Прикладные аспекты структурной и функциональной геномики растений (на примере родов vicia l. и hordeum l.)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Прикладные аспекты структурной и функциональной геномики растений (на примере родов vicia l. и hordeum l.)

Специальности: 03.01.15 - генетика 03.00.05 - ботаника

Потокина Елена Кирилловна

Санкт-Петербург 2008

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Нуклеотидные вставки, делеции, а также нуклеотидные замены определяют разнообразие аллелей большинства генов. В этой связи главным объектом исследований генетики и прикладной ботаники становится разнообразие генетических ресурсов растений, выявляемое на уровне ДНК. Полиморфизм ДНК в масштабе целого генома можно изучать, опираясь на информацию о нуклеотидной последовательности всей геномной ДНК (полное секвенирование геномов) или, используя альтернативную технологию молекулярного маркирования.

В большинстве случаев молекулярные маркеры, используемые для анализа внутривидового и межвидового разнообразия у растений (RFLP, RAPD, AFLP, SSR), представляют собой анонимные ДНК-фрагменты, отражающие полиморфизм участков генома, выбранных случайным образом (Varshney et al., 2004). Репрезентативное количество идентифицированных с их помощью полиморфных геномных локусов и относительная простота лабораторных процедур позволяют эффективно использовать эти маркеры при оценке геномного сходства близкородственных таксонов культивируемых видов и решении вопросов таксономии. В настоящей работе возможности методов молекулярного маркирования при решении спорных вопросов систематики культурных растений и оптимизации коллекций генных банков проанализированы на примере видов Vicia L., представляющих практический интерес как кормовые травы и зернобобовые культуры.

Для целей прикладной генетики и селекции более эффективным является использование не анонимных, а функциональных молекулярных маркеров, которые идентифицируют полиморфизм в транскрибируемых кодирующих последовательностях ДНК - генах (Andersen, Lьbberstedt, 2003). Базовым ресурсом для исследований функциональной геномики являются коллекции EST (Expressed Sequence Tags), представляющие собой секвенированные неполные копии генов, точнее фрагменты кодирующих последовательностей ДНК длиной 500-700 н.п. (Сойфер, 2000). Создание коллекций EST обусловило также развитие чип-технологий, основной задачей которых является сравнительный мониторинг уровня генных транскриптов в экспериментальных образцах. Анализ экспрессии генов с использованием чип-технологий, называют также транскриптомным анализом. По аналогии с геномом, подразумевающим совокупность всех генов организма, говоря о транскриптоме, имеют ввиду совокупность всех генов, которые транскрибируются в данной ткани, на данном этапе развития организма (Spellman et al., 1998). Потенциальное значение транскриптомного анализа для генетико-селекционных исследований очевидно: транскрипция генов является ключевым этапом для последующего белкового синтеза, поэтому изменения в генной экспрессии могут непосредственно влиять на биохимические и физиологические процессы и, как следствие, отражаться на фенотипе.

Среди объектов современных транскриптомных исследований особое место принадлежит ячменю. Усилиями лабораторий разных стран к концу 2002 года были созданы 84 библиотеки кДНК из разных тканей растений ячменя на разных этапах онтогенеза, в результате чего было получено около 350 тысяч EST (Close et al., 2004). На этой базе был создан геночип яменя (Affymetrix 22K Barley GeneChip), позволяющий анализировать экспрессию практически всех известных на сегодняшний день кодирующих последовательностей ячменя. Накопленная обширная научная информация и современные исследовательские ресурсы позволяют перейти к разработке новых методологических подходов для выявления генетических факторов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков, на основе новых технологий функциональной геномики.

Цель исследования. Выявить возможные пути использования достижений современной структурной и функциональной геномики для решения прикладных проблем генетики и ботаники, на примере представителей родов Vicia и Hordeum.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить возможности методов молекулярного маркирования для систематики культурных растений, оценив с их помощью геномное сходство видов Vicia subgenus Vicia и, сравнив полученные результаты с существующими версиями филогенетической системы подрода.

2. Разработать метод оптимизации обширных коллекций ex situ с применением молекулярных маркеров на примере генофонда культурного вида V.sativa.

3. Разработать метод идентификации генов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных фенотипических признаков, на примере признаков пивоваренного качества у ячменя, с помощью транскриптомного анализа. Для этого:

а) в качестве первого этапа создать экспериментальную базу для транскриптомного анализа генотипов ячменя различного пивоваренного качества, сконструировав библиотеки кДНК из тканей прорастающего ячменного семени и, создав на их основе кДНК-макрочип (EST на нейлоновом фильтре);

б) изучить ткане- и стадийно-специфичную активность генов в прорастающем семени ячменя, используя кДНК-макрочип. В ходе исследований получить экспериментальное подтверждение воспроизводимости результатов применяемой кДНК-чип технологии, путем использования альтернативных молекулярно-биологических методов (Нозерн-блоттинг).

в) используя кДНК-макрочип, осуществить транскриптомный анализ генотипов ячменя, различающихся по параметрам солодования и протестировать гипотезу о том, что наблюдаемые различия по пивоваренному качеству могут обуславливаться изменчивостью уровня экспрессии определенных генов-кандидатов.

4. Разработать метод картирования генетических локусов, регулирующих уровень экспрессии возможных генов-кандидатов с использованием техники Real-Time PCR.

5. Разработать стратегию создания функциональных молекулярных маркеров-помощников селекции, выявляющих желательную повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата, детерминирующего изменчивость хозяйственно-ценного признака, для использования селекционной практике.

6. Проанализировать общегеномные закономерности регуляции экспрессии генов ячменя, картировав генетические факторы (eQTL), влияющие на уровень транскрипции генов, используя Affymetrix 22K Barley GeneChip.

Научная новизна. Предложен оригинальный метод классификации внутривидового разнообразия возделываемого вида, сохраняемого ex situ, по результатам молекулярного маркирования генома путем расчета коэффициентов генетической оригинальности образцов (КГО) по Смирнову (1969).

Впервые предложен метод, позволяющий на основе кДНК-чип технологий идентифицировать спектр генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков. В качестве примера идентифицированы возможные гены-кандидаты, влияющие на формирование пивоваренного качества у ячменя.

Разработана методика поиска молекулярного маркера-помощника селекции, выявляющего желательную повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата.

Создана коллекция 27512 EST (секвенированных фрагментов кодирующих последовательностей ДНК), выделенных из тканей семени ячменя на разных этапах прорастания. Нуклеотидные последовательности созданных EST и их функциональные аннотации доступны для пользователей через Интернет (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/cr-est/index.php).

Впервые с использованием микрочипа Affymetrix 22K Barley GeneChip на генетической карте ячменя установлено местоположение 3029 транскрибируемых генов, а также картированы регуляторные локусы для 12987 генов.

Впервые экспериментально показано, что естественный нуклеотидный полиморфизм, существующий между двумя генотипами ячменя, может достоверно влиять на уровень экспрессии более 80% транскрибируемых генов.

