвязь сократительной функции матки и интенсивности образования оксида азота в организме у коров. Установленные взаимосвязи между оксидантно-антиоксидантным гомеостазом, оксидом азота, половыми гормонами и сократительной функцией матки позволяют расширить современные представления о молекулярно-биохимических механизмах развития её субинволюции у коров. Получен патент РФ №2296507 «Способ прогнозирования патологии послеродового периода у коров».

Практическая значимость. Даны биохимические критерии повышенного риска развития субинволюции матки у коров. Полученные данные можно использовать для оценки устойчивости к заболеваниям, прогнозирования возникновения патологических состояний и разработки научно обоснованных методов управления и комплексной профилактики субинволюции матки у коров.

Материалы диссертации вошли в Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике субинволюции матки у коров рассмотренные, одобренные и рекомендованные к изданию секцией «патология, фармакология и терапия» (протокол № 1 от 24.03.2005).

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях (Воронеж, 2002); «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004); «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных» (Воронеж, 2005); «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Курск, 2008) и на 1 съезде фармакологов России (Воронеж, 2007).

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 15 научных статьях, опубликованных в различных изданиях, в том числе 4 в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ и 1 патенте.

На защиту выносятся следующие положения:

1. У коров с субинволюцией матки до и после отела повышена интенсивность процессов свободнорадикального окисления липидов и имеются нарушения в ферментативном звене системы антиоксидантной защиты организма по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода.

2. Изменению синтеза оксида азота принадлежит важная роль в регуляции сократительной активности миометрия. У коров с субинволюцией матки в послеродовой период интенсивность образования оксида выше, чем у коров с нормальным течением послеродового периода.

3. Оксиду азота принадлежит важная роль регуляции сократительной функции матки у коров. У коров с нормальным течением послеродового периода инволюция матки происходит на фоне снижения образования оксида азота, а отсутствие такой закономерности является одной из причин развития послеродовой субинволюцией матки.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Список использованной литературы содержит 255 источников, из них 138 отечественных и 117 иностранных. Иллюстративный материал включает 17 рисунков и 7 таблиц.

Объекты и методы исследования

Исследования выполнены в 2001-2008 г.г. в отделе клинической биохимии в соответствии с планом научно-исследовательских работ Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии по заданиям 04.01.03. «Изучение этиологии и патогенеза субклинического мастита у супоросных свиноматок и сухостойных коров, субинволюции матки у коров и разработка методов их диагностики, терапии и профилактики» (№ гос. регистрации 01.200.117018) и 08.04.02. «Разработать новые экспресс-тесты и терапевтические препараты для эффективной системы мероприятий по диагностике, профилактике и терапии болезней органов размножения и молочной железы у коров и свиней, обеспечивающей снижение бесплодия маточного поголовья, получение жизнеспособного приплода и производство продукции высокого санитарного качества (№ гос. регистрации 15070.3666026906.06.8.002.3).

Опыты проведены в зимне-стойловый период (октябрь-апрель) на 120 коровах в возрасте 2-8 лет, средней упитанности, массой тела 500-700 кг в ОАО “Воронежпищепродукт” Новоусманского района Воронежской области. Кормление коров проводилось по общепринятым в хозяйстве рационам. В соответствии с анамнестическими данными коровы были распределены на следующие группы: клинически здоровые, с острой и хронической субинволюцией матки. Учитывали общее клиническое состояние, характер течения родов, послеродовых инволюционных процессов в половых органах и сроки их завершения. Субинволюция матки подтверждалась клиническими и лабораторными исследованиями. Исследования крови у подопытных животных проводили в разные периоды до и после отела в зависимости от задач опыта.

Работа была выполнена совместно с д-ром. вет. наук В.И. Михалевым, канд. биол. наук Г.Н. Близнецовой, в связи с чем, автор выражает им свою благодарность.

Для изучении in vitro влияния состояния системы L-аргинин-NO на сократительную активность миометрия опыты проведены на беременных белых крысах с массой тела 200-250 г на 20-й день беременности (n=5) и сразу после родов (n=5). Рога матки иссекали и тщательно очищали от окружающей соединительной ткани. У беременных крыс после удаления плодов миометрий рассекали на продольные полоски размером приблизительно 511 мм и помещали в специальную ванночку объемом 10 мл, заполненную раствором, содержащим (в мМ/л): хлорид натрия 125, хлорид калия 2,4, хлорид кальция 1,8, хлорид магния 0,5, бикарбонат натрия 23,9 и глюкозу 11,0. Температура раствора 37°C, pH = 7,4. Регистрирацию сокращения в изометрическом режиме проводили через 30 минут после прикрепления к кусочкам миометрия груза в 1 г с использованием специального тензометрического датчика Grass FT 03 на полиграфе Grass 79E фирмы Grass, Quincy, Mass. (США). Регистрирующее устройство было откалибровано так, чтобы напряженность мышцы соответствующая силе в 1 г соответствовало вертикальному смещению пера самописца на 1 см. Анализировали 10-минутные периоды до и после добавления следующих вещест: L-аргинин, метиловый эфир нитро-L-аргинина (L-NAME) и карбохолин фирмы Sigma (США), которые растворяли в 0,9 % NaCl и добавляли в ванночки с инкубационной средой в объеме 50 мкл.

