Оценка родительских линий гибридов кукурузы с использованием метода электрофореза зеинов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оценка родительских линий гибридов кукурузы с использованием метода электрофореза зеинов

Н.А. Дуктова

С.В. Егоров

Т.В. Кардис

Проблема объективной, c высокой точностью оценки качества семян сельскохозяйственных культур в последнее время становится особенно актуальной по целому ряду причин. Во-первых, закупаемый вне республики семенной материал, как правило, имеет высокую стоимость, во-вторых, потребители заинтересованы в получении высокой урожайности за счет выбора гибридов и качественных семян. Традиционно применяемые для оценки сортовых и посевных качеств семян методы контроля с достаточно высокой точностью позволяют оценить семенной материал по критериям сортовых качеств, уровню гибридности или типичности, но не обеспечивают проведение необходимых анализов с высокой степенью достоверности и в кратчайшие сроки.

Особенно важное значение применение новых методов приобретает при осуществлении контроля качества семян у гибридов кукурузы и их родительских компонентов. Это связано с высокой стоимостью семян родительских линий и закупаемых гибридов, которые используются только в F₁. Закупая семенной материал, потребитель вправе рассчитывать на получение запланированной отдачи от вложенных средств. В условиях производственного использования в ряде случаев может иметь место несоответствие заявляемых характеристик семян фактическому уровню по проценту гибридных зерновок, степени генетической однородности родительских линий, что в конечном итоге приводит к финансовым потерям по причине недобора урожая или получению гибридных форм с низкими урожайными свойствами. В связи с этим встает необходимость объективной оценки качества приобретаемого семенного материала еще до его высева в поле. При этом необходимо определить, насколько заявленное в сопроводительных документах качество семенного материала соответствует действительности. Проведение точной и объективной оценки семенного материала сельскохозяйственных культур на предмет соответствия требованиям ТНПА и заявляемым в документах по качеству характеристикам стало возможным благодаря разработке специальных методов молекулярного маркирования.

Целью проводимой работы являлась оценка степени генетической однородности инбредных линий, используемых в качестве родительских компонентов гибридов кукурузы, оценка уровня гибридности простых гибридов. Данные оценки проводились методом электрофоретического анализа в рамках деятельности аккредитованной Испытательной лаборатории качества семян УО БГСХА по контролю за качеством семян кукурузы, закупаемых вне республики.

Анализ источников

Стандартными методами молекулярного маркирования для кукурузы являются метод электрофоретического анализа или изофокусирования зеина - запасного белка семян кукурузы [7, 8].

Электрофоретический метод - это способ разделения веществ, в данном случае запасных белков, по подвижности в электрическом поле. Электрофоретические спектры запасных белков специфичны не только для сорта, гибрида, но и для отдельных линий, биотипов внутри определенного сорта. Такая особенность генетически детерминированного белкового признака не связана с условиями среды, что определяет его надежность и точность [6].

На основе современного уровня знаний о белках и нуклеиновых кислотах был открыт принцип маркирования генетических систем организма. Он основан на том, что каждый белок - первичный, уникальный продукт экспрессии гена (наследственность организма), который является обязательным составляющим любой клетки. Применение белковых маркеров является фактором идентификации гибридов кукурузы. Электрофорез принят в качестве стандартного метода Международной ассоциации по испытанию семян, объединенный под эгидой ISTA [6, 7].

Благодаря кодоминантному характеру наследования белковых компонентов, метод электрофореза позволяет не только оценивать материал с точки зрения их соответствия основным критериям качества [8], но и вскрывать причины, вызвавшие отклонения от заявленных характеристик.

Электрофоретический анализ запасных белков (зеинов) позволяет контролировать уровень гибридности семян кукурузы, что служит повышению качества ввозимых партий при международной торговле [4].

Электрофорезом с высокой достоверностью можно контролировать комбинации скрещивания любого гибрида кукурузы с момента передачи его в государственное сортоиспытание (эталонный паспорт гибрида) до того времени, когда гибрид будет модифицирован в процессе семеноводства, возможно даже и с улучшением урожайных качеств (фальсифицированный паспорт гибрида) [2].

Нормативно-правовая база применения метода электрофоретического анализа для контроля качества семян кукурузы на территории Республики Беларусь в полной мере регламентирована с момента введения в действие в 2006 г. СТБ 1710-2006 «Семена кукурузы. Метод определения уровня гибридности семян первого поколения, оценка типичности и маркирование инбредных линий» [4].

