Оздоровление растений-регенерантов озимого чеснока в условиях культуры in vitro при помощи рибавирина

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Оздоровление растений-регенерантов озимого чеснока в условиях культуры in vitro при помощи Рибавирина

Т.В. Никонович, И.Г. БЕрговина, В.В. Скорина

Аннотация

В статье представлены результаты проведенного оздоровления растений-регенерантов озимого чеснока от вирусных заболеваний OYDV и GarCLV в условиях культуры in vitro с использованием Рибавирина в различных концентрациях. Выявлено, что применение условий культуры in vitro без Рибавирина уже способствует эффективному освобождению растений озимого чеснока от вируса GarCLV. Вирус OYDV оказался более устойчивым к условиям культуры in vitro и к воздействию Рибавирина.

Annotation

The article presents results of treatment of plants-regenerants of winter garlic against virus diseases OYDV and GarCLV in the conditions of a culture in vitro with the help of Ribavirin in different concentrations. We have established that the conditions of a culture in vitro alone, without Ribavirin, are sufficient for the effective cure of winter garlic plants from the virus GarCLV. The virus OYDV proved to be more resistant both to the conditions of a culture in vitro and to the action of Ribavirin.

Введение

Чеснок (Allium sativum L.) считается лучшим лекарством от многих болезней человека, однако сама культура поражается целым рядом вредителей и болезней, наносящих значительный ущерб урожаю и его качеству [1, 2, 3]. Особую опасность представляют вирусные заболевания, от которых зависит формирование урожая чеснока.

Целью настоящей работы является установление эффективности использования Рибавирина в условиях in vitro для оздоровления озимого чеснока.

Анализ источников

Культура размножается только вегетативно, и это способствует накоплению вирусов в луковицах, а также передаче их от поколения к поколению. Литературные данные свидетельствуют, что посевной материал чеснока может быть заражен вирусными заболеваниями на 100%, причем как одним вирусом, так и комплексом вирусов, относящихся к различным родам [6, 7, 12].

Работу по определению зараженности вирусами и оздоровлению чеснока проводили ученые: T.V.M. Fajardo, M. Helguera, P. Lunello, I. Mavric, K. Yamashita. Наиболее распространенными вирусами чеснока являются чесночный общий скрытый вирус (GarCLV) рода Сarlavirus и желтая полосатость или карликовость (OYDV) рода Рotyvirus. Растения, зараженные вирусами, имеют угнетенный вид: отстают в росте, проявляется резкая деформация всего растения, листья желтеют, нередко становятся складчатыми или гофрированными, опускаются к земле вследствие потери тургора, становятся плоскими [8, 9, 10, 11, 13]. Для оздоровления растений от вирусной инфекции в настоящее время наиболее эффективным является применение методов культуры in vitro в сочетании с химиотерапией. Для проведения химиотерапии используются химические соединения, убивающие вирусы, находящиеся в растительных клетках. Одним из способов диагностики наличия вирусов в растительном материале является иммуноферментный анализ (ИФА). Метод обладает высокой чувствительностью и быстротой проведения [4, 5].

Методы исследований

Эксперименты по оздоровлению растений озимого чеснока с использованием Рибавирина проводились в УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия» в 2010 г. Исследования по определению зараженности растений-регенерантов вирусами OYDV и GarCLV осуществлялись в отделе биотехнологии РУП «Институт плодоводства». вирус рибавирин чеснок оздоровление

Использовались сорта и формы чеснока: Грибовский юбилейный, Дубковский, Хотимон, Антонник, Петровский, ВЧ-1, ИО-1, БД-1, ММ-1, МВ-1, МГ-1, МГ-2, МГ-3, МС-1, БС-1, РФБ-1.

Оздоровлению подвергались растения-регенеранты, полученные в условиях культуры in vitro. В качестве исходных эксплантов использовались ростовые почки зубков луковицы размером 1,5-2,5 см. Для их стерилизации последовательно применялись следующие стерилизующие растворы: хлорсодержащий раствор Domestos > KMgO4 > 70%-ый этанол > сулема (HgCl2).

Формирование растений-регенерантов осуществлялось на питательной среде Мурасиге-Скуга (МС), дополненной 0,5 мг/л 2,4-Д и 40 г/л сахарозы. Через 20 дней сформировавшиеся растения пересаживались на питательные среды для оздоровления, которое проводилось с помощью двух концентраций Рибавирина (10 мг/л и 20 мг/л), добавляемого в состав питательных сред. В качестве контрольного варианта использовалась питательная среда без Рибавирина.

Экспланты культивировались в световой комнате, при температуре 24-26 0С, относительной влажности воздуха 70%, освещенности 4 тыс. лк., 16 часовом фотопериоде. Учет результатов проводился на 45-й день культивирования.

Тестирование образцов осуществлялось методом DAS-ELISA-теста с использованием реактивов фирмы SEDIAG по следующей схеме:

1. Абсорбция антител. Специфические поликлональные антитела разводили в покровном буфере в соотношении 1:100, вносили по 100 мкл в лунки микроплат, которые затем инкубировали в течение 2-х часов при 37єС. Затем проводили трехкратную промывку буфером при помощи вошера PW 40.