Для оценки интенсивности процессов пероксидного окисления липидов, состояния ферментативного звена системы антиоксидантной защиты и интенсивности синтеза оксида азота у коров определяли: содержание в крови коньюгированных диенов и кетодиенов (ед.оп.пл/мл), малонового диальдегида (мкМ/л), в сыворотке крови - содержание флуоресцирующих оснований Шиффа (усл. ед./мл), в крови - активность каталазы, глутатионпероксидазы с использованием в качестве субстрата перекиси водорода и глутатионредуктазы (Бузлама В.С. с соавт., 1997), супероксиддисмутазы (сирота т.в., 1999); показатели биохемилюминесценции плазмы крови (Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989); содержание стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови (Близнецова Г.Н. с соавт., 2002). Определение оптической плотности растворов проводили на спектроколориметре «Spekol 210» (Германия) или спектрофотометре СФ-16 (Россия), параметры биохемилюминесценции - на биохемилюминометре БХЛ-06.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием прикладной программы «Statistica 5.0». Достоверность отличий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

Результаты собственных исследований. Динамика показателей свободнорадикального окисления липидов и состояния антиоксидантной системы в крови клинически здоровых коров в последний месяц беременности и ранний послеродовый период

Установлено, что в предродовый и в послеродовый периоды у коров происходят заметные изменения содержания в крови первичных, промежуточных (вторичных) и конечных продуктов ПОЛ.

За 25-30 дней до отела концентрация диеновых конъюгатов (ДК) в крови глубокостельных коров составила 0,49±0,011 ед.оп.пл/мл крови.

В дальнейшем за 15-20 и 2-3 дня до отела концентрация ДК повышается по сравнению с исходным уровнем на 8,0 и 18,0% соответственно. Наивысшей концентрации в крови ДК достигают в ранний послеродовый период. На 2-3 день после отела их уровень превосходит исходный (за 25-30 дней до отела) на 38,0%. на 5-10 и 15-20 сутки послеродового периода происходит снижение уровня ДК и их концентрация в крови животных ниже, чем на 2-3день после родов на 10 и 19% соответственно.

Изменение содержания в крови коров кетодиенов (КД) полностью соответствует динамике диеновых конъюгатов.

За 25-30 дней до отела уровень малонового диальдегида (вторичного продукта ПОЛ) у коров составлял 0,92±0,019 мкМ/л крови. За 15-20 дней до родов его уровень достоверно возрастает на 15%, по сравнению с исходным уровнем. За 2-3 дня до отела концентрация МДА в крови еще более возрастает. В ранний послеродовый период (2-3 дни после отела) в крови животных достоверно наиболее существенно (на 48%) увеличивается уровень МДА, по сравнению с его уровнем в крови за 1 месяц до отела. Начиная с 5-10 дня после отела, уровень МДА начинает постепенно снижается и к 15-20 суткам послеродового периода составляет 113,3% от исходного за месяц до родов.

Динамика содержания в крови флуоресцирующих оснований Шиффа также свидетельствует о тенденции к повышению их концентрации по мере приближения и сразу после родов с последующим снижением до исходного уровня за 1 месяц до отела.

Таким образом, у клинически здоровых коров завершающий период беременности и ранний послеродовый период протекают на фоне интенсификации процессов свободнорадикального окисления липидов, которая наиболее выражена за 2-3 дня до и 2-3 дня после отела. К 20-му дню после родов уровень всех типов продуктов ПОЛ заметно снижается и статистически достоверно не отличается от их уровня за 25-30 дней до отела.

Изменение интенсивности протекания процессов ПОЛ у коров в предродовый и послеродовый периоды тесно связано с функционированием системы антиоксидантной защиты, состояние ферментативного звена которой изменяется в зависимости от физиологического состояния животных.

По мере приближения родов (за 15-20 дней до отела) активность каталазы в крови возрастает, а за 2-3 дня до родов становится выше исходного уровня на 21,0 и 24,5% соответственно (рис.1).

В раннем послеродовом периоде (2-3 дни после отела) происходит достаточно резкое снижение активности каталазы по сравнению с её активностью за несколько дней до родов, а к 15-20 дню послеродового периода происходит некоторое повышение активности каталазы по сравнению со 2-3 днем послеродового периода. Также при приближении родов наблюдается тенденция к повышению активности ГПО относительно исходного уровня на 7,8% и 14% соответственно (рис.2).

Рис. 1. Динамика активности каталазы (мМ Н2О2/лЧмин) в крови клинически здоровых коров в предродовый и послеродовый период.

Рис. 2. Динамика активности глутатионпероксидазы (мМ G-SH/лЧмин) в крови клинически здоровых коров в предродовый и послеродовый период.

На 2-3-и сутки послеродового периода происходит резкое увеличение активности ГПО на 25,2% по сравнению со 2-3 днем до родов. К 15-20 суткам послеродового периода активность ГПО несколько снижается по сравнению с ранним послеродовым периодом, но все еще остается на достаточно высоком уровне.

Рис. 3. Динамика активности глутатионредуктазы (мкМ окисленного глутатиона/ лЧмин) в крови клинически здоровых коров в различные периоды до и после отела.

За 15-20 дней до отела отмечена тенденция к повышению активности глутатионредуктазы в крови, а за 2-3 дня её активность еще более возрастает (рис.3). В ранний послеродовый период активность глутатионредуктазы в крови снижается до 174,0±13,2 но уже к 15-20 суткам послеродового периода активность фермента практически восстанавливается до уровня, определенного за месяц до отела.