Получено экспериментальное подтверждение наличия в геноме ячменя транс-регуляторных локусов, влияющих на транскрипцию не одного, а целого кластера генов. Установлено, что позиции этих транс-регуляторных локусов на генетической карте совпадают с позициями некоторых QTL для параметров пивоваренного качества.

Впервые на примере генома ячменя экспериментально показано, что эффект унаследованных цис-регуляторных мутаций, заключающийся в активировании или ингибировании транскрипции гена, может быть ограничен конкретной тканью или проявляться у потомства по достижении организмом определенной физиологической стадии.

Теоретическая и практическая значимость. Предложенный метод расчета КГО применим к анализу генетического разнообразия возделываемых видов растений, генофонд которых представлен преимущественно местными сортами, сорнополевыми и дикорастущими популяциями, с привлечением любого типа молекулярных маркеров. Практическим результатом его применения является классификация образцов коллекций генбанков по 5-балльной шкале, которая может быть отражена в дескрипторах паспортных баз данных и использована для оптимизации коллекций ex situ.

Метод выявления генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков, основан на гипотезе, что наблюдаемые различия в фенотипе могут обуславливаться вариациями в уровне экспрессии определенных генов. Метод приложим к анализу любого количественного признака, не требует создания экспериментальных популяций, необходимых для рекомбинационного анализа. Метод лишь анализирует генетическое разнообразие, выявляемое среди существующих селекционных линий и сортов, используя возможности кДНК-чип технологий.

Экспериментально показано, что повышенная/пониженная экспрессия гена-кандидата в результате цис-регуляторной мутации, может быть ассоциирована с присутствием определенных аллелей в структурной части гена. Это дает возможность упростить работу селекционера, создав молекулярный маркер, выявляющий желательную повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата для диагностики и скрининга генетического разнообразия, а также маркерной помощи отбору.

Созданная коллекция EST была использована при разработке микрочипа Affymetrix 22K Barley GeneChip, позволяющего анализировать экспрессию практически всех известных на сегодняшний день кодирующих последовательностей ячменя. По результатам экспериментов с Affymetrix 22K Barley GeneChip создан каталог, содержащий информацию о линейной последовательности 3029 транскрибируемых генов на хромосомах ячменя и генетических расстояниях между ними. Полученная генетическая карта Hordeum vulgare является самой насыщенной на сегодняшний день, она позволяет детально изучить синтению хромосом ячменя и риса - вида с секвенированным геномом. Информация о последовательностях генов в соответствующем блоке на физической карте генома риса значительно облегчает задачу клонирования генов у ячменя.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Классификацию внутривидового разнообразия возделываемого вида, сохраняемого ex situ, можно осуществлять при помощи коэффициентов генетической оригинальности образцов по Смирнову, рассчитанными по результатам молекулярного маркирования генома.

2. Используя современные методы функциональной геномики (кДНК-чип технологии), можно идентифицировать спектр генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков.

3. Желательную с точки зрения селекционной практики повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата в результате цис-регуляторной мутации можно маркировать с помощью полиморфных сайтов в структурной части гена.

4. Используя подход «генетической геномики» с применением микрочипа Affymetrix 22K Barley GeneChip, можно локализовать на генетической карте ячменя более 15% генов, транскрибируемых в конкретной ткани. Одновременно, в рамках того же эксперимента можно картировать регуляторные локусы для 80% транскрибируемых генов.

5. Общегеномное картирование регуляторов экспрессии генов ячменя с помощью Affymetrix позволяет локализовать транс-регуляторные локусы, регулирующих транскрипцию целого кластера генов, среди которых могут оказаться также гены, определяющие важные фенотипические характеристики.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны международными грантами Vavilov-Frankel Fellowship, 1999 (IPGRI, Италия); Science and Technology Agency of Japan, 1999 (Цукуба, Япония); BMBF, №0312282, 2001 (GABI-SEED, Германия); BBC5030971, 2005 (BBSRC, Англия).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на X-ой, XII-ой и XV-ой Международных Конференциях “Plant & Animal Genomes” (San-Diego, 2002, 2004, 2007); 3rd UK Cereal Genetics and Genomics Workshop (Norwich, 2006); III-м Съезде ВОГиС “Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития” (Москва, 2004); 9th International Barley Genetics Symposium (Kromeriz, 2004); Plant Genomics European Meetings (Lyon, 2004; Berlin, 2002); 9th International Symposium on Plant Seeds: Seeds in the -omics Era (Meisdorf, 2004); VIII European Society for Agronomy Congress (Copenhagen, 2004); XI-ом Делегатском Съезде Русского Ботанического Общества (Барнаул, 2003); XI-ой Международной конференции “Plant Reproduction: From Mendel to Molecular Biology” (Brno, 2003); 6th Gatersleben Research Conference (Gatersleben, 2002); XVIth EUCARPIA Congress (Edinburgh, 2001); International Symposium "Rudolf Mansfeld and Plant Genetic Resources" (Gatersleben, 2001); 3rd International Crop Science Congress (Hamburg, 2000); 7th MAFF International Workshop on Genetic Resources (Tsukuba, 2000). Результаты диссертации обсуждались на заседании кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного Университета, на семинаре лаборатории кариологии и молекулярной систематики Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН, а также на Вавиловском семинаре ВНИИ растениеводства им.Н.И. Вавилова.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 32 работы, в том числе в зарубежных изданиях - 25.

2. Содержание работы

Материалы и методы исследования

Филогенетический анализ подрода Vicia осуществлялся с использованием 54 образцов 29 видов Vicia, относящихся к секциям Atossa, Hypechusa, Peregrinae, Wiggersia, Vicia, Bithynicae, Narbonensis и Faba sensu Maxted (1995). Образцы получены из коллекций Всероссийского Института растениеводства (ВИР), Института генетики культурных растений Гатерслебена (IPK, Gatersleben, Germany), а также собственных сборов автора, выполненных в период экспедиционных работ 1987-1993 по Кавказу, Крыму и Средней Азии. Возможности методов молекулярного маркирования при идентификации предковой формы возделываемого вида V. faba L. анализировались на материале 46 местных популяций бобов коллекции ВИР, собранных в 1916-1928 годах экспедициями Н.И. Вавилова и его коллег. Методология применения молекулярного маркирования для оптимизации работы с обширными коллекциями генбанков изучена на примере мирового генофонда культурного вида V.sativa (1122 образца).

