Оптимизация условий регенерации растений озимого чеснока (alliumsativuml.) в культуре invitro

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Оптимизация условий регенерации растений

озимого чеснока (alliumsativuml.) в культуре invitro

В.В. СКОРИНА

И.Г. БЕРГОВИНА

Т.В. НИКОНОВИЧ

Изучали влияние регуляторов роста, концентрации сахарозы и активированного угля на развитие озимого чеснока в культуре invitro. Определяли особенности роста и развития растений-регенерантов на питательных средах с различной концентрацией и видом регуляторов роста. Оценивали способность растений-регенерантов образовывать луковицу в зависимости от концентрации сахарозы. Изучали влияние присутствия в составе питательной среды абсцизовой кислоты, хлорхолинхлорида и активированного угля в различных концентрациях на регенерацию эксплантов чеснока.

We have examined the influence of growth regulators, sucrose concentrate and activated coal on the development of winter garlic in vitro. We have determined peculiarities of growth and development of regenerating plants on feeding mediums with different concentration and type of growth regulators. We have estimated the ability of regenerating plants to form the bulb depending on the concentration of sucrose. We have studied the composition of feeding medium and the influence of abscise acid, chlorcholinchloride and activated coal in it in different concentrations on regeneration of garlic explants.

Введение

Чеснок (AlliumsativumL.) - древнейшее и широко распространенное луковое растение. Популярность чеснока современная наука объясняет его бактерицидными и антиоксидантными свойствами, и в этом отношении он занимает одно из первых мест среди овощных культур [3].

Значение чеснока в питании человека определяется прежде всего высокими вкусовыми и пищевыми качествами. В нем содержатся витамины, биологически активные вещества восстанавливающего характера: флавоноиды, стероидные сапонины [5]. Культура широко используется в кулинарии, колбасном производстве, медицине.

Анализ источников

Чеснок - однолетнее растение, которое размножается только вегетативно, так как семенное размножение было утрачено в процессе эволюции при резком изменении условий произрастания [1]. Одним из способов размножения чеснока является использование метода культуры клеток и тканей invitro [6].

Работа с культурой чеснока в условиях invitro проводилась рядом исследователей: M.M. Abo, S.S. Bhojwani, T.А. Nagakubo, X. Barandiaran, P. Havranek, M.S.T. Haque и другими [7, 10, 18, 19, 20, 21]. В качестве эксплантов использовались различные части растения.KimS. S., CidL. P. B. в своих работах применяли нижнюю часть листа, J.M. Myers, H. Shuto - части корней, И.Я. Марьяхина, Г.Б. Тюкавин, Т.М. Карбанович работали с апикальной меристемой [2, 4, 6, 8, 12, 15, 22]. В качестве основного состава питательной среды использовалась питательная среда Мурасиге и Скуга (МС), J. Zel применял питательную среду В5, Г.Б. Тюкавин и M.E. Hamdy - питательные среды БДС и МВ5 (модифицированные В5) [6, 9, 17]. Улучшение регенерации растений осуществлялось за счет дополнения основного состава питательной среды ауксинами (2,4-Д, ИУК, НУК, ИМК) и цитокининами (кинетин, БАП) в различных концентрациях и сочетаниях [8, 9, 10, 12, 13, 14, 23].

Цель исследований - выявление оптимальных условий выращивания растений-регенерантов в культуре тканей invitro для получения высококачественного посадочного материала озимого чеснока.

Методы исследования

Опыты проводились с сортом озимого чеснока Зубренок и сортообразцом МГ-3. В качестве эксплантов использовались ростовые почки зубков луковицы размером 1,5-2,5 см, что позволило сократить период регенерации и за более короткое время получить растения-регенеранты.

Исследования проводились в период с октября по март. Закладка экспериментов ранее данного срока приводит к развитию каллуса у эксплантов, а исследования позднее марта требуют использования более жестких условий стерилизации растительных материалов.

Для получения стерильной культуры применялось следующее сочетание стерилизующих растворов: хлорсодержащий раствор (Clorox)+KMgO4+70%-ый этанол+сулема (HgCl2).

В опыте по оптимизации гормонального состава использовалась питательная среда МС, дополненная различными концентрациями и сочетаниями регуляторов роста, рН 5,7. Контрольным вариантом служила питательная среда MС без регуляторов роста.