В целом на основе имеющихся данных [9] и реальных генетических характеристик гибридов кукурузы Министерством сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь установлены требования по отношению к оплате закупаемых гибридных семян кукурузы согласно их качеству. Так, стоимость простых межлинейных гибридов оплачивается в полном объеме только при условии, что уровень гибридности составляет не менее 95%; при гибридности от 94 до 90% цена пропорционально уменьшается на 3% за каждый процент снижения гибридности. Для двойных межлинейных и трехлинейных гибридов при показателях гибридности до 85% и выше семена оплачиваются в полном объеме стоимости, при гибридности 84-80% цена уменьшается на 3% за каждый процент снижения гибридности. Семена с уровнем гибридности ниже 80% не допускаются к использованию.

Методы исследования

В качестве метода исследований использовался электрофоретический анализ зеинов семян кукурузы в соответствии с СТБ 1710-2006 «Семена кукурузы. Метод определения уровня гибридности семян первого поколения, оценка типичности и маркирование инбредных линий» [4].

Семена родительских форм гибридов предоставлялись Республиканским объединением «Белсемена».

Электрофоретический анализ проводился в выборке из 100 семян (для анализа на однородность самоопыленных линий или уровень гибридности простого гибрида) с экстракцией зеина 70% этанолом.

Основная часть

Известно, что для родительских линий и гибридов кукурузы широко используется понятие «генетическая чистота», то есть соответствие генов коммерческого гибрида или линии оригинальному (исходному) образцу, созданному селекционером [3]. Традиционно для контроля за сохранностью чистоты линий применяется полевое обследование, основанное на анализе морфологических признаков и их соответствия исходному уровню. Если не проводить детального изучения и контроля типичности родительских линий, то падение урожайности семян получаемых гибридов неизбежно. Так, по данным В.Г. Гаркушки [3], если в материнской линии простого гибрида наблюдается опыление 50% своих растений, урожайность гибрида может снизиться в два раза за счет того, что линейные растения по продуктивности ниже гибридных в 3 и более раза.

Применяемые методы морфологического контроля степени стерильности материнских форм и степени типичности отцовских форм, как правило, легче всего применять на уровне простых гибридов, поскольку все растения данного гибрида в норме представляют особи с одинаковым генотипом и морфологическим выражением признаков. Поэтому засорение чужеродной пыльцой выражается по вегетативным признакам и початку довольно четко [3].

Однако уже для трехлинейных, а тем более двойных межлинейных гибридов, благодаря генетическому разнообразию за счет расщепления наследственных свойств родительских форм, по морфологическим признакам очень трудно проконтролировать полноту гибридности. Именно в таких случаях применение методов, приближенных к уровню гена, наиболее оправдано и целесообразно.

В ходе оценки типичности и генетической однородности родительских компонентов нами были проанализированы формы, являющиеся как простыми самоопыленными линиями в случае с простыми гибридами, так и простыми гибридами, используемыми в качестве материнских форм у двойных и трехлинейных гибридов. Исходя из этого, для интерпретации полученных результатов учитывалось, что самоопыленные линии должны иметь один тип спектра белка, наличие в анализируемой выборке зерен с другими типами спектра свидетельствует о засорении. При скрещивании таких линий в создании простых или трехлинейных гибридов формируется высокий уровень гетерогенности, что снижает показатель гибридности.

Только генетически однородные инбредные родительские линии дают выровненные простые гибриды. Визуально это выражается в однородности по спектру зеина самоопыленной линии, наличию только одного типа белкового спектра.

Наличие зерен с другими типами спектра в небольших количествах (примерно до 5%) свидетельствует о засорении линии в результате переопыления или механического засорения [10]. В случае если в анализируемой выборке выявляются два и более равноценных по частоте встречаемости типа спектра зеина, можно делать вывод об отсутствии линии как таковой.

На основании ранее проведенных исследований установлено, что практически все изученные инбредные линии в той или иной степени отличаются по спектру компонентов зеина. Выражается это как в присутствии разного числа молекулярных форм зеинового комплекса, так и разной представленностью отдельных компонентов по зонам белкового спектра.

Типичность самоопыленной линии (О) в процентах вычисляют по формуле [1]:

где Н - количество идентичных электрофореграмм, шт.; П - количество анализируемых зерновок.

При оценке однородности и типичности инбредных линий кукурузы следует учитывать специфическую особенность белкового комплекса зеина, в частности нами не учитывалась зона белкового спектра, формируемая быстроподвижными компонентами, поскольку различия компонентов в этой зоне могут быть обусловлены как различной концентрацией белка, связанной с процедурой экстракции, так и присутствием в некоторых случаях белков незеиновой природы [1].