Суммарные препараты ДНК из листьев Vicia получали стандартным методом CTAB (Williams et al., 1993). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартному протоколу с использованием Taq ДНК-полимеразы (MBI Fermentas, CША). Для RAPD анализа видов Vicia использовали 20 декамерных олигонуклеотидных праймеров. Полиморфизм генов хлоропластной ДНК (rbcL, rpoB, 16S, psaA, trnK) анализировался по протоколу Tsumura et al. (1995). Для обнаружения нуклеотидных замен в хлоропластных генах у видов Vicia, амплифицированная ДНК обрабатывалась отдельно одной из 11 рестриктаз (BamHI, BglII, DraI, EcoRI, EcoRV, HaeIII, MspI, PstI, RsaI, XbaI, XhoI). Процедура AFLP проводилась по методу Vos et al. (1995) с использованием 6 наиболее полиморфных комбинаций праймеров (E37-M52; E38-M53; E39-M49; E40-M56; E40-M58; E41-M57). Филогенетический анализ подрода Vicia по результатам RAPD и RFLP-PCR хлоропластных генов осуществлялся методом невзвешенного парно-группового кластерного анализа с арифметическим усреднением (UPGMA) программного пакета NTSYS-pc (Rholf, 1992), а также методом максимальной экономии (Phylogenetic Analysis Using Parsimony, Swofford, 1991) и методом максимального правдоподобия (Restriction Sites Maximum Likelihood Program, Phylip 3.5, Felsenstein, 1992). При анализе внутривидового разнообразия V.sativa L. по результатам AFLP частота встречаемости AFLP-фрагментов в региональных выборках была подсчитана с помощью опции FREQ программы NTSYS-pc (Rholf, 1992). Генетические дистанции между выборками рассчитаны по Nei (1972). Структура внутривидового разнообразия V.faba L. анализировалась методом главных координат (Principal Coordinates Analysis, PCoA) с помощью опций DOUBLE CENTER и EIGENVECTOR пакета NTSYS-pc (Rholf, 1992), а также с использованием факторного анализа (Statistica 5.0).

Для создания экспериментальной базы транскриптомного анализа у ячменя, библиотеки кодирующих последовательностей ДНК (кДНК) конструировались из РНК, выделенной из тканей семян ярового пивоваренного сорта ячменя Барке (Barke) на четырех стадиях прорастания (библиотеки HS,HT,HU,HV, http://pgrc.ipk-gatersleben.de/cr-est/index.php). Суммарная РНК выделялась с помощью кита Gentra RNA Isolation Kit (Biozym). Поли(А)-последовательности РНК экстрагировались из суммарной РНК с помощью олиго(Т)-парамагнитных корпускул (Dynal). Для конструирования библиотек кДНК выделенная иРНК использовалась для синтеза первой цепи кДНК реакцией обратной транскрипции с помощью pBluescript II XR cDNA Library Construction Kit (Stratagene), позволяющем встраивать и размножать молекулы кДНК в плазмидном векторе pBluescript II SK. При создании кДНК-макрочипа вставки кДНК амплифицировались из плазмидной ДНК с помощью универсальных праймеров и наносились на нейлоновые мембраны (BiodyneB, Pall, Germany) с помощью робота Biogrid иглами нанесения диаметром 0.4 мм (Biorobotics, Cambridge, UK).

Анализ экспрессии генов у сортов ячменя разного пивоваренного качества осуществлялся путем гибридизации проб кДНК, выделенных из семян каждого сорта на кДНК-микрочип. Для приготовления проб синтез первой цепи кДНК проводился с помощью обратной транскриптазы (Superscript II, Gibco), вторая цепь синтезировалась с использованием радиоактивно-меченых нуклеотидов (³³Р) (Megaprime Labeling Kit, Amersham). Гибридизация радиоктивно меченых проб кДНК на мембраны проводилась в течении 14ч при 65С. Время экспозиции для оценки интенсивности свечения радиоактивных сигналов составило 3-6ч. Имиджи фотопластин анализировались с помощью Fuji BAS2000 (Fuji Photo Film) и импортировались программой Array Vision (Imaging Research) для идентификации сигналов и оценки их интенсивности. Нозерн-блоттинг проводился с использованием мембран HybondN⁺ (Amersham). Мембраны гибридизовались с радиоактивно меченой пробой (³²Р) выделенной для индивидуальной кДНК. Мечение пробы проводилось с использованием рандомных праймеров Rediprime (Amersham). Сигнал инспектировался с помощью фосфо-имиджера Fuji BAS2000 (Fuji Photo Film).

Методические подходы идентификации генов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков, разрабатывались на примере признаков пивоваренного качества у ячменя. Параметры солодования и уровень экспрессии генов анализировались для 10 генотипов, полученных от семенной компании Cebeco Seeds B.V. (Нидерланды). Компания предоставила информацию о показателях шести параметров солодования у генотипов. Уровень экспрессии 1440 генов у тех же генотипов анализировался с использованием кДНК-макрочипа. Мантель-тест (Mantel,1967) использовался для оценки корреляции между двумя матрицами попарных расстояний по Манхеттену, описывающими одну и ту же выборку 10 генотипов. Одна из матриц была рассчитана по данным экспрессии генов, другая - по данным параметров солодования. Для оценки достоверности корреляции между матрицами использовался калькулятор Мантель-теста (Mantel Nonparametric Test Calculator for Windows, version 2.00, Liedloff, 1999).

Оценку уровня транскрипции гена-кандидата Cxp1 (Acc. Y09603), в прорастающих семенах дигаплоидных линий от скрещивания генотипов Steptoe/Morex проводили методом количественной ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR) в термоциклере GeneAmp 5700 Sequence Detection System (SDS; Applied Biosystems) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I. Праймеры для проведения RT-PCR были сконструированы таким образом, чтобы хотя бы один из них «перекрывал» интрон-экзонную границу в нуклеотидной последовательности гена. Оценку стартового количества кДНК в экспериментальных образцах проводили методом калибровочного графика, как описано в User Bulletin #2 for ABI Prism 7700 SDS. CAPS маркер для картирования гена-кандидата Cxp1 был разработан на основе одиночной нуклеотидной замены (SNP, Single Nucleotide Polymorphism), выявленной при сравнении последовательностей геномной ДНК у генотипов Steptoe и Morex с помощью программы RestrictionMapper (http://www.restrictionmapper.org/). Картирование генов и QTL проводилось в популяциях дигаплоидных линий от скрещивания Steptoe/Morex (Kleinhofs et al., 1993) и Oregon Wolfe Dom/Rec (Costa et al., 2001) с использованием программ MAPMAKER v.2 (Lander et al., 1987), QGENE v.3.0 (Nelson, 1997) и Windows QTL Cartographer 2.5.

Общегеномное картирование регуляторов транскрипции генов ячменя с использованием Affymetrix 22K Barley GeneChip (Affymetrix product #900515 GeneChip® Barley Genome Array) проводилось на материале проб РНК, выделенных из трех биологических повторностей родительских генотипов Steptoe и Morex и из одной повторности каждой дигаплоидной линии от их скрещивания. В исследование были включены два типа ткани, соответствующие также двум разным последовательным стадиям развития растения: 1) ткани зародыша прорастающего семени (96ч после намокания) и 2) листья 12-и дневных проростков. РНК, выделенная из листьев проростков анализироваласть только для 30 дигаплоидных линий. РНК, выделенная из тканей зародыша, анализировалась для 139 дигаплоидных линий. Процедура выделения РНК и гибридизации на микрочип описана Caldo et al. (2004). Приготовление тканевых проб, и выделение РНК проводилось в Институте культурных растений в Данди (Scottish Crop Research Institute, SCRI, Dundee). Мечение проб, гибридизация и сканирование геночипов проводилось в университете Йова, США (Iowa State University, USA). Анализ результатов гибридизаций (CEL files) осуществлялось нами с помощью пакета статистических программ Bioconductor, доступного в системе программирования R.