L.P.B. Cid, M.E. Hamdy в своих работах применяли в качестве ауксинов 2,4-Д в концентрациях от 0,01 до 1,1 мг/ л, а в качестве цитокининов - кинетин в концентрации 2,0-2,1 мг/л [8, 9]. A. Nagasawa, M.S.T.Haque, M.A. Salam, R. Roksana дополняли основной состав питательной среды НУК и БАП в концентрациях 0,05-1,0 мг/л и 0,1-2,0 мг/л соответственно [10, 13, 14, 23]. S.S. Kim в своей работе использовал 2,4-Д (1,0 мг/л) и сочетания ауксинов и цитокининов: кинетин (3,0 мг/л)+НУК (3,0 мг/л), БАП (1,0 мг/л)+НУК (3,0 мг/л) [12].

В нашем эксперименте в качестве источников ауксинов применялись НУК и 2,4-Д в концентрациях 0,1-2,0 мг/л и 0,5-1,0 мг/л соответственно; цитокининов - 6-БАП и кинетин в концентрациях 0,1-3,0 мг/л и 0,5-2,0 мг/л соответственно. При подборе оптимальной концентрации сахарозы использовались питательные среды: МС без регуляторов роста; Ѕ МС без регуляторов роста; МС дополненная ауксином 2,4-Д в концентрациях 0,5 мг/л и 1,0 мг/л. Изучалась концентрация сахарозы от 20 до 80 г/л. Контролем служила питательная среда МС без регуляторов роста с концентрацией сахарозы 20 г/л. Для изучения влияния ингибиторов роста (абсцизовая кислота, хлорхолинхлорид) и активированного угля на развитие растений-регенерантов применялась питательная среда МС и питательная среда МС, дополненная 2,4-Д (0,5 мг/л). Изучалась концентрация абсцизовой кислоты и хлорхолинхлорида от 25 мг/л до 125 мг/л, а также активированного угля 0,16 мг/ 100 мл и 0,25 мг/ 100 мл питательной среды. В качестве контроля использовалась питательная среда МС без регуляторов роста и активированного угля.

Культивирование эксплантов осуществлялось в световой комнате, при температуре 24-260С, относительной влажности воздуха 70%, освещенности 4 тыс. лк., 16-часовом фотопериоде. Учет результатов проводился на 45-й день культивирования.

Изучались следующие признаки: регенерационная способность (отношение числа эксплантов, образовавших растения-регенеранты, к общему числу эксплантов, выраженное в процентах); высота растения (см); длина корневой системы (см); средняя масса луковицы (г); индекс формирования растения (отношение высоты растения к длине корневой системы при стремлении индекса к 1, растение имеет оптимальное соотношение надземной части и корневой системы). Результаты экспериментов обрабатывались методом дисперсионного анализа.

Основная часть

Изучение влияния гормонального состава питательной среды на развитие растений-регенерантов, а также на регенерационную способность позволило установить, что дополнение основного состава питательной среды МС ауксином НУК в концентрации 0,1 мг/л вызывало развитие растений-регенерантов без корневой системы. Высота растения на данной питательной среде составила у сорта Зубренок 15,0 см, сортообразца МГ-3 - 13,8 см, при этом регенерационная способность составила 80,0% и 93,3% соответственно. Индекс формирования растения равен 0 (табл. 1).

Таблица 1.Влияние гормонального состава питательной среды на регенерацию эксплантов озимого чеснока.

На питательной среде, содержащей НУК в концентрации 0,5 мг/л регенерационная способность была равна 100% у сорта Зубренок и 93,3% у сортообразца МГ-3. Индекс формирования растения составил 19,6 у сорта Зубренок и 20,3 у сортообразца МГ-3. Данная питательная среда способствовала интенсивному развитию надземной части (высота растения у сорта Зубренок была равна 19,6 см и 18,3 см у образца МГ-3) и развитию слабой корневой системы (длина корней у сорта Зубренок и сортообразца МГ-3 составила 1,0 см и 0,9 см соответственно).

