Контроль качества семян ячменя на основе электрофореза гордеинов в аспектах новой методики определения

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Контроль качества семян ячменя на основе электрофореза

гордеинов в аспектах новой методики определения

С. В. ЕГОРОВ

В статье приводятся результаты, полученные в ходе разработки новой методики электрофореза белков семян ячменя.Авторами детально проанализированы наиболее распространенные методики, определены положительные и отрицательные позиции, сформирован улучшенный алгоритм всех рабочих процедур. Показано, что на основе новой методики возможна оценка близких по генетике форм. Рекомендовано использование методики в области государственной сертификации семян.

The article presents results of development of new methods of electrophoresis of barley seeds proteins. We have analyzed in detail the most widely spread methods, determined positive and negative positions, formed improved algorithm of all operating procedures. We have shown that it is possible to estimate forms with similar genetic features on the basis of new methods. We recommend using the methods in the sphere of state certification of seeds.

Введение

В современных условиях ведения работ в области семеноводства, контроля и мониторинга за качеством семенного материала одну из ключевых позиций занимает проблема точной и максимально независимой от нерегулируемых внешних факторов среды процедуры оценки качества. В первую очередь это относится к оценке сортовых качеств семян, алгоритмам идентификации сортов, поскольку именно от этого во многом зависят все другие качественные показатели, присущие конкретному сорту. Без четкой, точной и объективной процедуры контроля сортовых качеств семян невозможно получить отдачу от сорта, невозможно гарантировать отдачу от вложенных в семена ресурсов. Именно поэтому в последние годы в областях науки, близких к проблематике оценки качества сельскохозяйственной продукции, активно проводятся работы по разработке, апробации и практическому внедрению новых, адаптированных к условиям сельскохозяйственного производства методов. Одним из наиболее перспективных в этом плане представляется метод, основанный на оценке внутренней генетической структуры сорта (гибрида) при помощи генетико-молекулярных маркеров.

Для этих целей разработаны методы электрофоретического анализа, включающие оценку качества семян на основе получения белковых спектров. Сортовая специфичность спектров определяется набором компонентов, кодируемых соответствующими аллелями одного гена. По спектру компонентов полиморфного белка идентифицируют сорта, биотипы и линии.

Метод электрофореза широко используется в сортовом контроле, идентификации семян на сортовую принадлежность, определении сортовой чистоты и генетической конституции, характеризуемой составом и частотой встречаемости биотипов в структуре сорта. В семеноводстве с использованием электрофореза ведется проверка типичности при отборе лучших растений; проверка генетической однородности лучших семей и выбраковка расщепляющихся; выяснение природы нетипичных растений для подготовки рекомендаций апробаторам; контроль на наличие спонтанного переопыления или механического засорения.

Разработка подобных методик оценки качества семян, их практическое внедрение на сегодняшний день ведется целым рядом центров и лабораторий, однако, несмотря на имеющиеся практические результаты, остается еще целый ряд моментов, требующих детального анализа и отработки применительно к современным задачам семеноводства и контроля качества.

Цель работы _ отработка и формирование методики оценки качества семян ячменя на основе электрофореза гордеинов для целей практической реализации в области государственного контроля качества семян в Республике Беларусь. гордеин семена ячмень электрофорез

Анализ источников

С 1922 г. вся мировая активность в области семенного контроля объединяется под эгидой ISTA (Международная ассоциация по испытанию семян). Одной из главных задач функционирования данной международной структуры является разработка и практическая реализация стандартных процессов (методов) отбора образцов и испытания семян, а также обеспечение единообразного применения таких процессов для оценки семян в международном масштабе [10].

В 1980 г. методы, разработанные Всероссийским научно-исследовательского институтом растениеводства им. Н. И. Вавилова (ГНЦ РФ ВИР) в области использования белков семян для целей сортовой идентификации, были рекомендованы 19-м конгрессом ISTA к использованию в семеноводстве и семенном контроле [6].

Основным методом оценки генетической конституции семян, сортовой принадлежности, гибридности материала служит электрофоретический анализ запасных белков, который сегодня по праву можно назвать универсальным методом контроля качества семенной продукции [4, 5]. Данный анализ позволяет определять качество гибридного материала, и особенно синтетических сортов, представляющих собой многолинейные гибриды. Проверка этим методом проводится с фазы молочно-восковой спелости зерна и позволяет достаточно точно выявлять степень гибридности семян, не допуская прием семян с низкими биологическими качествами [7].