3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1 Возможности методов молекулярного маркирования при решении проблем прикладной ботаники и оптимизации коллекций ex situ (на примере Vicia L.)

С помощью методов RAPD и RFLP-PCR хлоропластных генов проанализирована степень геномного сходства 29 видов подрода Vicia и по результатам исследования очерчен круг возможных близкородственных таксонов для важнейших культивируемых видов вики. Полученные результаты не подтвердили традиционной точки зрения многих систематиков о том, что современные культивируемые бобы (V.faba) филогенетически более всего близки к видам секции Narbonensis (Ball, 1968; Plitmann, 1970; Maxted, 1992). По полученным данным, в пределах подрода Vicia, V.faba филогенетически более всего близка к V.bithynica, и эти два вида могут иметь общего предка с видами секции Peregrinae. Результаты также показали, что V.faba, имея определенную степень родства с ныне существующими видами подрода Vicia, не может считаться одомашенной формой одного из них.

Для дальнейшего исследования вопроса о происхождении культуры бобов методом RAPD было проанализировано генетическое разнообразие местных популяций бобов, собранных в 1916-1928 годах экспедициями ВИР в разных частях света во времена, когда современные аграрные технологии еще не заместили традиционных местных способов ведения сельского хозяйства. Обнаружено, что образцы культурных бобов, собранные в начале прошлого века в горах Алжира и Морокко, на уровне ДНК демонстрируют явную генетическую дивергенцию от остального внутривидового разнообразия V.faba. Из тех же географических пунктов северо-африканского побережья ранее был описан вид V. Pliniana (Trabut)Murat, незначительно отличающийся от современных форм V.faba, и рассматриваемый монографом культуры бобов Муратовой (1931) в качестве возможного предка этой культуры. Приняв во внимание гипотезу Cubero (1974), который объясняет отсутствие дикорастущих растений бобов тем, что в районах своего произрастания они непосредственно переводятся человеком в культивируемое состояние, выдвинуто предположение, что генетически обособленные северо-африканские популяции бобов могут представляют собой сравнительно недавно окультуренные формы дикорастущей V.faba, которую ботаники прошлого века описывали как V.Pliniana. Результаты проведенного исследования позволяют предположить, что дикорастущий предок культурных бобов, очень незначительно отличающийся морфологически от современных форм V.faba, в историческое время был широко распространен в Средиземноморье и на Ближнем Востоке. В этой связи сделан вывод о том, что видовое и формовое разнообразие Vicia в горах Алжира и Западного Морокко заслуживает специального подробного исследования для получения более точной информации о феномене V. Pliniana, возможно имеющем непосредственное отношение к дикорастущему предку культивируемых бобов.

Коэффициенты генетической оригинальности образцов коллекций генбанков по результатам молекулярного маркирования. Для рациональной организации и практического использования коллекций ex situ необходимо оценить генетические различия многочисленных образцов местных сортов и сорнополевых форм, собранных из одного эколого-географического региона и сходных по своим морфолого-физиологическим характеристикам. На примере образцов вики посевной (Vicia sativa L.) коллекции ВИР нами разработан математический алгоритм, позволяющий оценить степень генетической оригинальности образца в системе местного генофонда с использованием результатов молекулярного маркирования. Алгоритм был разработан по результатам анализа 1122 образцов мирового генофонда вики посевной методом AFLP. Установлено, что 65 AFLP-фрагментов, полиморфных внутри вида, могут быть обнаружены практически во всех точках ареала вики посевной, но с разной частотой встречаемости. Одна и та же аллель могла быть распространенной в одном регионе, встречаясь в 90% популяций, и очень редкой в другом районе видового ареала, встречаясь лишь в 10% популяций, однако, как правило, никогда не исчезая совсем (табл.1).

Таблица 1. Частота встречаемости AFLP-фрагментов (E41-M57) в образцах V.sativa из 22 географических районов видового ареала

	Кол-во образцов	Размер AFLP-фрагментов (н.п.)
		108.6	109.86	113	117.11	161	178	180	202	268.9	293	319	368	369
Прибалтика	98	0.938	0.255	1.000	0.684	0.061	0.765	0.877	0.071	0.633	0.020	0.786	0.020	0.245
Белоруссия	34	0.911	0.471	1.000	0.706	0.147	0.912	0.824	0.147	0.735	0.058	0.882	0	0.294
Центр. Украина	54	0.926	0.296	0.963	0.833	0.167	0.833	0.907	0.333	0.592	0.018	0.778	0	0.259
Запад. Украина	45	0.956	0.378	0.956	0.844	0.156	0.756	0.933	0.200	0.689	0.022	0.822	0.022	0.356
Кавказ	89	0.876	0.618	0.640	0.528	0.124	0.876	0.584	0.022	0.427	0.011	0.449	0.011	0.101
Россия-Север	37	0.889	0.278	0.944	0.861	0.167	0.944	0.833	0.028	0.694	0.056	0.972	0	0.209
Россия-Центр	105	0.962	0.429	0.895	0.829	0.152	0.886	0.867	0.105	0.610	0.028	0.857	0.038	0.209
Россия-Черноз	106	0.915	0.387	0.821	0.802	0.123	0.868	0.802	0.151	0.557	0.028	0.839	0	0.321
Россия-Поволжье	43	0.860	0.419	0.744	0.605	0.349	0.860	0.697	0.186	0.628	0	0.744	0.023	0.326
Россия-Урал	34	1.000	0.441	0.676	0.765	0.206	0.882	0.852	0.059	0.676	0.029	0.853	0	0.441
Россия Сибирь	30	0.933	0.200	0.933	0.700	0.133	0.867	0.867	0	0.733	0	0.867	0	0.267
Польша	23	0.782	0.130	0.652	0.522	0.130	0.696	0.783	0	0.261	0.435	0.565	0	0.478
Германия	21	0.900	0.150	0.700	0.450	0.150	0.800	0.950	0	0.500	0	0.700	0	0.300
Чехословакия	26	0.846	0.269	0.615	0.615	0.077	0.538	0.692	0	0.692	0.192	0.808	0	0.038
Греция	107	0.604	0.405	0.707	0.113	0.038	0.915	0.906	0	0.717	0.018	0.585	0.235	0.160
Испания	61	0.836	0.689	0.919	0.081	0.049	0.984	0.984	0	0.885	0	0.819	0.082	0.065
Италия	27	0.815	0.629	0.815	0.407	0.074	0.926	0.778	0	0.815	0.037	0.852	0.074	0
Болгария	26	0.880	0.200	0.600	0.280	0.280	1.000	0.440	0	0.760	0	0.200	0.120	0
Югославия	9	1.000	0	0.889	0.555	0	0.889	0.333	0	0.667	0.111	0.889	0.222	0.111
Венгрия	13	1.000	0.461	0.615	0.615	0.154	0.461	0.692	0	0.769	0.231	0.923	0	0.231
Турция	19	0.842	0.526	0.210	0.368	0.052	0.684	0.632	0	0.737	0	0.579	0	0.105
Иран	22	0.454	0.955	0.909	0.727	0.045	0.773	0.364	0	1.000	0	0.273	0.591	0