Свободнорадикальное окисление липидов и состояние антиоксидантной системы у коров с субинволюцией матки

За 1-1,5 месяца до отела у коров с последующим развитием после отела субинволюции матки, по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода, установлена пониженная мощность ферментативного звена системы антиоксидантной защиты (табл.1).

Таблица 1. Активность ферментов системы антиоксидантной защиты в крови у здоровых и заболевших коров в разные периоды до и после отела

Группа животных	Периоды исследования
	За 1-1,5 месяца до отела	За 10-14 дней до отела	Через 1-2 суток после отела	Через 15 суток после отела
Супероксиддисмутаза, усл. ед. акт./мг Hb
Здоровые	6,70,71	7,20,88	5,60,74	6,80,65
Заболевшие	5,30,39	5,60,62	2,00,36*	2,90,42*
Глутатионпероксидаза, мМ восстановленного глутатиона/лЧмин
Здоровые	20,42,22	21,22,34	29,32,32	24,22,11
Заболевшие	13,61,98	14,12,17	18,12,18*	16,21,59*
Глутатионредуктаза, мкМ окисленного глутатиона/лЧмин
Здоровые	217,717,4	256,418,6	200,421,6	275,231,4
Заболевшие	130,614,9*	158,015,9*	120,617,8*	178,620,4*

Примечания: * - P < 0,05-0,001

Об этом свидетельствует более низкая активность в крови у заболевших после отела коров глутатионредуктазы (на 40%), фермента поддерживающего общий пул восстановленного глутатиона в организме. Помимо этого у коров снижена активность СОД на 20,8 % , ГПО на 33,3 % и каталазы на 6,5%, что в целом свидетельствует о более низком уровне функционального состояния ферментативного звена антиоксидантной системы у коров, предрасположенных к субинволюции матки.

Различия в активности ферментативного звена системы антиоксидантной защиты сохраняются и после родов. В этот период активность СОД у них ниже более чем в 2 раза, каталазы - на 27,6 %, глутатионпероксидазы - на 38,2% и глутатионредуктазы - на 39,8 % (табл.1). Это не позволяет адекватно контролировать и удерживать в физиологических пределах чрезмерную активацию процессов ПОЛ и накопление в организме его токсических продуктов. Поэтому уровень конъюгированных диенов повышен на 25,9 %, малонового диальдегида - на 40,0 %, а содержание в сыворотке крови флуоресцирующих оснований Шиффа - на 38,5 % (табл.2).

Таблица 2. Содержание продуктов ПОЛ в крови у здоровых и заболевших коров в разные периоды до и после отела

Группа животных	Периоды исследования
	В начале сухостойного периода	За 10-14 дней до отела	Через 1-2 суток после отела	Через 15 суток после отела
Конъюгированные диены
Здоровые	0,1080,018	0,1240,016	0,1440,025	0,1380,014
Заболевшие	0,1360,021	0,1560,034	0,2660,035*	0,2650,029*
Малоновый диальдегид
Здоровые	0,450,051	0,560,051	0,980,055	0,550,048
Заболевшие	0,630,056*	0,880,064*	2,290,109*	1,320,102*
Основания Шиффа
Здоровые	0,130,010	0,160,012	0,270,029	0,180,011
Заболевшие	0,180,014*	0,240,019*	0,790,062*	0,720,059*

Примечания: *- P < 0,05-0,001 по сравнению со здоровыми

Таким образом, у коров с субинволюцией матки имеется существенный дисбаланс в системе ПОЛ-АОЗ. В этом может заключаться одна из причин метаболических нарушений в организме коров в ранний послеродовый период, на фоне чего возрастает риск развития субинволюции матки.

Хемилюминесцентный анализ плазмы крови коров в пред- и послеродовый период

По характеру параметров хемилюминесценции (ХЛ) плазмы крови между оксидантно-антиоксидантными процессами у коров за 30 суток до отела существует определенный баланс.

По мере приближения к родам показатели интенсивности ХЛ увеличиваются и достигают своего максимума непосредственно перед родами, что свидетельствует о повышении интенсивности процессов свободнорадикального окисления и развитии дисбаланса в системе СРО-АОЗ (табл.3).

Однако к 10-му дню после родов дисбаланс между образованием и утилизацией свободных радикалов смещается в сторону нарастания мощности системы антирадикальной защиты. В дальнейшем (на 30-е сутки после отела) изменения интенсивности процессов пероксидации за счет активизации системы АОЗ приводят к нормализации течения СРО и переходу этих процессов на более низкий стационарный уровень, обеспечивающий нормальное течение метаболических процессов в организме.

Таблица 3. Интенсивность хемилюминесценции плазмы крови клинически здоровых и с субинволюцией матки коров