Эффективность использования электрофореза белков в сортовом контроле определяется воспроизводимостью и возможностью стандартизации метода [2].

Идентификация сортов, линий и гибридов сельскохозяйственных растений является неотъемлемым элементом селекции и семеноводства. Она обеспечивает защиту авторских прав селекционных учреждений, позволяет следить за чистотой сорта и соответствием его известному стандарту (аутентичному образцу) [3]. Для большинства культур уже составлены эталонные спектры (т. е. суммарные спектры, полученные на основе сравнительного анализа спектра запасных белков, выявленных на большом количестве сортов конкретной культуры) [8, 9].

На основе эталонных спектров элиты учреждения-оригинатора на этапе районирования составляются каталоги и биохимические паспорта сортов, что является чрезвычайно актуальным для селекции, семеноводства и защиты авторских прав. Такая работа активно ведется в Беларуси в сортовом контроле, а в России и на Украине _ в сортоиспытании [3, 8, 11, 12].

В Лаборатории генетики растений ИОГен [8] составлен каталог вариантов гордеинов, контролируемых аллелями локусов Hrd A, Hrd B и Hrd F, для сортов ячменя, внесенных в Государственный реестр, позволяющий определять их чистоту и подлинность в процессе семеноводства при использовании метода электрофореза запасных белков.

На пшенице подобные исследования велись в более широком масштабе. Еще в 1980 г. были созданы каталоги блоков глиадинкодирующих аллелей на основе электрофореза белков в крахмальном геле [11, 12, 13].

Е. В. Метаковским [11, 12] был составлен подобный каталог для озимой пшеницы на основе результатов применения стандартного полиакриламидного геля с модификациями.

В условиях современного рынка, когда семенной материал нередко поступает из других государств, метод очень эффективен для повышения качества ввозимых семян. Обоснована универсальность метода для целей стандартизации, семеноводства и сортового контроля. Использование метода позволяет вести отбор на генетическую однородность и поддерживать состав биотипов в полиморфных сортах [1, 5].

Методы исследования

В качестве метода исследований использовался электрофоретический анализ белков семян.

Разработка и апробация методики проводилась на базе Испытательной лаборатории качества семян УО БГСХА, соответствующей критериям Национальной системы аккредитации Республики Беларусь и международным требованиям по СТБ ИСО/МЭК 17025-2007 (Аттестат № BY/112 02.1.0.0425 от 15.03.2004 г.).

Отработка алгоритма процедурных элементов методики, критериев идентификации белковых компонентов спектра проводилась с использованием обновленной, модернизированной и поверенной (аттестованной) приборно-технической базы Испытательной лаборатории качества семян. С целью точной оценки дифференцирующих позиций (зон) спектра гордеинов, оценки молекулярных масс белков использовались стандартные маркер-растворы белков «ThermoScientific» -UnstainedProteinLadder (диапазон 51-12 кДа, число идентифицируемых белков -8).

Основная часть

К настоящему времени для целей идентификации сортов ячменя на основе метода электрофореза запасных белков отработан ряд методик, имеющих как сходные, так и отличительные позиции по процедурным элементам анализа и по принципам интерпретации конечного результата -белкового электрофоретического спектра гордеина. Следует отметить, что наряду с положительными моментами данные методики характеризуются и рядом ограничений, связанных либо с использованием высокотоксичных реагентов, либо с недостаточной разрешающей способностью результатов анализа. Все это создает предпосылки для дальнейшего поиска и разработок вариантов методик, максимально приближенных к специфике и требованиям современного контроля семян. С этой целью на основе имеющихся в Испытательной лаборатории качества семян УО БГСХА практических наработок в области биохимического маркирования генотипов растений были взяты для целей апробации и изучения три основные методики: методика ISTA (Международной ассоциации по контролю за качеством семян); методика, разработанная Всероссийским институтом растениеводства им. Н. И. Вавилова (ВИР); методика, созданная в Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (ИОГен), получившая наибольшее распространение в РФ, странах СНГ и за рубежом.

В ходе оценки методик, отработки наиболее приемлемого алгоритма процедурных элементов разрабатываемой методики были детально проанализированы все позиции, начиная от процедур пробоподготовки и экстракции, заканчивая принципами идентификации белковых компонентов спектра. По результатам сравнительного анализа всех процедур и в первую очередь - результативности анализа для целей идентификации сорта и выявления внутренней структуры популяции были сформированы унифицированные алгоритмы, сочетающие положительные элементы проанализированных методик.

Методика ВИР им. Н .И .Вавилова:

- Экстрагирующий агент:6М мочевина.