Питательные среды с добавлением НУК и 6-БАП в концентрациях 0,1-2,0 мг/л и 0,1-3,0 мг/л соответственно вызывали развитие надземной части у растений-регенерантов, высота растения при этом находилась в пределах 12,9-27,2 см. Присутствие НУК и 6-БАП в составе питательной среды угнетало развитие корневой системы у большинства растений-регенерантов, длина корней составила 0,6-1,9 см. Таким бразом, индекс формирования растений на питательных средах, содержащих НУК и 6-БАП, был равен у сорта Зубренок 0-30,5, сортообразца МГ-3 - 0-11,0. Регенерационная способность при этом составила у сорта Зубренок и сортообразца МГ-3 80,0-100%.

Дополнение основного состава питательной среды ауксином 2,4-Д в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л значительно снизило индекс формирования растения, который составил у сорта Зубренок 2,1-2,3, у сортообразца МГ-3 - 1,9-2,3. Это связано с тем, что на данной питательной среде растения-регенеранты вегетировали с хорошо развитой как надземной частью, так и корневой системой. Высота растения при этом была равна 19,2 см и 20,9 см у сорта Зубренок, 17,6 см и 22,4 см у образца МГ-3, а длина корневой системы составила у сорта Зубренок 9,3 и 9,1 см, а у сортообразца МГ-3 - 9,2 и 9,6 см. Регенерационная способность и у сорта, и у сортообразца равна 100%.

На питательной среде, содержащей 2,4-Д (1,0 мг/л) и кинетин (0,5 мг/л), регенерационная способность составила 93,3% для сорта Зубренок и 100% для сортообразца МГ-3, высота растения и длина корневой системы были равны 18,3 см и 4,2 см у сорта Зубренок и 19,9 см и 3,5 см у образца МГ-3, индекс формирования растения - 4,4 и 5,6 соответственно.

Питательная среда с добавлением 2,4-Д и кинетина в концентрациях 1,0 мг/л и 2,0 мг/л соответственно не вызывала развития корневой системы у растений регенерантов, а высота растения на данной питательной среде составила 14,1 см у сорта Зубренок и 11,7 см у сортообразца МГ-3. Регенерационная способность при этом была равна у сорта Зубренок 86,6% и 93,3% для сортообразца МГ-3. В связи с отсутствием корневой системы индекс формирования растения у двух образцов составил 0.

Таким образом, оптимальной питательной средой для культивирования сортообразцов озимого чеснока в условиях invitro являлась питательная среда MС, дополненная ауксином 2,4-Д в концентрации 0,5 мг/л. На данной питательной среде регенерационная способность у сорта Зубренок и сортообразца МГ-3 составила 100%, а индекс формирования растения был равен 2,1 и 1,9 соответственно.

Большинство исследователей в своих работах по улучшению развития растений-регенерантов чеснока в условиях invitro и формированию луковицы применяли в составе питательной среды сахарозу в концентрации 30 г/л [7, 8, 13,15, 23]. Однако E.K. Kim, M.S. Haque, S.S. Kim, J. Zel, M.Y. Yasseen использовали концентрацию сахарозы, равную 80-130 г/л, так как считали, что полноценная луковица может сформироваться только при высокой концентрации углеводов [10, 11, 12, 16, 17]. В вышеописанном эксперименте образование луковицы не происходило, поэтому был поставлен эксперимент по выявлению оптимальной концентрации сахарозы в составе питательной среды, которая способствовала бы развитию луковиц у растений-регенерантов.

Изучение влияния концентрации сахарозы на развитие растений-регенерантов, регенерационную способность, а также на развитие луковицы позволило установить, что концентрация сахарозы 60 г/л в составе питательной среды МС без регуляторов роста вызывала развитие полноценной луковицы у сорта Зубренок и у сортообразца МГ-3, средняя масса луковицы равна 1,04 г и 0,92 г соответственно (табл. 2). Регенерационная способность при этом составила 80,0% для сорта Зубренок и 93,3% для сортообразца МГ-3, а индекс формирования растений - 3,2 и 2,8 соответственно. Данная питательная среда вызывала развитие как надземной части (высота растения составила у сорта Зубренок 21,1 см и 20,8 см у образца МГ-3), так и корневой системы (длина корней была равна у сорта Зубренок и сортообразца МГ-3 - 6,6 см и 7,3 см соответственно). Увеличение до 80 г/л или же снижение до 20-40 г/л концентрации сахарозы в составе питательной среды МС без регуляторов роста не вызывало образования луковиц у растений-регенерантов.