Результаты проведенного анализа родительских форм гибридов кукурузы показали, что электрофоретический спектр зеина характеризуется незначительным варьированием молекулярных форм, составляющих зеиновый комплекс - в среднем от 14 до 20 (рис.). Исключение составляют только родительские формы, для которых выявлено наличие нескольких типов спектра - ИК-124-1 и М-92СВ и характеризуемых низкими значениями типичности. Для этих родительских компонентов варьирование молекулярных форм зеинового комплекса (МФЗ) имело значительный размах и составляло от 9 до 19 единиц.

Оценка уровня типичности родительских компонентов простых гибридов показала, что в большинстве своем они имели значения показателя на уровне 95-99% и характеризовались только одним типом зеинового спектра.

Отличия между анализируемыми родительскими формами определялись как по степени интенсивности отдельных компонентов, так и по их относительной подвижности по зонам белкового спектра.

Для материнских форм двойных и трехлинейных гибридов нами были выявлены несколько типов спектра, имеющих четкие отличия, выраженные по степени интенсивности компонентов быстрой зоны белкового спектра.

Характеристика родительских форм гибридов кукурузы по результатам электрофореза зеинов зерна

По результатам анализа родительских форм, представляющих простые самоопыленные линии, было выявлено, что отдельные линии являются генетически не выровненными и включают несколько отличных друг от друга белковых форм.

Интерес представляет линия ИК-124-1, созданная на базе 4-х сестринских линий плазмы Со 125, отобранная после шестого самоопыления, то есть до наступления действия инбредной депрессии [11].

Однако по результатам проведенной оценки нами установлено, что электрофоретический спектр зеина данной линии включает 3 биотипа, имеющих отличия как в степени интенсивности белковых компонентов, так и в их подвижности по зонам спектра. Выявленные биотипы имеют частоту встречаемости по первому - от 50 до 60%, второму - от 5 до 15%, третьему - от 5 до 25%.

Вполне вероятно, что выявленная гетерогенность линии может быть связана с локализацией зеинкодирующих локусов в одной хромосоме (группе сцепления), в связи с чем даже в поздних самоопыленных поколениях не удается обеспечить высокую степень гомозиготности по зеин-кодирующим локусам хромосом. Вместе с тем следует учитывать, что использование таких родительских линий в скрещиваниях не позволяет осуществлять достоверный контроль уровня гибридности в поколении гибридов F₁ по причине отсутствия четких маркерных компонентов.

Кроме этого, для данной линии идентифицированы типы спектра, не подходящие под белковые признаки трех основных биотипов. Данные биотипы имеют отличия от основных типов спектра как по степени интенсивности отдельных компонентов спектра, так и по наличию или элиминации компонентов спектра. В анализируемой выборке семян присутствие таких нетипичных белковых биотипов было представлено на уровне 25%, что может быть вызвано как переопылением, так и малой степенью гомозиготности исходных форм.

В целом выявленная слабая степень гомозиготизации данной родительской линии не позволяет четко установить отличительные белковые признаки отцовской формы для контроля гибридности в потомстве F₁.

Электрофоретический спектр линии М-92СВ также характеризуется присутствием нескольких биотипов примерно в равных количественных соотношениях, составляющих 15-20%. Общее число выделенных биотипов составляет более 3-х. Выявленные биотипы характеризуются достаточно широким диапазоном варьирования: от 9 до 16 молекулярных форм, составляющих зеиновый комплекс эндосперма изученного генотипа. Как свидетельствуют научные данные [5], белковый спектр простых гибридов, и тем более самоопыленных родительских форм, показывает, как правило, довольно узкий диапазон варьирования компонентного состава (молекулярных форм зеина) при значительном их числе. В случае с анализируемой формой М-92 СВ наблюдается не типичная картина, свидетельствующая о генетической неоднородности родительской формы.

Наряду с основными белковыми биотипами, генотип анализируемой формы характеризуется наличием промежуточных форм, имеющих обедненный компонентный состав зеина и показывающих отличия от основных биотипов как по степени интенсивности отдельных компонентов, так и по их подвижности в спектре зеина. Общее число таких форм составляет 28,0%.

В целом по результатам проведенного испытания линии М-92 СВ установлена генетическая неоднородность по белковому комплексу зеина, определена низкая степень гомозиготности родительской формы, не выявлены четкие белковые отличительные признаки для их последующего контроля в гибридах F₁.

Иную особенность выявили линии ИК-203-3, ДК-276-1СВ, ДК-744-1СВ, включающие в свой белковый комплекс один тип спектра и характеризующиеся незначительным варьированием молекулярных форм зеинового комплекса.