- Экстрагирование при комнатной tє (или в течение ночи в холодильнике).

- Рабочий буфер - ацетатный, рН=3,1.

- Гелевый носитель - акриламид - 6,5 %; акриламид / бисакриламид - 38:1; мочевина 4М.

- Инициатор полимеризации - персульфат аммония + ТЕМЕД.

- Ступени электрофоретического разделения белков - префорез (20 мА/гель * 1,5-2,00 часа); основной электрофорез - ступенчатый (1час - 300В; 4,5-5,0 часов - 580В).

- Алгоритм идентификации компонентов - по эталонному спектру (зоны БП,Ь, в, ц, щ).

Методика ISTA:

- Экстрагирующий агент:2 - хлорэтанол, 18 % мочевина, 1 % в-меркапто-этанол. Экстракция не менее 1 часа при комнатной tє.

- Рабочий буфер - глицин-ацетатный, рН=3,2.

- Гелевый носитель - акриламид - 6,5 %;акриламид / бисакриламид - 18:1.

- Инициатор полимеризации - персульфат аммония.

- Ступени электрофоретического разделения белков - одноступенчатый (3,0-3,5 ч - 90мА/гель).

- Алгоритм идентификации компонентов - по относительной электрофоретической подвижности относительно стандартного сорта.

Методика ИОГен им. Н.И.Вавилова РАН:

- Экстрагирующий агент:70 %-ый этанол.Экстракция 1 час при tє = 40 єС.

- Рабочий буфер - алюминий - лактатный, рН=3,2.

- Гелевый носитель - акриламид - 8,3 %; акриламид / бисакриламид - 20:1.

- Инициатор полимеризации - перекись водорода.

- Ступени электрофоретического разделения белков _ многоступенчатый (10 мин. - 50В; 10 мин. - 100В; 10 мин. - 150В; 3,0-3,5 ч - 550В).

- Алгоритм идентификации компонентов - по гордеинкодирующим локусам.

Методика ИЛ качества семян:

- Экстрагирующий агент:50 %-ый этанол.Экстракция 1 час при tє = 40 єС (в течение 8 часов при охлаждении).

- Рабочий буфер - аллюминий-лактатный, рН=3,2.

- Гелевый носитель - акриламид - 13,0 %; акриламид / бисакриламид - 19:1.

- Инициатор полимеризации - перекись водорода.

- Ступени электрофоретического разделения белков - многоступенчатый (10 мин. - 50В; 10 мин. - 100В; 10 мин. - 150В; 3,0-3,5 ч - 550В).

- Алгоритм идентификации компонентов - по относительной электрофоретической подвижности относительно лидирующего красителя.

При разработке и апробации операций для формируемой методики определения нами за основу были взяты сходные позиции в процессах приготовления буферного раствора, раствора для полиакриламидного геля, раствора для экстракции белка, раствора буфера для разведения маркерной краски, раствора для фиксирования и окраски полученных электрофоретических спектров. В ходе отработки была поставлена задача по поиску оптимального варианта, основанного на наиболее приемлемых позициях оцениваемых методик электрофоретического анализа.

В целом по результатам сравнительной оценки степени сопоставимости получаемых результатов, уровня разрешающей способности электрофоретического спектра было установлено:

- методики имеют отличия по визуальной картине конечного результата - белковому спектру, что может накладывать определенные трудности в ходе использования методик профильными испытательными лабораториями;

- разрешающая способность анализируемых методик находится на разном уровне: наивысшей разрешающей способностью отличается методика ISTA, однако большинство сортоспецифичных и идентификационных критериев определено по спектру, полученному на основе методики ВИР им. Н. И. Вавилова;

- все проанализированные методики имеют ограничения при идентификации генетически близких форм, не имеющих четких белковых маркеров генотипа, что не позволяет использовать их в качестве универсальных в системе процедур сертификации семян.

В проводимых исследованиях одной из базовых позиций являлся выбор концентраций мономеров для геля и принципа идентификации белковых компонентов спектра. Исследование данного вопроса является основополагающим в структуре разработки методики анализа, поскольку предопределяет результативность анализа в целом. Известно, что структура полиакриламидного геля представляет собой ячеистую структуру, благодаря которой молекулы белка не могут двигаться в поперечном направлении. Движение в продольном направлении ограничено двумя факторами: размером белковых молекул (молекулярной массой) и суммарным зарядом. В связи с этим в зависимости от вида фракционируемого белка и обусловленных этим характеристик белковых молекул необходимо точно рассчитать размеры молекулярной «решетки» гелевого носителя. Только в таком случае возможно получение белковых спектров с высокой разрешающей способностью и полноценной картиной распределения соответствующего белкового комплекса (рис. 1).