2. Внесение экстракта тестируемых образцов. Каждый образец массой 0,3 г гомогенизировали в индивидуальном пластиковом пакете с добавлением экстрагирующего буфера в соотношении 1:10.

В лунки микроплат вносили экстракт каждого тестируемого образца по 100 мкл в двухкратной повторности. Микроплаты инкубировали в течение 16-18-ти часов при 4-6єС (в холодильнике). Затем осуществляли промывку с помощью вошера PW 40 (при второй промывке промывающий буфер находился в лунках микроплат по 3 минуты).

3. Конъюгация. В лунки микроплат вносили поликлональные антитела, связанные с энзимом, разведенные в конъюгатном буфере в соотношении 1:100 по 100 мкл. Микроплаты инкубировали в течение 2-х часов при 37єС, затем осуществляли трехкратную промывку.

4. Субстратная реакция. В каждую лунку вносили р-нитрофенилфосфат, растворенный в субстратном буфере по 100 мкл. Микроплаты инкубировали при 37єС и считывали результаты через 1 и 2 часа инкубации. Изменение цвета свидетельствовало о наличии вирусов в исследуемых образцах.

5. Регистрация результатов проводилась на автоматическом ридере PR2100 при длине волны 405 нм (А05). О зараженности исследуемых образцов судили по значениям оптической плотности анализируемых образцов (А0) по сравнению с аналогичными показателями для отрицательного контроля (Ак). Положительными считали образцы, значение оптической плотности которых на 50% и более превышало среднюю оптическую плотность отрицательного контроля (А0?Ак+50%). Отрицательными считали образцы, значение оптической плотности которых ниже Ак+50%. Десятикратное превышение положительного контроля над отрицательным давало основание делать вывод о достоверности результатов тестирования. Для каждой отдельной микроплаты использовался свой положительный и отрицательный контроли.

Для удобства анализа полученных результатов нами использовался показатель индекс зараженности (отношение оптической плотности образца (А0) к средней оптической плотности отрицательного контроля (Ак+50%)). Если значение индекса зараженности выше единицы - это свидетельствует о зараженности образца.

1. Основная часть

Содержание вирусов GarCLV и OYDV в растениях-регенерантах, полученных в условиях культуры in vitro, представлено в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 Содержание вируса GarCLV в растениях-регенерантах озимого чеснока, полученных в условиях культуры in vitro

Результаты ИФА показали, что на вирус GarCLV подавляющее действие оказывал Рибавирин в составе питательной среды и условия in vitro. Большинство сортов и форм озимого чеснока (76,5%) после введения их в культуру in vitro на питательную среду, не содержащую в своем составе Рибавирина, были чистыми, индекс зараженности был меньше единицы. Это сорта Грибовский юбилейный, Дубковский, Петровский, Антонник, Зубренок, формы ИО-1, БД-1, МВ-1, МГ-1, МГ-2, МГ-3, МС-1, РФБ-1. Зараженность на данной питательной среде вирусом GarCLV наблюдалась только у сорта Хотимон и форм ВЧ-1, ММ-1, БС-1, индекс зараженности их составил 1,25, 1,21, 1,13 и 1,09 соответственно.

Введение в состав питательной среды Рибавирина в концентрации 10 мг/л способствовало получению 94,1% растений-регенерантов с концентрацией вируса GarCLV ниже порогового значения. Зараженность вирусом GarCLV наблюдалась только у формы ВЧ-1, индекс зараженности составил 1,09.

Увеличение концентрации Рибавирина в составе питательной среды до 20-ти мг/л не привело к увеличению числа оздоровленных сортов и форм озимого чеснока. На данной питательной среде только у 88,2% растений-регенерантов наблюдалась концентрация вируса GarCLV ниже порогового значения. Вирус GarCLV был обнаружен у сорта Грибовский юбилейный и формы ВЧ-1, индекс зараженности равен 1,20 и 1,12 соответственно.

Вирус OYDV оказался более устойчивым по сравнению с вирусом GarCLV к условиям культуры in vitro и к воздействию Рибавирина. На контрольной питательной среде только у форм Хотимон, БД-1, ММ-1, МГ-2, РФБ-1 и сортов Антоник, Зубренок концентрация вируса OYDV была ниже порогового значения. Большинство сортов и форм озимого чеснока на данной питательной среде были заражены вирусом OYDV. Это сорта Грибовский юбилейный, Дубковский и Петровский, индекс зараженности их был равен 4,36, 1,13 и 1,14 соответственно. Индекс зараженности форм озимого чеснока ВЧ-1, ИО-1 , МВ-1, МГ-1, МГ-3, МС-1 и БС-1 составил от 1,23 до 2,97 .

Питательная среда, содержащая в своем составе Рибавирин в концентрации 10 мг/л, способствовала получению только 47% растений-регенерантов с концентрацией вируса OYDV ниже порогового значения. Зараженность вирусом OYDV наблюдалась у сортов Дубковский, Антоник и форм ВЧ-1, ИО-1, МВ-1, МГ-1, МГ-3, МС-1, БС-1. Индекс зараженности составил от 1,13 до 4,48.