Для данных линий определены высокие значения показателя типичности на уровне 96-98% с незначительным варьированием компонентного состава по зонам спектра. Выявленные отличия выражались в разной степени интенсивности компонентов зеинового спектра и отличиям по местонахождению в зоне компонентов со средней подвижностью.

Родительские материнские формы двойных межлинейных и трехлинейных гибридов Кросс 220С, Кросс 180С, Сирена С, Комета М, Корал МВ показали высокие значения генетической однородности и гибридности. Поскольку данные формы являлись простыми гибридами, в своем составе они насчитывали несколько типов белковых биотипов с соотношением 1:3. Варьирование молекулярных форм зеина внутри каждой линии было незначительно, различия между биотипами определились в основном по наличию или отсутствию отдельных компонентов спектра.

Таким образом, по результатам проведенных исследований установлены родительские формы, характеризуемые как генетической выравненностью и однородностью, так и гетерогенные, то есть представленные несколькими типами белковых спектров зеина. Использование гетерогенных родительских линий в создании гибридов крайне нежелательно, поскольку от скрещивания таких линий получается высокая гетерогенность, что снижает показатель гибридности. Существующие требования к родительским самоопыленным линиям четко оговаривают число типов белкового спектра для включения линии в скрещивания с целью получения высокогетерозисных гибридов.

В целом следует отметить, что имеющиеся в селекции и семеноводстве родительских форм гибридов кукурузы подходы по контролю за уровнем типичности и генетической однородности должны обязательно включать методы контроля, основанные на молекулярных маркерах, в частности на использовании метода электрофоретического анализа зеинов зерна. Поскольку при закупке вне Республики Беларусь родительские линии гибридов кукурузы проходят контроль только по морфологическим признакам на основе зернового материала, не исключено попадание некачественных, генетически не выровненных родительских форм. В связи с этим рекомендовано проведение обязательного контроля показателя типичности самоопыленных линий и уровня гибридности простых гибридов в ходе международных закупок семян кукурузы.

Литература

гибрид кукуруза биотип

1. Анализ и регистрация линий, сортов и гибридов кукурузы по зеину методом электрофореза: метод. указания и каталог белковых формул / сост. В.В. Сидорова, Г.В. Матвеева, Г.И. Тимофеева; под ред. В.Г. Конарева. СПб.: ВИР, 1998. 52 с.

2. Воронин, А.Н. Гибридность семян кукурузы и урожай / А.Н. Воронин, Н.С. Сокорев, П.М. Авраменко // Кукуруза и сорго. 2004. № 6. С. 12-13.

3. Гаркушка, В.Г. Генетическая чистота гибридов - основа урожайности / В.Г. Гаркушка // Тез. докл. Национальн. ассоциации производителей кукурузы. Кубань, 8 июля 2009 г. С. 12-15.

4. Семена кукурузы. Метод определения уровня гибридности семян первого поколения, оценка типичности и маркирование инбредных линий: СТБ 1710-2006. утв. и введ. в действие Постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 30 декабря 2006 г. №66. Минск, 2006. 11 с.

5. Комарова, Г.Е. Проявление эффекта гетерозиса у кукурузы на уровне белковых маркеров / Г.Е. Комарова, А.И. Ротарь, А.А. Палий [и др.] // Єtiinюa agricolг. № 2. 2007. С. 11-15.

6. Конарев, В.Г. Белки растений как генетические маркеры / В.Г. Конарев. М.: Колос, 1983. 320 с.

7. Конарев, А.В. Использование молекулярных маркеров в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции / А.В. Конарев // Аграрная Россия. 2006. №6. С. 4-22.

8. Молекулярно-биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции / под ред. В.Г. Конорева // Теоретические основы селекции / под ред. В.Г. Конарева. М.: Колос, 1993. Т. 1. 447 с.

9. Пожога, В.Н. Рекомендации по возделыванию кукурузы в Молдове / В.Н. Пожога. Пашкань, 1996. 35 с.

10. Семена кукурузы. Определение уровня гибридности семян гибридов первого поколения и оценка однородности и маркирование инбредных линий. Методика определения / сост. Н.Н. Петрова, С.В. Егоров, Т.В. Кардис. Горки: Белорусская государственная сельскохозяйственная академия, 2009. 16 с.

11. Экспертное заключение по результатам оценки линии кукурузы / сост. Е.И. Беликов; Синельниковская селекционно-опытная станция. Институт зернового хозяйства Украины. 2010. 4 с.

Размещено на Allbest.ru