Рис. 1. Соответствие молекулярной массы фракционируемых белков

и концентраций мономеров полиакриламидного геля

Размер молекулярной «решетки» ПААГ и соответственно разрешающая способность получаемых белковых спектров зависит от двух величин: Т- отношение массы мономеров (акриламид + бисакриламид) к суммарному объему их раствора, С- отношение массы метиленбисакриламида к общей массе обоих мономеров.

В результате исследований достоверно установлено, что использование гелевого носителя с непропорционально подобранными мономерами дает искаженную картину распределения белковых компонентов в структуре геля.

Кроме этого, как установлено результатами исследований, выбор величин Т и С детерминируется механическими и адсорбционными свойствами гелевого носителя. В целом, основываясь на данных по молекулярной массе исследуемых запасных белков-гордеинов (от 12 кДа по зоне быстрых проламинов до 98 кДа в зоне медленных), можно констатировать, что величина Т должна составлять порядка 13_15 %, величина сшивки С- не выше 2,0 %.

Конечным результатом анализа является белковый электрофоретический спектр гордеина зерна ячменя, содержащий уникальную идентификационную характеристику каждого проанализированного генотипа сорта (образца). Выявлено, что электрофореграмма сорта (образца) или отдельного генотипа может включать 10-15 белковых компонентов, имеющих градацию как по подвижности в геле (относительной подвижности), так и различную интенсивность окраски, что обуславливается количеством белка в данном компоненте.

Принцип идентификации спектра основан на сопоставлении относительной электрофоретической подвижности оцениваемого белкового компонента и подвижности лидирующего красителя, фронт которого имеет более высокую подвижность, чем самые быстрые проламины ячменя (рис. 2).

Рис. 2. Критерии идентификации белковых компонентов электрофоретического спектра ячменя

В данном случае значение относительной подвижности белкового компонента вычисляют по формуле:

Rf= (Rpr/ Rcol) х 100,

где Rf- относительная подвижность белкового компонента;Rpr - расстояние, пройденное белковым компонентом от стартового кармана геля (мм);Rcol-расстояние, пройденное лидирующим красителем от стартового кармана геля (мм).

Значение Rcol, при оптимальных условиях электрофоретического фракционирования совпадает с размером гелевой пластины, на которой проводят разгонку белка.

Идентифицированные значения относительной подвижности (с коэффициентом равным 100) по отдельным белковым компонентам будут соответствовать порядковому номеру позиции.

Одной из основных характеристик подобных методик является разрешающая способность, т. е. возможность на основе данного метода выявить максимально возможное число генетически обусловленных сортоспецифичных компонентов. Особенно важное значение критерий разрешающей способности имеет в случае оценки сортов (форм, линий, гибридов), имеющих близкую генеалогию или узкую генетическую основу. Последнее особенно актуально при оценке сортов, поступающих из одного учреждения-оригинатора и использующих определенный набор сортов-доноров (источников), включаемых в родословные создаваемых сортов.

Как показали результаты проведенных исследований, 96 % проанализированных сортов ячменя характеризовались наличием от двух до пяти белковых сортоспецифичных маркеров, что является вполне достаточным для четкой и однозначной идентификации сортов и оценки их сортовой чистоты на основе методики (рис. 3).

Рис. 3.Число сортоспецифичных белковых маркеров ячменя, выявляемых с использованием новой методики определения

Кроме этого, идентифицированные белковые маркеры сортов характеризуются принадлежностью к разным зонам (фракциям) белкового спектра, что подтверждается различиями значений их относительной электрофоретической подвижности (Rf) и молекулярной массы (kDa) (таблица).

Градация сортоспецифичных компонентов электрофоретического спектра по величинам подвижности (Rf) и молекулярной массе (kDa)

Для более полной оценки разрешающей способности методики были проведены сравнительные испытания сортов ячменя, не имеющих четких отличий по белковым электрофоретическим маркерам с использованием имеющихся методов (рис. 4).

Проведенная оценка позволила установить, что на основе разработанной унифицированной методики определения с полной достоверностью возможно проведение идентификации сортов ячменя, характеризуемых близкими или одинаковыми белковыми профилями, определяемыми по другим методикам.