Таблица 2 Содержание вируса OYDV в растениях-регенерантах озимого чеснока, полученных в условиях культуры in vitro

Увеличение концентрации Рибавирина в составе питательной среды до 20-ти мг/л уменьшило количество сортов и форм озимого чеснока с концентрацией вируса OYDV ниже порогового значения. Вирус OYDV не был отмечен у сортов Петровский, Антонник и форм БД-1, МГ-1, МС-1, БС-1 и РФБ-1. Индекс зараженности вирусом OYDV у сортов Грибовский юбилейный, Дубковский и Зубренок был равен 1,22, 1,21 и 1,13 соответственно. Зараженность вирусом OYDV была установлена у форм Хотимон, ВЧ-1, ИО-1, ММ-1, МВ-1, МГ-2, МГ-3, индекс зараженности составил от 1,13до 2,80.

Заключение

Результаты исследований показали, что использование культуры in vitro без химиотерапии для оздоровления озимого чеснока от вирусных заболеваний целесообразно только в отношении вируса GarCLV. Данные условия способствовали получению 76,5% растений-регенерантов с концентрацией вируса GarCLV ниже порогового значения. На вирус OYDV данные условия не оказали подавляющего действия, только 41,2% растений-регенерантов имели концентрацию вируса OYDV ниже порогового значения.

Концентрация Рибавирина 10 мг/л в составе питательной среды привела к подавлению вируса GarCLV у 94,1% растений-регенерантов. Однако данный состав питательной среды на вирус OYDV существенного влияния не оказал, только 47% растений-регенерантов имели концентрацию вируса OYDV ниже порогового значения.

Питательная среда, содержащая в своем составе Рибавирин в концентрации 20 мг/л, также не повлияла на зараженность растений-регенерантов вирусом OYDV. Только у 41,2% регенерантов наблюдалась концентрация вируса OYDV ниже порогового значения. В отношении вируса GarCLV данный состав питательной среды привел к получению 88,2% оздоровленных растений-регенерантов.

Вероятно, для подавления вируса OYDV необходимо использование более высокой концентрации Рибавирина.

Литература

1. Ершов, И.И. Лук. Чеснок / И.И. Ершов. - М.: Московский рабочий, 1978. - 128 с.

2. Житенева, Н.Е. Лук и чеснок / Н.Е. Житенева. - Свердлов, 1951. - 36 с.

3. Лазарев, А.М. Болезни лука и чеснока при хранении / А.М. Лазарев // Овощеводство и тепличное хозяйство. - 2006. - №2. - С 82-83.

4. Суркова, О.Ю. Анализ распространения вредоносности, этиологии вирусных и вирусоподобных болезней красной и черной смородины и разработка мер борьбы с ними в средней полосе России: автореф. дис. … канд. с.-х. наук: 06.01.11 / О.Ю. Суркова; Всерос. селекц.-технол. ин-т садоводства и питомниководства. - М., 1994. - 20 с.

5. A comparison between the relative abilities of ELISA, RIA and ISEM to detect blueberry shoestring virus in its aphid vector / J.M. Gillet [et al] // Acta Horticulturae. - 1982. - Vol. 129. - P. 25-29.

6. Bong, J.K. Survry of Garlic Virus Disease and Phylogenetic Characterization of Garlic Viruses of the Genus Allexivirus Isolated in Korea/ Bong Jin Koo, Sang-GuKkang, Moo Ung Chang // Plant Pathol. J. - 2002. - № 18 (5). - P. 237-243.

7. Conci, V.C. Filamentous viruses of garlic in Argentina / V.C. Conci,S.F. Nome // Plant Dis. - 1992. - № 76 - P. 594-596.

8. Fajardo, T.V. M. Garlic Viral complex: indentification of Potyviruses and Carlavirus in central Brazil / T.V.M. Fajardo, M. Nishijima, J.A. Buso // Fitopatol. Bras. - 2001. - V. 26, № 3. - P. 26-35.

9 Helguera, M. Advances in the purification of filamentous viruses from garlic and in antisera production / M. Helguera, P.A. Lunello // Acta Hortic. - 1997. - Vol. 433. - P. 623-630.

10. Lunello, P. Distribution of Garlic Virus a in Diferent Garlic production Regions of Argentina / P. Lunello, F. Bravo-Almonacid, K. Kobayashi // Journal of Plant Pathology. - 2000. - V. 82, № 1. - P. 17-21.

11. Mavric, I. A carlavirus serologically closely related to Carnation latent virus in Slovinia garlic / I. Mavric, M. Ravnikar // Acta agriculturae Slovenica. - 2005. - V. 85, №2. - P. 343-349.

12. Shahraeen, N. Survey for viruses infecting onion, garlic and leek crops in Iran / N. Shahraeen, D. E. Lesemann, T. Ghotbi // The Authors. Journal compilation. - 2008. - № 38. - P. 131 - 135.

13. Yamashita, K. Characterization of a New Virus from Garlic (Allium sativum L.), Garlic Mite-borne Mosaic Virus / Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. - 1996. - V. 62. - P. 483-489.

Размещено на Allbest.ru