Анализ запасных белков семян сортообразцов галеги восточной

Размещено на http://www.allbest.ru/

Анализ запасных белков семян сортообразцов галеги восточной

М.Н. Авраменко

В.И. Бушуева

Галега восточная, как ценная высокобелковая кормовая культура, все шире внедряется в сельскохозяйственное производство Республики Беларусь. В связи с этим актуальной проблемой селекции является создание более высокоурожайных сортов, адаптивных к возделыванию в конкретных почвенно-климатических условиях. Результативность селекционной работы по созданию таких сортов во многом зависит от эффективности применяемых методов оценки исходного материала в питомниках селекционного процесса [1]. Наряду с оценкой в полевых условиях, где выделение более продуктивных генотипов по фенотипу осложняется действием факторов внешней среды, в селекционной практике получил признание метод электрофоретического анализа запасных белков семян, позволяющий выявить нужные генотипы по спектру компонентов полиморфного белка. Этот метод дает возможность по разнообразию спектров выделить нужный генотип, установить сопряженность с ним хозяйственно-полезных признаков и провести эффективный отбор более ценных селекционных форм [2, 3, 4].

Анализ источников

Метод электрофоретического анализа запасных белков семян широко применяется для решения актуальных проблем прикладной ботаники, генетики, семеноводства и селекции [2, 4, 7]. Основой метода является идентификация белков, выявление их полиморфизма и специфичности. Наиболее ярко выраженной специфичностью обладают запасные белки [7]. Белки семян используют в качестве генетических маркеров, характерных только для определенного рода, вида, сорта или биотипа. Для каждого белкового маркера свойственна своя биологическая специфичность по структуре спектра компонентов, которая не изменяется в зависимости от почвенно-климатических и экологических факторов, условий и сроков хранения семян. Это позволяет ботаникам и генетикам точно и объективно определять видовую и сортовую принадлежность растений, происхождение сортов и наличие между ними родственных связей [4]. Электрофоретический анализ запасных белков позволяет дать генетическую оценку качества семян, установить их сортовую подлинность и чистоту, распознать видовые и сортовые примеси, не отличающиеся по морфологическим признакам. При отборе родоначальных растений для закладки питомников оригинального семеноводства можно точно определить их типичность и генетическую однородность.

В селекционном процессе метод успешно применяется для генетической оценки исходного материала, выделения и маркирования линий в питомниках селекционного процесса, проведения ускоренного отбора лучших генотипов и создания на их основе новых сортов с программируемыми признаками и свойствами. Широкое применение получил метод в Государственном сортоиспытании для оценки сортов на патентоспособность по критериям новизны, отличимости и однородности [4].

Весьма эффективно метод электрофоретического анализа запасных белков семян применяется для идентификации сортов у различных культур [5].

В настоящий период хорошо налажена идентификация сортов у зерновых культур, по которым разработаны эталоны электрофоретических спектров запасных белков «проламинов»: глиадина пшеницы, гордеина ячменя, секалина ржи, авенина овса [2, 4].

Благодаря электрофоретическому анализу запасных белков «зеинов» проводится контролирование уровня гибридности семян кукурузы, что позволяет повысить качество ввозимых партий при международной торговле [5, 6].

У зернобобовых культур и многолетних бобовых трав (клевер, люцерна, галега восточная, донник) в сортовой идентификации широко используется полиморфизм запасных белков «глобулинов»- вицилина и легумина. На основании многочисленных исследований Всероссийским научно-исследовательским институтом растениеводства им. Н.И. Вавилова уже разработаны стандартные спектры полипептидов семян сои, бобов, различных видов люпина, люцерны, клевера лугового [2]. Следует отметить, что по галеге восточной в литературе отсутствует информация о проведении исследований в этом направлении. В селекционной практике этим методом В.И. Бушуевой [9] проведена оценка исходного материала для селекции клевера лугового и галеги восточной, в результате которой по обеим культурам были выделены источники генетической изменчивости.

Целью наших исследований было провести электрофоретический анализ запасных белков семян лучших сортообразцов галеги восточной в конкурсном испытании, установить между ними генетические различия и выявить их внутрисортовой полиморфизм.Объектами исследований служили новые сортообразцы галеги восточной: СЭГ-1,СЭГ-2, БГСХА-2, КВ-Т, БГСХА-КБ, - созданные на кафедре селекции и генетики УО БГСХА.