Однако концентрация сахарозы 80 г/л в составе питательной среды Ѕ МС без регуляторов роста способствовала развитию полноценной луковицы у растений-регенерантов, средняя масса луковиц при этом для сорта Зубренок составила 0,61 г и 0,59 г для сортообразца МГ-3. Регенерационная способность в данном случае равна у сорта Зубренок 73,3% и 66,7% у сортообразца МГ-3, а индекс формирования растения составил 3,2 для обоих образцов. Растения-регенеранты на данной питательной среде были с хорошо развитой надземной частью и корневой системой. Высота растения и длина корней у сорта Зубренок составили 20,1 см и 6,3 см, а у сортообразца МГ-3 - 21,7 см и 6,7 см соответственно.

Изучение влияния различных концентраций сахарозы, в составе питательной среды МС, дополненной ауксином 2,4-Д в концентрации 0,5 мг/л позволило установить, что растения-регенеранты с хорошо развитой надземной частью, корневой системой и луковицей формируются на питательной среде с концентрацией сахарозы 40 г/л. Регенерационная способность при этом равна 86,6% для сорта Зубренок и 73,3% для сортообразца МГ-3, индекс формирования растения составил 3,1 и 3,0 соответственно. Высота растения и длина корней были равны у сорта Зубренок 19,9 см и 7,3 см, у сортообразца МГ-3 - 21,1 см и 7,6 см соответственно. Средняя масса луковицы составила у сорта Зубренок 0,9 г и 0,91 г у сортообразца МГ-3.

Хорошая надземная часть и корневая система, а также луковица развивались у растений-регенерантов на питательной среде МС с добавлением 2,4-Д (1,0 мг/л) и концентрацией сахарозы 60 г/л. На данной питательной среде регенерационная способность составила для сорта Зубренок 60,0% и 73,3% для сортообразца МГ-3, индекс формирования растения равен 2,9 и 3,0 соответственно. Высота растения и длина корней были равны у сорта Зубренок 21,4 см и 7,3 см, у сортообразца МГ-3 - 20,6 см и 6,9 см соответственно. Средняя масса лукавицы составила у сорта Зубренок 0,65 г и 0,60 г у сортообразца МГ-3.

M.Y. Yasseen предложил дополнить состав питательной среды активированным углем в концентрации 5 г/л и сахарозой в концентрации 120 г/л. По его мнению это способствует хорошей приживаемости растений-регенерантов без акклиматизации при переносе их в условия invivo [16].

Изучение влияния активированного угля в составе питательной среды на развитие растений-регенерантов, а также на регенерационную способность позволило установить, что дополнение питательной среды МС активированным углем в концентрации 0,16 г/100 мл способствовало развитию у растений-регенерантов хорошей корневой системы и слабой надземной части. Высота растения и длина корней составила 10,5 см и 10,9 см у сорта Зубренок 9,8 см и 10,2 см у образца МГ-3 соответственно. Индекс формирования растений был равен 1,0 у сорта Зубренок и 0,9 у сортообразца МГ - 3, регенерационная способность - 100 % и 80% соответственно (табл.3).

На питательной среде, содержащей активированный уголь в концентрации 0,25 г/100 мл, регенерационная способность составила 100% у сорта Зубренок и сортообразца МГ-3, а индекс формирования растения - 0,8 и 1,1 соответственно. Высота растения и длина корней были равны у сорта Зубренок 11,6 см и 13,8 см, а у образца МГ-3 - 13,7 см и 12,4 см соответственно.Таблица 3.Влияние концентрации активированного угля в составе питательной среды МС на развитие эксплантов озимого чеснока.

Питательная среда МС, не содержащая в своем составе активированного угля, вызывала развитие у растений-регенерантов только надземной части как у сорта Зубренок, так и у сортообразца МГ-3, высота растения составила 0,2 см и 0,7 см соответственно. Регенерационная способность в данном варианте была равна 60% и 80% соответственно. Индекс формирования растения у всех образцов составил 0, развитие как надземной части (высота растения составила у сорта Зубренок 21,1 см и 20,8 см у образца МГ-3), так и корневой системы.