Показатели ХЛ	Период исследования
	До отела, сутки	После отела, сутки
	30	7-10	1-3	1-3	7-10	30
Imax, mV	9,2±0,4 9,8±0,5	11,5±0,8 12,5±0,8	18,9±0,9 19,5±0,9	21,1±1,1 23,5±1,6	15,7±0,7 18,3±1,2	10,8±0,5 11,7±0,8
S, mVсек	20,2±1,3 23,2±1,5	25,7±1,8 26,7±1,4	32,2±2,1 33,1±2,0	34,6±2,0 36,6±2,1	26,8±2,2 29,8±1,7	21,3±1,2 24,2±1,5
tg1,mVсек	2,0±0,10 2,0±0,12	2,1±0,10 2,8±0,17*	2,5±0,15 3,1±0,10*	2,9±0,21 3,4±0,19	2,4±0,17 3,2±0,17*	2,1±0,12 3,1±0,24*
tg2,mVсек	-2,2±0,12 -2,1±0,15	-1,9±0,20 -1,7±0,09	-1,4±0,08 -1,3±0,07	-1,2±0,08 -0,8±0,07*	-1,8±0,12 -1,2±0,11*	-2,1±0,12 -1,8±0,12
К1 (Imax/S)	0,46±0,04 0,42±0,01	0,45±0,03 0,47±0,04	0,59±0,06 0,59±0,06	0,61±0,06 0,64±0,06	0,59±0,06 0,61±0,03	0,48±0,03 0,48±0,01
К2 (tg2/S)	0,11±0,013 0,09±0,012	0,07±0,003 0,06±0,006	0,04±0,003 0,04±0,001	0,03±0,001 0,02±0,001	0,07±0,004 0,04±0,002*	0,10±0,004 0,07±0,003*

Примечание: числитель - здоровые, знаменатель- субинволюция матки.

* - P< 0,05 по сравнению со здоровыми

Иная картина наблюдалась у коров, после отела, у которых развилась субинволюция матки. За 30 суток до отела у них установлена пониженная мощность системы антиоксидантной защиты и более интенсивное течение свободнорадикальных процессов, о чем свидетельствуют показатели светосуммы (S) и величины максимальной вспышки (Imax) хемилюминесценции. Эта тенденция сохраняется на протяжении всего предродового периода.

В первые сутки после отела отмечается наиболее высокая интенсивность свободнорадикальных процессов, что характеризует в определенной мере функциональную недостаточность неферментативного звена АОС крови. Об этом же свидетельствует низкая антиокислительная активность плазмы крови в тот же период, оцениваемая по тангенсу угла наклона кинетической кривой (tg 2), который на 33,4% больше по сравнению с таковым у оставшихся здоровыми коров.

Следствием сниженного функционального состояния систем, контролирующих на разных стадиях интенсивность течения процессов свободнорадикального окисления, являются и более высокие показатели S и Imax у заболевших коров, по сравнению со здоровыми: через 1-3 суток - на 5,0% и 10,2%, через 7-10 суток - на 10,1% и 14,2%, через 30 суток - на 7,9% и 7,7% соответственно.

О сбалансированности оксидантно-антиоксидантных процессов можно судить по значению коэффициента К1, рассчитанного как отношение Imax/S и отражающего степень интенсивности процессов пероксидации (рис.4).



Рис.4. Динамика сбалансированности оксидантно-антиоксидантных процессов у здоровых коров и коров с субинволюцией матки в предродовый и послеродовый периоды

Согласно полученным данным у коров с нормальным течением послеродового периода за 1-3 суток до отела значение данного коэффициента возрастало на 28,3%, а на 1-3 сутки после отела - 32,6%, одновременно со снижением АОА(-tg 2) крови в эти же сроки. У коров с субинволюцией матки характер изменения коэффициента К1 был такой же, но дисбаланс в системе СРО-АОЗ был более выражен. У них за 1-3 суток до отела коэффициента К1 возрастал на 40,5%, а через 1-3 суток после отела коэф-

фициент К1 был выше, чем за 30 дней до родов на 52,4 %. Для оценки сбалансированности оксидантно-антиоксидантного статуса и своевременного обнаружения явления "оксидативного стресса" у крупного рогатого скота предложено также использовать отношение показателя АОА крови к интенсивности пероксидации в качестве коэффициента сбалансированности К2 (-tg2/S), но в отличие от коэффициента К1, он отражает вклад внеклеточных антиоксидантов в становление антирадикального гомеостаза организма (Степанова И.П., 2004).

Значение коэффициента сбалансированности К2 у коров за 1-3 суток до отела и на 1-3 сутки после отела по сравнению с его значением за 30 суток до родов снижается в 2,75 и в 3,78 раза соответственно. Это снижение указывает на состояние "окислительного стресса" в этот период у коров.

У животных с послеродовой субинволюцией матки снижение коэффициента сбалансированности К2 было более существенно (в 4,5 раза). При этом и за месяц до и после родов у таких животных система СРО-АОЗ менее сбалансирована, о чем свидетельствовал более низкий (на 22,2 и 30,0% соответственно) коэффициент сбалансированности К2 у них, по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода.

Таким образом, хемилюминесцентный анализ СРО в плазме крови у коров в поздний предродовый и ранний послеродовый периоды свидетельствует об интенсификации окислительных реакций, протекающих по свободнорадикальному механизму. Снижение интенсивности реакций подобного класса, начиная с 7-10-х суток у оставшихся здоровыми коров после родов, обусловлено включением адаптационно-компенсаторных механизмов, направленных на подавление избыточного процесса окислительной деструкции биополимеров.

У коров с послеродовой субинволюцией матки дисбаланс в системе СРО-АОЗ на фоне имеющейся у них недостаточной мощности антиоксидантной системы создает предпосылки неадекватного восстановления оксидантно-антиоксидантного статуса коров в критические периоды (непосредственно до и после родов), возникновению у них явления "окислительного стресса" и на его фоне развитию острой субинволюции матки. Это является основанием рассматривать необходимость применения антиоксидантов животным в последний месяц беременности и ранний послеродовый период в условиях риска развития послеродовой субинволюции матки как важный фактор профилактики этой патологии.