Методы исследования

Электрофоретический анализ запасных белков семян галеги восточной проводили на приборе SЕ-250 фирмы GEHealthcare(Англия) в Испытательной лаборатории качества семян УО БГСХА, аккредитованной на соответствие требованиям СТБ ИСО/МЭК 17025-2007, с использованием методики «Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян» [7]. В качестве стандарта использовали исключительно стабильный спектр семян культурной сои.

Белки из семян для электрофореза экстрагировали трис-HCL буфером, рН 6,8, содержащим глицин, сахарозу в растворе дистиллированной воды. Элетрофорез белков галеги восточной проводили в гелевом носителе, приготовленном по методу Лэммли [8],с использованием 10 % разделяющего ПААГ [2, 8].

Идентификация сорта, а также определение степени внутрисортового полиморфизма включали позерновой анализ отдельных семян, взятых из случайной выборки. Для детального анализа биотипного состава сортообразцов, оценки уровня генетического полиморфизма, оценки его чистоты и генетической конституции с большей точностью анализировали 100 семян. Идентификация белковых компонентов электрофоретического спектра позволила получить белковый электрофоретический спектр глобулинов семян галеги восточной. Как правило, электрофореграмма сортообразца включала 25-50 белковых компонентов, имеющих как градацию по подвижности в геле (относительной подвижности), так и различную интенсивность окраски, что обусловлено количеством белка в данном компоненте.

Электрофоретический спектр характеризовался визуально по параметрам относительной подвижности (Rf), т.е. местоположению белкового компонента на дорожке электрофоретического спектра одного семени относительно стартовой позиции и интенсивности окрашивания компонентов (степени выраженности).

Компонент - единица, отраженная в электрофоретическом спектре в качестве белковой полосы, детерминированная кластером генов и представленная множественными аллелями разной интенсивности (слабый, нормальны и сильный). Визуально компонент представлен в виде концентрированных полос, состоящих из молекул полипептида с одинаковым значением молекулярных масс (кДа).

Для точного определения молекулярной массы белковых фракций спектра использовался набор стандартных маркеров с известными массами в диапазоне 14,4-116,0 кДа (производитель -«Sigma-Aldrich»). Для сравнительной оценки сортоообразцов галеги восточной использовалась электрофореграмма белков семян сорта Нестерка.

Оценка молекулярной массы фракций проводилась с использованием построенного калибровочного графика по величинам lgM маркера и величинам Rfоцениваемых компонентов (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка в полулогарифмической системе координат: 1 - сывороточный альбумин; 2 - яичный альбумин; 3 - пепсин; 4 - химотрипсиноген; 5 -миоглобин; 6 -цитохром с; Х-фракция белка с неизвестной молекулярной массой

Идентификация белковых компонентов электрофоретического спектра позволила получить электрофоретический спектр глобулинов зерна многолетних трав. Электрофореграмма сорта включала 25-50 белковых компонентов, имеющих градацию по подвижности в геле, а также различную интенсивность окраски, что обусловлено количеством белка в данном компоненте.

Электрофоретический спектр характеризовался визуально по параметрам относительной подвижности (местоположение белкового компонента относительно стартовой позиции - кармана гелевой пластины) и степени интенсивности компонентов от 10 до 120 позиций с градацией на зоны спектра.

Для оптимизации процедуры идентификации отдельных компонентов спектра использована оценка с учетом необходимости регистрации полипептидов с молекулярными массами от 15 до 80 кДа. Для определения масштаба шкалы использовали набор стандартных метчиков молекулярных масс, производимых компанией Sigma - БСА (65 кДа), для позиции 22, яичный альбумин (45 кДа) - 37, химотрипсиноген (25 кДа) - 65 и миоглобин (17,5 кДа) - для 108 позиции белкового спектра.

Именно эти позиции могут быть использованы в качестве реперных для отсчета и идентификации остальных компонентов белкового спектра.

Стандартом служил стабильный спектр семян культурной сои.

1. Для составления сортовых формул использовалитабличный вариант. При написании белковых формул использовали цифровую оценку интенсивности полипептидов: с - очень слабый (следы), 1 - слабый, 2 - интенсивный, 3 - очень интенсивный, 4 - сдвоенный. В сортовую формулу вносились номера тех компонентов, которые имелись в спектре глобулина определенного сортообразца. Сортовыми признаками являлись распространение компонентов по позициям (относительная подвижность) и их степень интенсивности (доза гена).