Изучение влияния активированного угля в составе питательной среды МС, дополненной ауксином 2,4-Д в концентрации 0,5 мг/л, на развитие растений-регенерантов позволило установить, что растения с хорошо развитыми надземной частью (высота растения у сорта Зубренок и образца МГ-3 равна 18,4 см и 16,8 см) и корневой системой (длина корней составила у сорта Зубренок и сортообразца МГ-3 - 15,6 см и 17,5 см соответственно) формируются на питательной среде с концентрацией активированного угля 0,25 г/ 100 мл. Регенерационная способность при этом равна у сорта Зубренок и сортообразца МГ-3 100 %, индекс формирования растения составил 1,1 и 0,9 соответственно.

Снижение концентрации активированного угля и отсутствие его в составе питательной среды МС + 2,4-Д (0,5 мг/л) вызывало развитие слабых растений со светло-зелеными листьями. На питательной среде, содержащей активированный уголь в концентрации 0,16 г/100 мл, регенерационная способность была равна 80% у сорта Зубренок и 100% у сортообразца МГ-3, а индекс формирования растения - 0,7 и 0,6 соответственно. Высота растения и длина корней составила у сорта Зубренок 8,6 см и 12,7 см, а у образца МГ-3 - 9,0 см и 13,4 см соответственно.

Питательная среда, не содержащая в своем составе активированного угля, способствовала развитию у большинства растений-регенерантов только надземной части, высота растения составила 14,4 см у сорта Зубренок и 10,9 см у образца МГ-3. Регенерационная способность при этом была равна 80% у сорта Зубренок и образца МГ-3, а индекс формирования растений у сорта Зубренок составил 12, у сортообразца МГ-3 - 0.

Индекс формирования растений в большинстве вариантов был близок к 1, но растения-регенеранты на питательной среде МС, дополненной 2,4-Д в концентрации (0,5 мг/л) и активированным углем (0,25 г/100 мл), развивались сильные, с темно-зелеными листьями и хорошо развитой корневой системой.

Хлорхолинхлорид во всех использованных концентрациях оказал подавляющее действие на регенерацию эксплантов. На всех вариантах питательных сред у эксплантов отсутствовало развитие как корневой системы, так и надземной части растения. Через 35 дней после закладки эксперимента экспланты отмирали.

Аналогичное действие на развитие эксплантов оказала и абсцизовая кислота во всех применяемых в эксперименте концентрациях, только при концентрации 25 мг/л образовался один листочек длиной 5,1 см, но корневая система отсутствовала. Дальнейшее увеличение концентрации абсцизовой кислоты в составе питательной среды МС подавляло развитие не только корневой системы, но и надземной части. Через 60 дней после закладки эксперимента экспланты отмирали.

Заключение

Таким образом, результаты эксперимента показали, что оптимальной питательной средой для культивирования озимого чеснока в условиях invitro являлась питательная среда МС, дополненная ауксином 2,4-Д в концентрации 0,5 мг/л, концентрацией сахарозы 40 г/л и концентрацией активированного угля 0,25 г/100 мл питательной среды. Регенерационная способность при этом составила 100%, индекс формирования растения - 0,9-1,1. Эти условия способствовали развитию растений-регенерантов правильной морфологии. Сортовые различия на всех питательных средах выражены слабо.

Литература

1. Алексеева, М.В. Чеснок / М.В. Алексеева. М., 1979. 102 с.

2. Карбанович, Т.М. Методы биотехнологии в современной селекции овощных культур / Т.М. Карбанович//Овощеводство на рубеже третьего тысячелетия: материалы Междунар. науч.-практ. конф. Минск, 2004. С. 141-150.

3. Кузнецов, А.В. Чеснок культурный / А.В. Кузнецов. Сельхозгис, 1954. 115 с.

4. Марьяхина, И.Я. Получение безвирусного посадочного материала чеснока, лука-шалота и многоярусного лука с использованием биотехнологических приемов: метод. рекомендации / И.Я. Марьяхина. М.: ВАСХНИИЛ, 1987. 45 с.