Показано, что различия в частотном соотношении AFLP-фрагментов между различными участками ареала пропорциональны их географической удаленности. Если отдельные части ареала вида различаются частотным соотношением аллелей, то для каждого конкретного региона появляется возможность различать редкие и широко встречающиеся аллели. На основе частоты их встречаемости становится возможным проводить процедуру “взвешивания” аллелей, выявленных у образцов с помощью молекулярного маркирования по методу Смирнова (Смирнов, 1969). Чем больше в составе образца генотипов с редкими аллелями, маркируемыми AFLP, тем выше степень его оригинальности (специфичности) в системе популяций региона.

В интерпретации генофонда это может означать, что в одном образце собраны генотипы наиболее характерные для данной местности, а в другом образце удалось «поймать» редкие генотипы, нехарактерные для местной среды обитания, но тем не менее сохраняемые популяцией в качестве резерва изменчивости. Как следствие, каждый образец в пределах конкретного региона может быть охарактеризован с точки зрения пропорции редких и обычных аллелей в виде рассчитанного коэффициента генетической оригинальности (КГО) в системе местного генофонда. Разработана пятибалльная шкала, согласно которой каждому образцу, в соответствии с его КГО, может быть присуждена градация от 1 до 5, отражающая долю редких для региона аллелей в конкретном образце. Алгоритм продемонстрирован на примере классификации 677 образцов посевной вики коллекции ВИР, собранных из 11 эколого-географических регионов России и проанализированных методом AFLP.

3.2 Стратегия идентификации генов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков на основе транскриптомного анализа

Разработан метод, позволяющий соотнести изменчивость уровня экспрессии генов с изменчивостью хозяйственно-ценного признака на основе транскриптомного анализа. Метод продемонстрирован на примере идентификации генов-кандидатов, вовлеченных в формирование пивоваренного качества у ячменя. Для проведения транскриптомного анализа генотипов ячменя различного пивоваренного качества было необходимо сконструировать библиотеки кДНК из тканей прорастающего ячменного семени.

3.2.1 Создание библиотек кодирующих последовательностей ДНК ячменя

Из иРНК, выделенной из тканей прорастающего ячменного семени на разных этапах прорастания, нами были созданы 4 библиотеки кДНК. Эти 4 библиотеки, вместе с другими 18 библиотеками кДНК из разных тканей и стадий развития ячменя, были использованы для создания обширной коллекции секвенированных фрагментов кодирующих последовательностей ДНК, насчитывающей 110981 EST и сохраняемой в настоящее время Институтом генетики культурных растений (IPK, Gatersleben). Созданная коллекция EST является базовым ресурсом геномных исследований у ячменя и составляет примерно одну треть от всего количества EST ячменя (~380000), опубликованных на сегодняшний день (Zhang et al., 2004). Всего из сконструированных нами библиотек прорастающего семени было секвенировано 27512 EST. Длина EST варьировала от 426 до 547 нуклеотидов, средняя длина составила 495. Примерно 50% EST показали достоверное сходство с аннотированными генами, кодирующими белки известных функций. 24% оказались сходными с генами, кодирующими белки с неизвестными функциями, 26% EST не имели достоверных аналогов в опубликованных базах данных. Нуклеотидные последовательности всех EST и их функциональные аннотации доступны для пользователей.

На основе полученных EST был создан кДНК-макрочип ячменя (1400 EST на нейлоновом фильтре). Получив возможность анализировать уровень экспрессии сотен генов в рамках одного эксперимента, мы использовали кДНК-макрочип для того, чтобы установить как меняется характер экспрессии генов в зависимости от стадии прорастания семени, и насколько уровень экспрессии специфичен для определенной ткани. Рис.1 в качестве примера иллюстрирует один из дифференциально-экспрессируемых генов карбоксипептидазу I (Cxp1, EST HY02B16), специфически транскрибируемый в щитке семени ячменя спустя 12-36 ч после намокания. Тканеспецифичная экспрессия этого гена может быть выявлена как с помощью кДНК-макрочипа, так и с помощью Нозерн-блоттинга. Преимущество кДНК микрочипа состоит в выявлении сразу несколько десятков дифференциально-экспрессируемых генов.

Среди 154 дифференциально-экспрессируемых генов 69 показали наивысший уровень активности в эндосперме, 58 преимущественно транскрибировались в зародыше и щитке, 11 только в зародыше и 16 только в щитке. 70% генов были аннотированы в соответствии с их предполагаемыми функциями. Гены, преимущественно экспрессируемые в зародыше и щитке, кодировали белки клеточного цикла, процессов трансляции, нуклеотидного метаболизма, углеводного обмена и транспортных функций. Гены, активные в алейроновом слое эндосперма, в основном определяли процессы гидролиза угеводов и метаболизма аминокислот. Было установлено, что результаты с использованием кДНК-макрочипа воспроизводимы и подтверждаются результатами альтернативных молекулярно-биологических методов (Нозерн-блоттинг). При условии соблюдения фиксированной экспериментальной ситуации можно проводить сравнение уровня транскрипции генов в прорастающем семени не только между тканями и возрастными стадиями одного и того же индивидуального организма, но и между различными генотипами.

3.2.2 Выявление корреляции между экспрессионными профилями EST и профилями варьирования признаков пивоваренного качества у ячменя

Для того чтобы идентифицировать гены, вовлеченные в детерминацию хозяйственно-ценного признака, невозможно сравнивать уровень транскрипции генов у двух генотипов, контрастных по определенным фенотипическим характеристикам (например, по принципу “высокое - низкое пивоваренное качество”).

Рис.1. I - Схематическое изображение органов семени ячменя, использованных для выделения РНК и последующего транскриптомного анализа; II - Тканеспецифичная экспрессия гена карбоксипептидазы (Cxp1) (HY02B16) в щитке зерновки ячменя, выявленная с помощью Нозерн-блоттинга (А) после 4, 12, 36 и 54 часов проращивания семени. Количество нанесенной РНК контролировалось параллельной гибридизацией с пробой рибосомальной ДНК (26S rDNA) (В); III - IV Сравнение экспрессии 1440 генов в тканях семени с помощью кДНК-макрочипа (III - в щитке по сравнению с зародышем; IV - в щитке по сравнению с эндоспермом). Логарифмированное значение интенсивности сигнала отображено на двухмерном графике разброса для двух сравниваемых тканей. Диагонали отражают границы разницы в уровне экспрессии генов в 3 раза. HY02B16 (карбоксипептидаза 1) показывает высокий уровень экспрессии в щитке, однако в зародыше и эндосперме ген не транскрибируется (сигнал неотличим от “экспериментального шума”).