2. Полученные электрофоретические спектры индивидуальных семян разделяли на группы, имеющие одинаковый компонентный состав, т. е. на биотипы. К одному и тому же биотипу относили спектры с идентичным компонентным составом (как по подвижности, так и по степени интенсивности), а также спектры, незначительно отличающиеся по интенсивности отдельных компонентов.

3. Если сортообразец был полиморфным, т. е. имел несколько типов спектра, то для каждого типа определялась частота встречаемости в анализируемом образце в расчете на стандартную выборку (рис. 2).

Рис. 2. Характер внутри- и межсортового полиморфизма, выявленный по запасным белкам семян галеги-восточной (представлены суммарные спектры выборки семян на основе ПААГ геля)

Примечание: 1,2,3,4 -биотипы образца СЭГ-1; 5,6,7,8, 9 -биотипы образца СЭГ-2; 10,11,12,13,14 -биотипы образца БГСХА-2; 15, 16 -биотипы образца КВТ; 17,18, 19 -биотипы образца БГСХА-КБ; St -белок из семян культурной сои

Проведенный анализ семян галеги в ПААГ-геле показал, что все полипептиды распределены в диапазоне от 14 до 116 кДа. Полипептидные спектры состояли, как правило, из 32-38 компонентов. Спектры белков для удобства были условно разделены на восемь зон. Оценка степени полиморфности сортовых популяций проводилась на основе III, V, VII зон белкового спектра.

Было установлено, что в зоне I (66-110 кДа) у всех сортообразцов четко проявлялся один интенсивно окрашенный и 2-3 компонента средней и слабой интенсивности. Наибольшей изменчивостью обладали легко подвижные компоненты в области от 45 до 65 кДа (зона II), в которой у разных образцов присутствовало от 3 до 5 компонентов. В зоне III (35-40 кДа) выявлено 3-4 ярко выраженных компонента и от 2 до 5 слабоокрашенных. Самыми обедненными по компонентному составу и интенсивности их окрашивания были V, VI, VIIзоны спектра, содержащие белковые фракции с массой 30-31, 28-29 и 25-26 кДа. Вместе с тем именно по этим фракциям нами выявлены наиболее вариабельные компонентные позиции, большая часть из которых является сортоспецифичной. Зоны VII, VIII содержали компоненты с молекулярной массой в диапазоне 19-23 и 14-17 кДа и были представлены в основном белковыми фракциями с сильной и средней степенью выраженности.

В результате анализа спектров электрофореграммы на сортоспецифичность было установлено, что между сортообразцами существуют различия по компонентному составу белка в зависимости от их генотипа. Различия полипептидного состава наблюдались в сортообразце СЭГ-1 (зона III), где отмечено отсутствие полосы 41 кДа и увеличение содержания полос 44, 39 кДа. В сортообразце СЭГ-2 (зона II), в отличие от других исследуемых сортообразцов, имеется дуплет из полипептидов 45, 43 кДа, которых практически нет в других образцах данной электрофореграммы.

Отличительной особенностью электрофореграммы белков семян сортообразцов БГСХА-2, КВ-Т и БГСХА-КБ было появление новой минорной полосы 73 кДа (зона I). У сортообразцов КВ-Т и БГСХА-КБ отмечено также увеличенное содержание полипептидов 25, 30, 32 кДа. Все это подтверждает наличие у сортообразцов межсортовых различий на генетическом уровне. Созданные образцы отличались по генотипу и от стандартного сорта Нестерка.

Внутрисортовой полиморфизм сортообразцов галеги восточной изучался по разнообразию биотипов и различиям в спектрах компонентов белка. Было установлено, что наибольшим разнообразием биотипов характеризовались сортообразцы СЭГ-2 и БГСХА-2, имеющие в структуре сорта по 5 биотипов. Наименее полиморфным был сортообразец КВ-Т, включающий только 2 биотипа. Сортообразцы БГСХА-КБ, как и стандартный сорт Нестерка, состояли из 3-х, а СЭГ-1 - из 4-х биотипов. Данные сортообразцы были отнесены к группе среднеполиморфных.

По спектрам компонентов белка различия между биотипами в большей степени проявились в зонах I (66-110 кДа) и IV (30-31 кДА). Так, у биотипа № 3 сортообразца СЭГ-1 в отличие от других отсутствует ярко выраженная полоса 72 кДа, но присутствуют полосы 30 и 31 кДа. У сортообразца БГСХА-2 биотип №10 отличался от всех других биотипов наличием ярко выраженных полос 27 и 28 кДа. Биотипы сортообразца КВ-Т различались между собой по количеству интенсивно окрашенных компонентов, которых было значительно больше у биотипа №16, чем у биотипа №15. У сортообразца БГСХА-КБ наибольшие различия между биотипами №17, 18 и 19 отмечены по полосам 24, 23 и 22 кДа.