Динамика содержания стабильных метаболитов оксида азота у клинически здоровых и коров с субинволюцией матки

Установлено, что за 1,5-1 месяц до родов уровень стабильных метаболитов оксида азота у коров не заболевших субинволюцией матки, составил 39,0±4,77 мкМ/л (табл. 4).

Таблица 4. Содержание стабильных метаболитов оксида азота (NOх ) в сыворотке крови у здоровых коров и коров с острым и хроническим течением субинволюции матки, мкМ/л

Периоды исследования	Здоровые	Субинволюция
		острая	хроническая
До родов
За 45-30 суток	39,0 ± 4,77	42,0 ± 1,92	40,5 ± 1,53
За 14-7 суток	77,4 ± 7,56*	66,6 ± 5,43*	75,3 ± 1,32*
За 3-1 суток	152,7 ± 7,08*	145,5± 4,77*	147,2±4,98*
После родов
Через 1 сутки	94,8 ± 7,2*	140,7 ± 3,9*	105,9 ± 4,53*
Через 2 суток	53,4 ± 12,6	132,3± 3,78*	90,6 ± 8,55*
Через 3-5 суток	51,9 ± 2,85	117,8±4,26*	88,2 ± 4,95*
Через 30 суток	47,1 ± 4,14	66,0 ± 8,04*	77,1 ± 2,37*

*- Р ? 0,05-0,001 по сравнению с периодом за 45-30 суток до родов

К концу последнего триместра беременности и приближения родов суммарный уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови коров постепенно возрастает и за 1-3 сутки до родов превышает уровень NO за 1,5-1 месяцев почти в 4 раза. Через 1 сутки после отела уровень метаболитов оксида азота у здоровых коров составляет 94,8±7,2 мкМ/л, а уже на 2-е сутки после отела суммарное содержание NOх снижается до 53,4±12,6 мкМ/л. Далее происходит еще большее снижение их уровня до величин, установленных за 2-4 недели до родов, что, вероятно, является одним из факторов способствующих сокращению матки после родов и развитию инволюционных процессов. Возможно, что именно эти механизмы лежат в основе послеродовый инволюции матки.

интенсивность продукции оксида азота у коров с нарушением сократительной функции матки в период клинического проявления этой патологии существенно отличается как от оставшихся здоровыми животных, так и в зависимости от характера её проявления (см. табл. 4). Уровень NOx в крови коров с острым течением субинволюции матки на следующий день после родов превышает таковой у коров с нормальным течением инволюционных процессов на 48,4%, через 2 суток - в 2,5 раза, через 3 суток - в 2,3 раза и через 1 месяц на 40% соответственно.

До родов у животных с разным характером течения субинволюции матки уровень NOх существенно не различается. Через сутки после родов у животных с острой субинволюцией уровень стабильных метаболитов оксида азота превышает уровень у коров с хронической субинволюцией на 24,0%. Далее у коров всех групп характер динамики уровня NOx в сыворотке крови является аналогичным.

На 30-е сутки после отела содержание NOх у коров с острой формой субинволюции (к этому времени состояние матки у них нормализуется) становится таким же, как и у здоровых животных, а у коров с хронической субинволюцией матки уровень NOх в крови почти в 1,5 раза превышает их уровень у здоровых коров и на 16,8% - уровень у коров, у которых регистрировалась острая субинволюция матки, что может быть одной из предрасполагающих причин развития хронического нарушения сократительной функции матки у коров после отела.

Взаимосвязь сократительной функции матки и уровня стабильных метаболитов оксида азота в крови у коров

Рис.5. Взаимосвязь сократительной функции матки) с уровнем стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови здоровых коров и коров с субинволюцией матки

При детальном изучении динамики содержания в сыворотке крови стабильных метаболитов оксида азота и сократительной функции матки у коров во время и в течение суток после родов в норме установлена достаточно четкая взаимосвязь между интегральным показателем сократительной функции матки (контракционным индексом - КИ) и интенсивностью генерации оксида азота (рис. 5).

У коров с нормальным течением послеродового периода закономерное снижение КИ происходит на фоне снижения уровня стабильных метаболитов оксида азота, который отражает его синтез в организме коров (r=+0,92, Р<0,001), а у коров с послеродовой субинволюцией матки такая закономерность отсутствует (r= +0,12, Р>0,1).

Сократительная функция миометрия при модуляции синтеза оксида азота

Цель этой серии опытов состояла в изучении in vitro влияния состояния системы L-аргинин-NO на сократительную активность миометрия в середине беременности и в период родов.

Установлено, что спонтанная сократительная активность гладкой мускулатуры матки при добавлении в инкубационную среду (в концентрациях 10-6-10-4 М) L-аргинина уменьшалась, а при добавлении L-NAME увеличивалась (рис. 6). При этом для миометрия, взятого на 20-й день беременности (рис.6.1) статистически достоверное снижение L-аргинином и повышение L-NAME амплитуды и частоты спонтанных сокращений происходило при концентрации 10-5 м (P<0,05), а для миометрия, взятого в период родоразрешения чтобы достигнуть подобных статистически достоверных (P<0,05) изменений требовались более высокие концентрации (10-4 m) L-аргинина и L-NAME (рис. 6.2).