5. Пивоваров, В.Ф. Луковые культуры / В.Ф. Пивоваров, И.И. Ершов, А.Ф. Агофонов. М., 2001. 500 с.

6. Тюкавин, Г.Б. Получение безвирусных растений чеснока в культуре invitro / Г.Б. Тюкавин// Селекция овощных культур: сб. науч. тр. ВНИИССОК. М., 1989. С. 116-119.

7. Abo, M.M. Organogenesis and embryogenesis in callus cultures of garlic (Allium sativum L.)/ M.M. Abo// Plant Sci. Lett. 1977. №9. P. 259-264.

8. Barandiaran, X. An efficient Method for the in vitro Management of Multiple Garlic accessions/ X. Barandiaran, N. Martin, C. Alba// In vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 1999. №35. P. 466-469.

9. Bhojwani, S.S. In vitro propagation of garlic by shoot proliferation/ S.S. Bhojwani// Scientia Hort. 1980. №13. P. 47-52.

10. Cid, L.P.B. Regeneration of garlic Plants (Allium sativum L.) via cell culture in Liquid medium/ L.P.B. Cid, R.D. Illg// In vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 1994. №30. P. 150-155.

11. Hamdy, M.E.A. An effective method for generating somaclonal variability in Egyptian garlic (Allium sativum L.)/ M.E.A. Hamdy// Proceeding of the 3rd Scientific Conf. of Agriculture Sci., Fac. of Agric., Assiut Univ., Assiut, Egypt. 2002. №20-22. P. 479-495.

12. Haque, M.A. Effect of 2.4-D and BAP on in vitro Regeneration of Garlic/ M. A. Haque // OnLine Journal of Biological Sciences. 2003. №2(12). P. 771-774.

13. Havranek, P. The bud formation in the callus culture of Allium sativum L./ P. Havranek, F.J. Novak// Z.Pflanzenphysiol. 1973. №68. P. 308-318.

14. Kim, E.K. High frequency of shoot multiplication and bulblet formation of garlic in liquid cultures/ E.K. Kim, E.J. Hahn, H.N. Murthy// Plant Cell Tissue and Organ Culture. 2003. №73. P. 231-236.

15. Kim, S.S. Multiple Shoots Regeneration and in vitro Bulblet Formation from Garlic Callus/ S.S. Kim, D.P. Guo, D.C. Jung// J. Plant Biotechnology. 2003. №5 (2). P. 95-99.

16. Myers, J.M. Continuous callus production and regeneration of garlic using root segments from shoot-tip-derived plantlets/ J.M. Myers, P.W. Simon// Plant Cell Rep. 1998. №17. P. 726-730.

17. Nagakubo, T.A. Micropropagation of garlic through in vitro bulblet formation/ T.A. Nagakubo, A. Nagasawa, H. Ohkawa// Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1993. №32. P. 175-183.

18. Nagasawa, A. Development of morphogenic suspension cultures of garlic (Allium sativum L.)/ A. Nagasawa, J.J. Finer// Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1988. №15. P. 183-187.

19. Roksana, R. In vitro Bulblet Formation from Shoot Apex in Garlic (Allium sativum L.)/ R. Roksana, M.F. Alam, R. Islam, M.M. Hossain// Plant Tissue Cult. 2002. №12 (1). P. 11-17.

20. Salam, A.M. Callus Induction and Regeneration of Indigenous Garlic (Allium sativum L.)/ A.M. Salam, M.R. Ali, K.A. Alam// American Journal of Plant Physiology. 2008. №3 (1). P. 33-39.

21. Shuto, H. In vitro Propagation of Plants from Root Apex-Derived in Chinese Chive and Garlic/ H. Shuto, T. Abe, T. Sasahara// Jaran. J. Breed. 1993. №43. P. 349-354. регенерация чеснок рост

22. Yasseen, M.Y. In vitro shoot proliferation and production of sets from garlic and shallot/ M.Y. Yasseen, W.E. Splittstoesser, R.E. Litz // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1994. №36. P. 243-247.

23. Zel, J. The effect of Jasmonic Acid, Sucrose and Darkness on garlic (Allium sativum L.) Bulb formation in vitro/ J. Zel, N. Debeljak// In vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 1997. №33. P. 231-235.

Размещено на Allbest.ru