Анализ спектров электрофореграммы сортообразцов галеги восточной СЭГ-1,СЭГ-2, БГСХА-2, КВ-Т и БГСХА-КБ показал, что они различаются между собой по компонентному составу белка. У сортообразца СЭГ-1 различия выявлены в полипептидном составе (зона III), характеризующиеся отсутствием полосы 41 кДа и увеличением содержания полос 44, 39 кДа. Сортообразец СЭГ-2 (зона II) отличается от других сортообразцов дуплетом из полипептидов 45, 43 кДа. Отличительной особенностью сортообразцов БГСХА-2, КВ-Т и БГСХА-КБ является появление у них новой минорной полосы 73 кДа (зона I). Наряду с этим у сортообразцов КВ-Т и БГСХА-КБ отмечено увеличенное содержание полипептидов 25, 30, 32 кДа. Все это является подтверждением того, что сортообразцы галеги восточной СЭГ-1,СЭГ-2, БГСХА-2, КВ-Т, БГСХА-КБ, созданные на кафедре селекции и генетики УО БГСХА, различаются между собой на генетическом уровне и отличаются от сорта стандарта.

На основании анализа структуры биотипного состава и особенностей в спектрах компонентов белка установлено, что изучаемые сортообразцы характеризуются внутрисортовой изменчивостью. Наибольшим внутрисортовым полиморфизмом характеризовались сортообразцы СЭГ-2 и БГСХА-2, имеющие в структуре сорта 5 биотипов. Наименее полиморфным был сортообразец КВТ с двумя биотипами. Средней полиморфностью характеризовались сортообразцы БГСХА-КБ (3 биотипа) и СЭГ-1 (4 биотипа). Различия между биотипами одного и того же сортообразца в большей степени проявились по интенсивности окрашивания компонентов белка. Наибольшая изменчивость по степени выраженности компонентов белка в биотипах отмечена в зонах I (66-110 кДа) и IV (30-31 кДА).

Наличие генетических различий между изучаемыми сортообразцами представляет практическую ценность для дальнейшей селекции галеги восточной. Метод электрофоретического анализа белков семян можно эффективно использовать в селекционном процессе для выделения необходимых генотипов как на сортовом, так и внутрисортовом уровнях.

Литература

полипептидный биотип сортообразец

1. Бушуева, В.И. Галега восточная: монография. 2-е изд., доп. / В.И. Бушуева, Г.И. Таранухо. - Минск: Экоперспектива, 2009. - 204 с.

2. Петрова, Н.Н. Семена бобовых. Определение сортовой принадлежности, сортовой чистоты и генетического качества методом электрофоритического анализа запасных белков: методика определения / Н.Н. Петрова, М.П. Акулич. - Горки,2007. - 24 с.

3. Kaijalainen, S. Choning of nodule-specific cDNAs of Galega orientalis / S. Kaijalainen [et al] // Phyziologia plantatum. - 2002. Vol. 114. №4. - P. 588-593.

4. Таранухо, Г.И. Селекция и семенводство сльскохозяйственных культур: учебник / Г.И. Таранухо. - Минск: ИВЦ Минфина, 2009. - 420 с.

5. Дуктова, Н.А. Оценка родительских линий гибридов кукурузы с использованием метода электрофореза/ Н.А. Дуктова, С.В. Егоров, Т.В. Кардис // Вестник БГСХА. - 2011. - № 1. - С. 72-76.

6. Семена кукурузы. Метод определения уровня гибридности семян первого поколенияоценка типичности и маркированние инбредных линий: СТБ 1710-2006утв. и введ. в действие, Постановлением Госстандарта Республики Беларусь от30декабря 2006 г. № 66. - Минск, 2006. - 11 с.

7. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян/ Под ред. В.Г. Конарева. - СПб., 2000. - С. 98-109.

8. Laemmly, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4 // Nature. - 1970. -Vol. 227. - P. 680-685.

9. Бушуева, В.И. Электрофоритический анализ запасных белков семян сортообразцов клевера лугового и галеги восточной / В.И. Бушуева // Вестник БГСХА. - 2009. - № 2. - С. 73-78.

Размещено на Allbest.ru