(1)(2)

Рис. 6. Влияние L-аргинина (A) и L-NAME (Б) на спонтанную сократительную активность миометрия крысы на 20-й день беременности (1) и в период родов (2)

Таким образом, из результатов проведенного исследования следует, что система генерации оксида азота L-аргинина-NO присутствует в матке и реактивность миометрия является более высокой в середине беременности и уменьшается в период родоразрешении. Это заключение базируются на том, что тормозящее действие L-аргинина (субстрата NO-синтаз), значительно изменяется в зависимости от концентрации (от 10-5 м до 10-4 М) на миометрий в период родоразрешения, по сравнению с миометрием, изолированном в середине беременности.

Карбохолин в концентрации 10-6 м вызывал контракцию миометрия изолированного как на 20-й день беременности, так и в период родоразрешения. амплитуда сокращений миометрия, изолированного на 20-й день беременности, вызванных карбохолином статистически достоверно уменьшалась в ответ на добавление L-аргинина и увеличивалась в ответ на добавление в среду L-NAME уже в концентрации 10-5 м и еще значительнее - в концентрации 10-4 м (рис. 7.1), а миометрия, изолированного в период родоразрешения только в концентрации 10-4 м (рис. 7.2.). При этом как L-аргинин, так и L-NAME существенно не изменяли частоту сокращений (P> 0,05).

(1)(2)

Рис. 7. Влияние L-аргинина (A) и L-NAME (Б) на сократительную активность миометрия, изолированного в середине беременности (1) и в период родов (2), на фоне действия карбохолина. Карбохолин добавляли в среду за 10 минут перед добавлением L-аргинина и L-NAME.

Таким образом, система L-аргинин-NO участвует и в спонтанной и в стимулируемой сократительной активности миометрия. При этом активация этой системы расслабляет гладкую мускулатуру миометрия, а ингибирование - повышает сократитетельную активность миометрия. Причем реакция на L-аргинин и L-NAME увеличена в середине беременности и уменьшена в период родов. Это указывает на то, что система L-аргинин-NO играет роль в поддержании низкой сократительной активности матки в течение беременности, а также в инициировании и обеспечении родов. Увеличение активности NO-синтазы и образования NO в системе L-аргинин-NO при беременности, вероятно, связано с действием половых гормонов, в частности, эстрогенов (Buhimschi I. et al. 1995).

Половые гормоны и оксид азота у коров в период беременности и после отёла

Установлено, что концентрация прогестерона в крови коров, заболевших субинволюцией матки, за 30 дней до отёла выше в 1,47 раза в сравнении с животными, у которых послеродовый период протекал без осложнений, а содержание эстрадиола-17 у них, наоборот, ниже в 1,84 раза. Соотношение прогестерон/эстрадиол у коров, заболевших после родов субинволюцией матки, выше чем у здоровых в 2,58 раза. При этом не установлено существенных различий между животными этих двух групп в интенсивности синтеза оксида азота, которая находилась на относительно низком уровне.

За 1-3 суток до отела содержание прогестерона у коров, заболевших субинволюцией матки, снижается на 12,4%, а у животных, оставшихся клинически здоровыми - на 35,5%. Концентрация эстрадиола-17 в это же время у животных, у которых после родов зарегистрирована субинволюция матки, была в 2,65 раза ниже, чем у коров, у которых послеродовый период протекал без осложнений и соответственно прогестерон-эстрадиоловое отношение - выше в 3,27 раза.

Через 1-3 суток после отёла в крови коров, заболевших субинволюцией матки, содержание прогестерона выше в 2,29 раза, чем у животных с физиологическим течением послеродового периода, концентрация эстрадиола-17 - ниже в 1,97 раза, а прогестерон-эстрадиоловое отношение у этих животных выше в 4,65 раза. В этот период установлены и существенные различия в образовании оксида азота в организме коров.

Рис.8. Сравнительная динамика прогестерон-эстрадиолового отношения и уровня оксида азота у здоровых и заболевших субинволюцией матки коров

У животных с субинволюцией матки уровень его стабильных метаболитов был в 2,48 раза выше, чем у оставшихся здоровыми коров (рис. 8). При этом различия в интенсивности синтеза оксида азота до отела у здоровых и заболевших коров отсутствуют. И только через 1-3 суток после родов на фоне существенно более высокого (в 4,65 раза) соотношения прогестерон/эстрадиол-17 у коров, заболевших субинволюцией матки, интенсивность синтеза оксида азота существенно превышает его образование у здоровых животных.

Таким образом, у коров с субинволюцией матки за месяц до и 1-3 дня до отёла имеется высокое содержание в крови прогестерона и низкое-эстрадиола-17. Прогестерон-эстрадиоловое отношение у них выше, чем у оставшихся здоровыми животных соответственно в 2,58 и 3,27 раза, но существенные различия в интенсивности синтеза оксида азота в организме в эти сроки отсутствуют. И только через 1-3 суток после родов на фоне более высокого соотношения прогестерон/эстрадиол-17 (в 4,65 раза) у коров, заболевших субинволюцией матки, интенсивность синтеза оксида азота существенно превышает его образование в организме у здоровых животных.

Выводы

1. У клинически здоровых коров заключительный этап беременности и ранний послеродовый период протекают на фоне интенсификации процессов свободнорадикального окисления липидов. Это наиболее выражено за 2-3 дня до и 2-3 дня после тела. В эти сроки концентрация малонового диальдегида в крови коров соответственно выше по сравнению с исходными показателями за 25-30 дней до отела на 26% и 48%, диеновых конъюгатов - на 18% и 38%, оснований Шиффа на - 11% и 28%. К 20-му дню после отела уровень начальных, промежуточных и конечных продуктов ПОЛ заметно снижается и статистически достоверно не отличается от их уровня за 25-30 дней до отела.

2. У коров с субинволюцией матки, развившейся после отела, уже за 1-1,5 месяца до отела уровень конъюгированных диенов повышен на 25,9 %, малонового диальдегида - на 40,0 %, а содержание в сыворотке крови флуоресцирующих оснований Шиффа - на 38,5 %, по сравнению с животными оставшимися здоровыми. На 2-3 день после отела у заболевших после родов коров, уровень конъюгированных диенов возрастает на 70,5 %, малонового диальдегида - в 2,6 раза, а оснований Шиффа - в 3,3 раза по сравнению с исходными данными.

3. У клинически здоровых коров интенсификация процессов пероксидного окисления липидов в указанные сроки сопровождается повышением функциональной активности ферментативного звена системы антиоксидантной защиты, направленного на ограничение чрезмерной интенсификации ПОЛ и поддержание их на более низком стационарном уровне, обеспечивающим оптимальное течение метаболических процессов в организме.

4. В сухостойный период у коров с последующим развитием субинволюции матки, по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода, мощность ферментативного звена системы антиоксидантной защиты снижена. Активность глутатионредуктазы в крови у заболевших после отела коров ниже на 40%, СОД - на 20,8 % , ГПО - на 33,3 % и каталазы - на 6,5%. На 2_й день после отела активность СОД у таких коров ниже, чем у оставшихся здоровыми более чем в 2 раза, каталазы - на 27,6 %, глутатионпероксидазы - на 38,2% и глутатионредуктазы - на 39,8 %.

5. У коров с субинволюцией матки в ранний послеродовой периоды более существенно выражен дисбаланс в системе ПОЛ-АОЗ. Если у коров с нормальным течением послеродового периода коэффициент сбалансированности в системе ПОЛ-АОЗ (К2), как отношение АОА плазмы крови (-tg2) к светосумме хемилюминисценции (S), отражающий вклад внеклеточных антиоксидантов в становление антирадикального гомеостаза организма, на 1-3 сутки после отела снижается в 3,78 раза по сравнению с периодом за 30 дней до отела, то у коров с послеродовой субинволюцией матки - в 4,5 раза. У таких животных и за месяц до родов коэффициент сбалансированности К2 также на 22,2% ниже по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода.

6. Изменению синтеза оксида азота принадлежит важная роль в регуляции сократительной активности миометрия. Система генерации оксида азота L-аргинин-NO участвует в обеспечении низкой сократительной активности матки в течение беременности, а также в инициировании и обеспечении родового акта. Активация этой системы расслабляет гладкую мускулатуру миометрия, а ингибирование - повышает сократительную активность миометрия.

7. В крови коров с нормальным течением послеродового периода по мере приближения к родам суммарный уровень стабильных метаболитов оксида азота (NOx) существенно возрастает и за 1-3 суток до родов превышает уровень NOx за 1,5-1 месяцев до родов почти в 4 раза. В первые сутки после родов их уровень снижается в 1,6 раза и к 3-5 суткам после родов статистически достоверно не отличается от величин, установленных за 1-1,5 месяца до отела. Это способствует сокращению матки и развитию инволюционных процессов после родов.

8. До отела интенсивность образования оксида азота у коров с субинволюцией матки в послеродовый период существенно не различается от животных с нормальным течением послеродового периода, однако у таких животных в течение первых 5 суток после родов уровень стабильных метаболитов оксида азота в крови примерно в 1,5 раза выше, чем у коров с нормальным течением послеродового периода.

9. Сумма стабильных метаболитов оксида азота в крови коров с острой формой течения субинволюции матки на следующий день после родов превышает таковой у коров с нормальным течением инволюционных процессов в 1,48 раза, через 2 суток - в 2,5 раза, через 3 суток - в 2,3 раза и через 1 месяц - в 1,4 раза.

10. У коров с нормальным течением послеродового периода снижение контрактационного индекса, как интегрального показателя сократительной функции матки происходит на фоне снижения образования оксида азота (r=+0,92, P<0,001), а у коров с послеродовой субинволюцией матки такая закономерность отсутствует (r=+0,12, P>0,1).

11. У коров с патологическим течением послеродового периода через 1-3 дня после отела, повышенный в 2,3 раза уровень прогестерона и сниженное в 4,65 соотношение прогестерон/эстрадиол-17, по сравнению со здоровыми животными, коррелирует с более высоким в 2,5 раза содержанием в крови коров суммы стабильных метаболитов оксида азота.

Практические предложения

1. В качестве биохимических критериев повышенного риска развития у коров послеродовой субинволюции матки предлагается использовать следующие показатели: содержание в крови коров за месяц до отела малонового диальдегида выше 0,80 мкМ/л, оснований Шиффа - более 0,20 отн. ед./мл сыворотки, активность в крови глутатионпероксидазы - ниже 14,0 мМ восстановленного глутатиона/лЧ мин, глутатионредуктазы - ниже 145,0 мкМ окисленного глутатиона/лЧмин, содержание стабильных метаболитов в сыворотке крови коров выше 140,0 мкМ/л через 2-е суток после отела.