В этом случае разница в экспрессии генов будет отражать общее генетическое несходство сортов, вызванное и другими факторами, например, происхождением сорта. Поэтому, предлагаемый функционально-ассоциативный подход предполагает анализ уровня экспрессии генов не у двух контрастных сортов, а у репрезентативной выборки сортов, среди которых наблюдается существенная вариация изучаемого признака. Далее, из всего множества дифференциально-экспрессируемых генов необходимо выбрать только те, варьирование уровня экспрессии которых между сортами коррелирует с изменчивостью изучаемого признака между теми же сортами.

Для десяти сортов ячменя, полученных от семенной компании Cebeco Seeds B.V. (Нидерланды), были проанализированы шесть параметров солодования. Для тех же 10 сортов с помощью кДНК-макрочипа был проанализирован уровень экспрессии 1440 генов в прорастающих семянах. Было выявлено 100 дифференциально-экспрессируемых генов, уровень экспрессии которых отличался более чем в 2 раза при сравнении хотя бы двух сортов. Далее, для 10 сортов были рассчитаны две матрицы попарных расстояний по Манхеттену (Average Manhattan distances).

Первая матрица (табл.2а) была основана на показателях одного из параметров солодования, обозначенного в анализе как VZ 45°C, а вторая матрица (табл.2б) - на показателях уровня экспрессии 100 дифференциально-экспрессируемых генов. Достоверность корреляции между двумя матрицами устанавливалась с помощью Мантель-теста (Mantel, 1967). Первоначально, значение Мантель теста составило g=-0.8027, означая, что корреляция между матрицами не является достоверной, так как 5% уровень достоверности достигается при (g=1.645). Можно предположить, что не все 100 генов, по разному экспрессируемых у 10 сортов, имеют отношение к анализируемому признаку пивоваренного качества. Поэтому, из их числа необходимо элиминировать EST, негативно влияющие на корреляцию матриц. Для этого была применена следующая процедура: первый EST в списке 100 EST (EST 1) был удален, и на основании показателей экспрессии оставшихся 99 EST была составлена новая матрица расстояний, которая была сравнена с матрицей пивоваренного параметра (VZ 45°C). Показатель Мантель-теста составил g= -0.7499, что превышает начальный показатель (-0.7499 > -0.8027). Был сделан вывод, что EST 1 негативно влияет на корреляцию, так как при его отсутствии показатель Мантель-теста повышается. EST 1 был возвращен в список, вместо него EST 2 был исключен, и процедура пересчета экспрессионной матрицы и ее сравнения с фенотипической матрицей была повторена с результатом g= -0.8499. EST 2 положительно влияет на корреляцию, так как его отсутствие понижает начальный показатель (-0.8499 < -0.8027). Действуя таким образом поэтапно со всеми 100 EST изначального списка, мы выявили 30 EST, позитивно влияющих на искомую корреляцию, показатели экспрессии которых формировали матрицу достоверно (p<0.05) коррелирующую с матрицей, рассчитанной на основе признака пивоваренного качества. С помощью той же процедуры кандидатные гены были идентифицированы и для остальных пяти параметров солодования.

Таблица 2. Корреляция матриц попарных расстояний между 10 сортами ячменя, рассчитанных (a) на основе параметра солодовенного качества VZ 45° и (б) на основе экспрессионных профилей 100 генов. Значение Мантель-теста составило g = -0.8027, означая отсутствие достоверной корреляции между матрицами. Корреляция считается достоверной при g > 1.645 (p < 0.05).

а

Сорта	005	008	009	134	137	145	147	157	158	159
005	0
008	0.91	0
009	1.42	1.55	0
134	1.11	0.64	1.61	0
137	0.78	0.78	1.06	1.02	0
145	1.01	1.06	2.22	1.23	1.41	0
147	1.60	1.58	0.71	1.74	1.20	2.35	0
157	1.10	0.73	1.63	0.84	0.89	1.28	1.53	0
158	0.92	0.88	1.00	0.88	0.57	1.45	1.18	0.90	0
159	0.96	0.76	1.36	0.97	0.78	1.36	1.19	0.67	0.73	0

б

Сорта	005	008	009	134	137	145	147	157	158	159
005	0
008	1.79	0
009	1.14	0.65	0
134	0.28	1.51	0.86	0
137	0.30	1.49	0.84	0.02	0
145	1.74	0.05	0.60	1.46	1.44	0
147	2.50	0.71	1.36	2.22	2.20	0.76	0
157	2.93	1.14	1.79	2.65	2.63	1.19	0.43	0
158	2.20	0.41	1.06	1.92	1.90	0.46	0.30	0.73	0
159	1.69	0.10	0.55	1.41	1.39	0.05	0.81	1.24	0.51	0

Помимо генов, задействованных в процессах гидролиза крахмала и запасных белков, роль которых в процессе солодования у ячменя хорошо изучена, были выявлены дополнительные гены-кандидаты, чья возможная роль для солодования ранее не обсуждалась. Большинство из них кодирует ферменты, связанные с защитой клеток от дегидратации и теплового шока. Защитная функция этих ферментов действительно может иметь отношение к эффективности пивоваренного процесса на этапе сушки зеленого солода при высоких температурах. В случае, если термостабильность гидролитических ферментов могла бы быть повышена за счет более активного синтеза шаперонов (в том числе белков теплового шока), производственные потери при сушке зеленого солода были бы значительно сокращены. Полученные результаты свидетельствуют о том, что пивоваренные и белковые сорта ячменя могут различаться не только по своему гидролитическому потенциалу, но также и по активности генов, кодирующих белки-шапероны, защищающие гидролазы от денатурации при высоких температурах в процессе пивоварения.

Для дальнейшей проверки выявленные гены-кандидаты были локализованы на генетической карте. Для этого была использована картирующая популяция дигаплоидных линий от скрещивания двух сортов ячменя Steptoe (белковый сорт) и Morex (пивоваренный сорт) (Kleinhofs et al., 1993). Эта популяция широко используется для картирования QTL пивоваренных качеств у ячменя (Hayes et al., 1993; Han et al., 1997). Изменчивость биохимических параметров солода среди дигаплоидных линий популяции детально документирована, и информация доступна через интернет (http://wheat.pw.usda.gov/ggpages/SxM/). Располагая информацией о позиции гена-кандидата на генетической карте Steptoe/Morex и данными о варьировании параметров солода среди дигаплоидных линий той же самой картирующей популяции, мы провели QTL анализ для параметров солода, чтобы оценить, совпадают ли позиции идентифицированных генов-кандидатов с позициями QTL для параметров пивоваренного качества на одной и той же генетической карте.