Примечание: 12: ячмень Ксанаду (методика ISTA);

2_4: ячмень Беатрис (методика ISTA);

5_6: ячмень Ксанаду (разработанная методика);

7_8: ячмень Беатрис (разработанная методика);

*_ дифференцирующие компоненты спектра.

Рис. 4. Разрешающая способность методики в оценке генетически близких сортов ячменя

Как наглядно свидетельствуют результаты, разрешающая способность новой методики позволяет получить от одного (Ксанаду) до трех (Беатрис) белковых маркеров не только сорта, но и белковых биотипов внутри сорта.

В целом по результатам практической апробации, разработанной на базе аккредитованной Испытательной лаборатории качества семян методики оценки сортовых качеств семян ячменя, осуществляемой в рамках испытаний проб семян, можно сделать вывод о том, что внесенные в существующие методики изменения являются улучшающими модификациями в части приготовления экстракта гордеинов, рабочих растворов геля, целого ряда рабочих процедур анализа, способа визуальной идентификации и интерпретации полученных белковых спектров. Все это позволяет рекомендовать разработанную методику в качестве рабочей для использования профильными испытательными центрами в области сертификации семян и мониторинга качества.

Заключение

По результатам сравнительной оценки наиболее распространенных методик электрофоретического анализа семян зерновых культур сформированы унифицированные, оптимальные рабочие алгоритмы методики определения.

Проведенные испытания позволяют получить хорошую воспроизводимость результатов и гарантируют достоверность показателей.

Сформированные унифицированные позиции по процедуре идентификации и интерпретации структурных компонентов белкового спектра ячменя могут быть использованы для оценки внутренней гетерогенности сортов.

Разработанная методика определения позволяет получить высокую степень разрешающей способности, в том числе и по генетически близким сортам.

Применение унифицированного метода оценки позволяет четко идентифицировать маркеры сортов ячменя для целей сортового контроля и сертификации.

Литература

1. Дуктова, Н. А. Сравнительная оценка методов идентификации сортов зерновых культур/ Н.А.Дуктова, С. В.Егоров, Е.В.Егорова//Земляробства i ахова раслiн. - 2011. - № 2. - С. 3-6.

2. Никифоров, А.Д. Основы стандартизации / А.Д. Никифоров, Т.А. Бакиев. - М.: Высш. шк., 2003. - 421 с.

3. Малышев, В. С.Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК-маркеров: метод. реком. / В.С. Малышев, О.Ю. Урбанович, Н.А. Картель. - Минск: ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», 2006. - 27 с.

4. Конарев, А. В. Адаптивный характер молекулярного полиморфизма и его использование в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции/ А.В.Конарев // Аграрная Россия. -2002. - № 3. - С. 4-44.

5. Конарев, А. В. Использование молекулярных маркеров в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции/ А. В. Конарев // Аграрная Россия. 2006. №6. С.4 -22.

6. Конарев, В.Г. Молекулярно-биологические исследования генофонда культурных растений в ВИРе (1967-2007 гг.). Изд. 2-е доп.; (сост.: В.В. Сидорова, А.В. Конарев). СПб.: ВИР, 2007. - 134 с.

7.Павлов, А. Н. Глиадины зерновки пшеницы в процессе их развития / А.Н. Павлов, Г.И. Колесник, И.Ф. Шаяхметов // Физиология растений. - 1975. - Т.22. - Вып.I. - С. 80-84.

8. Поморцев, А. А. Идентификация и оценка сортовой чистоты семян ячменя методом электрофоретического анализа запасных белков зерна (теория вопроса, методика электрофореза, каталог электрофореграмм современных сортов ячменя, допущенных к использованию в Российской Федерации) / А.А. Поморцев, Е.В. Лялина. - М.: Изд-во МСХА, 2003. - С.85.

9. Федулова, Т. П. Информационные технологии в селекции / Т.П. Федулова // Сахарная свекла. - 2005. -№ 8. -С. 17 - 18.

10. International Rules for Seed Testing / International Seed Testing Association, 1996 // Seed Sci. Technol. Suppl.24.

11. Metakovsky, E.V. et al., 1984. Bloks of gliadin components in winter wheat detected by one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Theor. Appl. Genet., 67: 559-568.

12. Metakovsky, E.V., 1991. Gliadin allele identification in common wheat. II. Catalogue of gliadin alleles in common wheat / J. Genet. and Breed. 45: 325-344.

13. Sozinov, A.A. and Poperelya, F.A., 1980. Genetic classification of prolamines and its use for plant breeding. Ann. Technol. Agric., 29: 229-245.

Размещено на Allbest.ru