2. При диагностике, терапии и профилактике субинволюции матки у коров руководствоваться Методическими рекомендациями по диагностике, терапии и профилактике субинволюции матки.- Воронеж, 2005.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Близнецова Г.Н. Спектрофотометрический метод определения метаболитов оксида азота / Г.Н. Близнецова, Н.В. Ермакова, З.Д. Мухаммед, М.И. Рецкий// Вестник ВГУ. Проблемы химии и биологии.- 2002.- №1.- С.56-60.

2. Самохин В.Т. Применение витаминно-минерального премикса для профилактики субинволюции матки у коров / В.Т. Самохин, В.И. Шушлебин, В.Н. Коцарев, В.И. Михалев, А.А. Сотников, Н.В. Ермакова, М.Н.Кочура// Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Материалы международной научно-практической конференции.- 2002.- С.534-535.

3. Рецкий М.И. Динамика стабильных метаболитов оксида азота у коров с субинволюцией матки / М.И. Рецкий, Н.В. Ермакова, Г.Н. Близнецова и др. // Ветеринарная патология.-2003.-№ 2.-С.89-90.

4. Рецкий М.И. Возрастная динамика образования оксида азота в организме крупного рогатого скота / М.И. Рецкий, А.Г. Шахов, Г.Н. Близнецова, С.С. Артемьева, Н.Н. Каверин, Н.В. Ермакова, Н.А. Косматых// Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.- 2004.- №4.- С.58-60.

5. Пасько Н.В. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов у коров с субинволюцией матки / Н.В. Пасько // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных. Материалы международной научно-практической конференции.- Воронеж: Воронежский государственный университет.- 2004.- С. 127-130.

6. Мисайлов В.Д. Субинволюция матки у коров / В.Д. Мисайлов, В.И. Михалев, Ю.Н. Бригадиров, Н.В. Пасько, Ю.В. Сергеев, М.Н. Кочура, В.И. Шушлебин // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных. Материалы международной научно-практической конференции.- Воронеж: Воронежский государственный университет.- 2004.- С. 391-396.

7. Михалев В.И. Профилактика послеродовой субинволюции матки у коров / В. И. Михалев, В.Д. Мисайлов, Н.В. Притыкин, В.И. Шушлебин, Н.В. Пасько// Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных. Материалы международной научно-практической конференции.- Воронеж: Воронежский государственный университет.- 2004.- С. 396-399.

8. Михалев В.И. Методы лечения острой субинволюции матки у коров / В. И. Михалев, В.Д. Мисайлов, С.М. Сулейманов, Н.В.Пасько // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных. Материалы международной научно-практической конференции.- Воронеж: Воронежский государственный университет.- 2004.- С. 399-403.

9. Заливанский Э.Б. Роль оксида азота в патогенезе гестоза / Э.Б. Заливанский, М.И. Рецкий, Г.Н. Близнецова, С.С. Артемьева, Н.В. Пасько// Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных. Материалы международной научно-практической конференции. Воронеж, 5-7 октября 2005 г.- Воронеж: Европолиграфия.- 2005.- С.292-299.

10. Рецкий М.И. Роль оксида азота в патогенезе субинволюции матки у коров / М.И. Рецкий, В.И. Михалев, Г.Н. Близнецова, Н.В. Пасько// Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных. Материалы международной научно-практической конференции. Воронеж, 5-7 октября 2005г.- Воронеж: Европолиграфия.- 2005.- С.382-385.

11. Рецкий М.И. Роль метаболических нарушений в развитии послеродовой субинволюции матки у коров / М.И. Рецкий, В.Д. Мисайлов, А.И. Золотарев, Г.Н. Близнецова, Н.В. Пасько, В.И. Михалев // Научные основы профилактики и лечения болезней животных: Сборник научных трудов ведущих ученых России, СНГ и др. стран.- Уральское издательство, Екатеринбург.- 2005.- С.547-551.

12. Мисайлов В.Д. Методические рекомендации по диагностики, терапии и профилактике субинволюции матки у коров /В.Д. Мисайлов, А.Г. Нежданов, А.Г. Михалев, Н.В. Пасько и др.- Воронеж, 2005.- 20 с.

13. Шахов А.Г. Значение оксида азота и половых стероидов в развитии субинволюции матки коров / А.Г. Шахов. В.И. Михалев, М.И. Рецкий, В.Д. Мисайлов, Г.Н. Близнецова, Н.В. Пасько// Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.- 2006.- №6.- С.49-51.

14. Близнецова Г.Н. Роль оксида азота в регуляции сократительной активности миометрия в период беременности и родов / Г.Н. Близнецова, Н.В. Пасько, М.И. Рецкий // Материалы 1-го съезда фармакологов России.-Воронеж, 2007.-С.126-131.

15. Пасько Н.В. Хемилюминесцентный анализ плазмы крови коров при субинволюции матки / Н.В. Пасько // Актуальные проблемы ветеринарной медицины. Материалы международной начно-практической конференции.-Курск, 2008.-С.283-287.

16. Патент 2296507 Российской Федерации, С1 Способ прогнозирования патологии послеродового периода у коров/А.И. Золотарев, М.И. Рецкий, В.Д. Мисайлов, В.И. Михалев, Н.В. Притыкин, Г.Г. Чусова, Н.В. Пасько, Н.А. Ильина.- № 2005133941; Заявлено 02.11.2005; Опубл. 10.04.2007., Бюлл. №10.

*- издания из Перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ.

Размещено на Allbest.ru

...