Для позиций 7 из 9 генов, картированных в популяции Steptoe/Morex, было зафиксировано совпадение с позициями QTL различных параметров пивоваренного качества. Это свидетельствовало о том, что хромосомные участки, где были локализованы гены-кандидаты, достоверно влияют на изменчивость солодовенного фенотипа. Такое совпадение объяснимо, если предположить наличие полиморфизма в промоторном участке гена-кандидата между Steptoe и Morex в результате цис-регуляторной мутации, которая может повышать или понижать экспрессию гена, и если ген действительно имеет отношение к формированию пивоваренных свойств, то как следствие, повышается или понижается значение соответствующего параметра солодования. В результате, в локусе, где был картирован ген-кандидат, QTL анализ фиксирует достоверную связь между полиморфизмом локуса и варьированием признака пивоваренного качества - выявляется достоверный пик QTL для параметров солодования. Чтобы проверить это предположение для одного из генов-кандидатов, взятого в качестве примера, были выявлены генетические факторы, определяющие уровень его экспрессии, путем картирования eQTL (expressedQTL) в популяции дигаплоидов от скрещивания Steptoe/Morex с использованием техники Real Time PCR (RT-PCR).

3.2.3 Идентификация геномных локусов, регулирующих экспрессию генов-кандидатов, на примере гена Cxp1

Ген-кандидат, выбранный в качестве примера, кодирует протеолитический фермент карбоксипептидазу 1 (serine carboxypeptidase I, Cxp1), играющую важную роль в расщеплении запасных белков в прорастающем семени и, следовательно, в формировании солода (Winspear et al., 1984; Mikola, 1983). В наших экспериментах ген Cxp1 (EST HY02B16) был идентифицирован как ген-кандидат, так как изменчивость уровня его экспрессии между 10 сортами ячменя коррелировала с характером изменчивости пивоваренных параметров, такими как вязкость (VZ45°) и экстрактивность.

Относительный уровень экспрессии гена Cxp1 был измерен с использованием RT-PCR, как у родительских генотипов Steptoe и Morex, так и среди 134 рекомбинантных потомков этого скрещивания в двух повторностях (в прорастающих семянах 2000 и 2001 годов репродукции). Родительские генотипы Steptoe и Morex показали стабильное, воспроизводимое различие в экспрессии Cxp1. Экспрессия этого гена у пивоваренного сорта Morex достоверно превышала таковую у белкового сорта Steptoe, независимо от года репродукции семян, или повтора опыта проращивания. Уровень экспрессии Cxp1 в дигаплоидных линиях соответствовал нормальному распределению, и был подвергнут QTL анализу. Коэффициент наследуемости количественного признака “уровень экспрессии Cxp1”, определяющий долю генотипической изменчивости в наблюдаемых вариациях составил 21%. Единственный достоверный еQTL (expressed QTL) для гена Cxp1 был картирован на длинном плече хромосомы 3Н, в позиции непосредственно совпадающей с локусом, где ранее был картирован сам ген Cxp1 (рис.2).

Совпадение позиций гена Cxp1 и его еQTL на генетической карте свидетельствует о том, что различие в уровне экспрессии гена Cxp1 у Steptoe и Morex вероятнее всего определяется полиморфизмом в регуляторной части самого гена (цис-регуляторной мутацией). Иными словами, картированный еQTL представляет собой цис-еQTL.

Рис.2. Картирование eQTL для гена Cxp1 интервальным методом в популяции 134 дигаплоидных линий, полученных от скрещивания Steptoe и Morex. Кривые значений LOD показаны для двух повторов эксперимента (семена репродукции 2000 и 2001 гг.). Семь хромосом ячменя обозначены как 1Н-7Н. Числа под хромосомами обозначают наивысшее значение LOD, зафиксированное для данной хромосомы. Горизонтальная линия обозначает местоположение гена Cxp1 на генетической карте, где ген Cxp1 был картирован с помощью SNP-маркера, выявленного в структурной части гена.

Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена Cxp1 среди 90 сортов ячменя позволил выявить шесть полиморфных локусов, в которых могут происходить нуклеотидные замены (SNP). В зависимости от аллелей SNP в этих шести полиморфных локусах, проанализированные 90 сортов ячменя формируют четыре гаплотипа (табл.3). 24 сорта относились к гаплотипу I (аллель Morex в локусе Te945) и 66 сортов показали гаплотип II (аллель Steptoe в локусе Te945), причем второй гаплотип может быть далее подразделен на IIа (27 сортов), IIв (14 сортов) и IIс (25 сортов), в зависимости от того, какой нуклеотид они несут в локусах Te931, Ui208 и Ui218.

Три SNP (Ti105, Te945 and Ui143) показали абсолютно неравновесное сцепление в наследовании (linkage disequilibrium, LD) с коэффициентом корреляции равным единице (табл.4) в произвольной выборке 90 генотипов ячменя. Один из них, Te945, ранее использованный нами как молекулярный маркер для картирования гена Cxp1, оказался ассоциированным с уровнем экспрессии гена. В зависимости от аллели в этом локусе, вся картирующая популяция может быть подразделена на две подгруппы: дигаплоидные линии несущие аллель от Morex (С) и линии несущие аллель от Steptoe (Т). Подгруппа линий с аллелью Morex характеризуется значительно и достоверно (p<0.0001) более высоким уровнем экспрессии Cxp1, чем подгруппа Steptoe в двух повторах эксперимента.

Таким образом, стало возможным предположить, что аллели регуляторного локуса, определяющего экспрессию гена Cxp1, сцепленно наследуются с тремя вышеупомянутыми SNP в структурной части гена. Если это предположение верно, тогда присутствие Morex-подобных аллелей (A/Ti105, C/Te945, G/Ui143) в структурной части гена Cxp1 должно быть ассоциировано с повышенным уровнем экспрессии гена Cxp1 по сравнению со Steptoe-подобными генотипами (все разновидности гаплотипа II) в случайной выборке сортов ячменя. Чтобы проверить эту гипотезу, уровень экспрессии гена Cxp1 был измерен среди уже упоминавшихся 90 сортов ячменя с помощью RT-PCR. Сравнение экспрессии гена Cxp1 в прорастающих семенах этих сортов показало достоверное (р=0,005) различие уровня экспрессии в зависимости от гаплотипа структурной части гена.

Таблица 3. Нуклеотидные замены (SNP) и гаплотипы (комбинации SNP) выявленные в локусе Cxp1 по результатам сравнительного секвенирования локуса у 90 сортов ячменя.

Подобные документы

• Разработка технологии возделывания пивоваренного ячменя в хозяйстве

  Ботанико-морфологическая характеристика пивоваренного ячменя. Характеристика хозяйства КФХ "Иванова". Технология возделывания ярового пивоваренного ячменя: уход за посевами, сроки и способы уборки, формирование партий высококачественного зерна.
  
  дипломная работа [99,5 K], добавлен 28.07.2010
  

• Защита ярового ячменя от вредителей и болезней

  Принципы классификации пестицидов. Характеристика применяемых пестицидов для защиты ячменя обыкновенного (Hordeum vulgare) от вредителей и болезней. Организация планирования защитных мероприятий. Разработка годового плана работ по защите растений.
  
  курсовая работа [75,7 K], добавлен 09.02.2016
  

• Агротехнические методы возделывания пивоваренного ячменя

  Технология выращивания сортов пивоваренного ячменя, требующая тщательного выполнения научно-обоснованных агротехнологий для того, чтобы добиться высокой урожайности и высококачественного зерна ячменя. Обработка почвы, подготовка семян, уход за посевами.
  
  курсовая работа [55,9 K], добавлен 17.04.2010
  

• Технология возделывания пивоваренного ячменя

  Анализ полеводства в СПК "Заря": структура посевных площадей, севообороты. Технология возделывания культуры пивоваренного ячменя. Посевной материал и его качество. Подготовка семян и посев. Уборка урожая и первичная обработка полученной продукции.
  
  курсовая работа [44,7 K], добавлен 24.05.2008
  

• Возделывание пивоваренного ячменя

  Биологические особенности пивоваренного ячменя, технология и механизмы его возделывания. Районированные на текущий год по Самарской области. Температурный режим воздуха и его влияние на рост и развитие исследуемой культуры, режим влажности почвы.
  
  курсовая работа [70,2 K], добавлен 17.01.2015
  

• Оценка отклика ячменя на внесение минеральных удобрений в комплексе со средствами защиты растений в условиях южной лесостепи Красноярского края

  Исследование хозяйственного значения и биологических особенностей ярового ячменя. Роль минерального питания для ячменя. Анализ влияния удобрений и средств защиты растений на урожайность, химический состав и качество урожая, на развитие болезней ячменя.
  
  курсовая работа [194,2 K], добавлен 15.12.2013
  

• Подбор сортов ячменя для пивоварения в связи с различными предшественниками

  Народнохозяйственное значение, морфологические и биологические особенности, требования ярового ячменя к условиям возделывания. Технология выращивания ячменя пивоваренного, характеристика места и условий его выращивания, предшественники и севообороты.
  
  дипломная работа [95,4 K], добавлен 14.07.2010
  

• Особенности возделывания пивоваренного ячменя в условиях Ярославской области

  Морфологические и биологические особенности ячменя. Требования к теплу, свету, влаге, элементам питания и почве. Обоснование величины урожая и разработка агротехнических мероприятий. Определение норм удобрений. Технологическая схема возделывания культуры.
  
  курсовая работа [54,3 K], добавлен 07.06.2014
  

• Устойчивость сельскохозяйственных растений к поражению паразитами

  Исследование инфекционных болезней и поражения насекомыми-фитофагами растений, восприимчивых к патогенным организмам и вредителям. Описания селекции растений, выведения новых сортов с высокой и устойчивой урожайностью, скрещивания и получения мутаций.
  
  реферат [246,3 K], добавлен 20.07.2011
  

• Влияние различных видов обработки семян на рост и развитие растений

  Исследование и оценка влияния химических веществ, электромагнитной (биофизической) и лазерной обработки на процесс роста и развития растений. Особенности анализа и изучения всхожести семян ячменя в зависимости от степени и характера их облучения лазером.
  
  курсовая работа [40,8 K], добавлен 14.06.2014
  

• Анализ наследования количественных признаков у гибридов риса F2 от скрещивания Айсберг*Вираж

  Определение числа генов, отвечающих за конкретные признаки, характер их наследования. Биометрический анализ признаков у растений (высота, длина метелки). Генетический анализ гибридов риса F2 от скрещивания Айсберг*Вираж с помощью компьютерных программ.
  
  курсовая работа [55,0 K], добавлен 09.10.2013
  

• Структурный анализ урожая зерна ячменя в условиях различных природно-климатических зон Оренбуржья

  Ячмень в растениеводстве Оренбуржья. Природно-климатические характеристики. Структурная формула урожайности. Величина и изменчивость урожайности зерна ячменя в различных условиях выращивания. Роль абиотических факторов в формировании урожая ячменя.
  
  дипломная работа [461,9 K], добавлен 29.06.2012
  

• Разработка модели ландшафтно-адаптированной технологии возделывания ячменя в СПК "Леднево" Юрьев-Польского района Владимирской области

  Оценка объёма посевных площадей и анализ производства ячменя в СПК "Леднево". Разработка системы мероприятий по защите зерновых культур от вредителей и болезней, протравливание семян ячменя. Технология обработки посевов гербицидами, порядок их удобрения.
  
  курсовая работа [65,1 K], добавлен 08.06.2014
  

• Технология выращивания озимого ячменя в Крыму

  Характеристика озимого ячменя и биологические особенности этой культуры. Особенности его выращивания в климатических условиях Крыма: технология и уход. Обзор сортов озимого ячменя и их агротехника. Меры борьбы с вредителями и болезнями семян и растений.
  
  контрольная работа [47,6 K], добавлен 01.02.2013
  

• Особенности сельскохозяйственного выращивания ячменя ярового

  Характеристика ячменя как сельскохозяйственной культуры. Разработка технологии возделывания ярового ячменя сорта Якуб. Определение лучших предшественников, оптимальных доз удобрений, программирование урожая, разработка технологии посадки культуры.
  
  курсовая работа [86,4 K], добавлен 29.11.2010
  

• Инновационная деятельность Орловского регионального биотехнологического центра сельскохозяйственных растений

  Описание основных инновационных научно-исследовательских разработок предприятия в области биотехнологии и их применение. Типы мутаций, причины их возникновения. Изменения признаков организма, вызываемые ими. Их значение для эволюции, селекции и медицины.
  
  отчет по практике [216,4 K], добавлен 23.02.2015
  

• Селекция лиственницы

  Биологические основы селекции и семеноводства. Методы лесной селекции и сохранение биоразнообразия. Характеристика, методы и результаты селекции различных видов лиственницы как хозяйственно ценной породы. Размножение хозяйственно-ценных форм лиственницы.
  
  курсовая работа [57,5 K], добавлен 08.05.2011
  

• Совершенствование технологии возделывания ячменя

  Требования ячменя к факторам внешней среды, обеспеченность ими в рассматриваемом регионе. Прогрессивная технология возделывания, уборки культуры. Опыт повышения урожайности. Разработка севооборота и чередования культур на примере конкретного хозяйства.
  
  дипломная работа [298,1 K], добавлен 16.03.2017
  

• Технология возделывания и уборки ячменя

  Характеристика основных правил и этапов подготовки семян ячменя. Требования, предъявляемые к посеву. Комплектование, подготовка и работа посевных агрегатов. Создание оптимальных условий для произрастания возделываемых растений. Уборка соломы и половы.
  
  контрольная работа [286,9 K], добавлен 12.01.2011
  

• Особенности культивирования ячменя

  Изучение ботанических, морфологических и биологических особенностей ячменя и его подвидов: многорядного, двухрядного и промежуточного, различающихся строением колоса. Анализ требований к условиям произрастания ячменя и его роли в полевом севообороте.
  
  курсовая работа [46,3 K], добавлен 16.02.2010
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам