Влияние кадмия на антиоксидантную систему проростков гречихи при деэтиоляции

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Интенсивное развитие промышленности сопровождается поступлением в биосферу различных экотоксикантов, количество которых в окружающей среде сегодня во много раз превышает их естественные концентрации. В этом отношении большую опасность для всех живых организмов представляют тяжелые металлы, обладающие канцерогенными и мутагенными свойствами и приводящие к развитию стрессовых реакций у растений.

Одним из наиболее опасных экотоксикантов является кадмий, который содержится в транспортных отходах, топливе, удобрениях. Повышенное содержание кадмия в растениях сопровождается снижением транспорта метаболитов в листья и стебли, их хлорозом и замедлением роста. Кроме того, он способствует возникновению окислительного стресса в растительных клетках. В результате этого в клетках могут образовываться активные формы кислорода, вызывающие изменения в таких компонентах клеточных мембран как липиды. Активные формы кислорода способны инициировать их перекисное окисление (ПОЛ), в результате чего происходит повреждение этих структур, связанное с нарушением функций мембранных белков. Оно обнаруживается в явлении, которое называют "протечкой мембран", проявляющейся в увеличении их проницаемости для ионов и органических веществ. Кроме того, продукты ПОЛ (4-гидроксиалкенали, малоновый диальдегид и др.) обладают мутагенной активностью и блокируют клеточное деление.

В растениях существуют защитные системы, способствующие ослаблению токсического действия этого металла. К ним относятся фенольные соединения, которые являются одними из наиболее распространенных в растениях вторичных метаболитов. Благодаря своему строению они принимают участие в самых разнообразных физиологических процессах, таких как фотосинтез, дыхание, формирование клеточных стенок, защите растений от различных патогенов и стрессовых факторов. Фенольные соединения имеют и важное практическое значение. На их окислительных превращениях основаны технологические процессы в пищевой и легкой промышленности. В медицине широко применяются лекарственные препараты, изготовленные на основе полифенолов, которые обладают широким спектром воздействия.

К числу перспективных и важных культур промышленного использования относится гречиха обыкновенная. Она успешно используется в диетическом питании, пчеловодстве, а также для получения фармакологически-ценного препарата - рутина, который относится к соединениям фенольной природы.

Актуальность исследования состоит в выяснении особенностей функционирования антиоксидантной системы при действии поллютантов (на примере кадмия) в период деэтиоляции проростков гречихи как одной из важнейших фармакологически ценных культур.

Цель работы: изучить влияние кадмия на функционирование антиоксидантной системы проростков двух сортов гречихи обыкновенной (Девятка и Большевик 4) при переходе к деэтиоляции.

Задачи исследования:

ь изучить изменения в морфофизиологических характеристиках проростков двух сортов гречихи при действии кадмия и деэтиоляции;

ь сравнить распределение кадмия в надземных органах этиолированных и деэтиолированных проростков двух сортов гречихи;

ь исследовать уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) в надземных органах двух сортов гречихи после действия кадмия и деэтиоляции;

ь изучить накопление различных классов фенольных соединений в надземных органах двух сортов гречихи после действия кадмия и деэтиоляции.

1. Обзор литературы

кадмий окислительный гречиха деэтиоляция

На протяжении жизненного цикла растения подвергаются воздействию разнообразных неблагоприятных факторов среды (засуха, избыточное переувлажнение, загрязнения, воздействие УФ - излучения и др.) В результате растения вынуждены адаптироваться к данным изменениям, вырабатывать механизмы защиты. Эти механизмы защиты связаны с созданием эффективной многоуровневой физиологической антиоксидантной системы в каждой растительной клетке, способной обеспечить защиту от активных форм кислорода (АФК) (Мерзляк, 1999; Сорокина, Крысин, 1997).

Антиоксидантная система защиты растений включает в себя низкомолекулярные соединения (фенольные соединения, некоторые аминокислоты, мочевина, мочевая кислота, аскорбат, глутатион, полиамины, витамины А, Е, каротины и др.) и высокомолекулярные (ферменты, такие как каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза) (Мерзляк, 1999).

Активные формы кислорода и их участие в метаболизме растений.

Активные формы кислорода - это высокореакционные, преимущественно радикальные, кислородные соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода или изменения спина одного из его электронов, находящихся на внешних орбиталях. (Меньщикова, 2006).

По классификации, предложенной Ю.А. Владимировым, все АФК в зависимости от происхождения можно разделить на 2 группы: природные, чужеродные. Природные формы АФК можно разделить на первичные (супероксидный анион-радикал (О2-), гидроперекисный радикал (Н2О2), оксид азота (NO*)), вторичные (гидроксильный радикал - ОН*, алкильный радикал - RO*, перекисный радикал - RO2*, синглетный кислород - 1O2) и третичные (радикалы антиоксидантов) (Меньщикова, 2006).

Среди причин появления чужеродных форм АФК можно выделить три основных фактора: радиация (ОН*, Н*, R*), УФ-излучение (R*, RO*, RO2* , 1O2), ксенобиотики (радикалы токсинов) (Меньщикова, 2006).

Практически во всех живых организмах в процессе жизнедеятельности включаются окислительно-восстановительные реакции. При этом образуются активированные производные молекулярного кислорода или АФК, которые участвуют в реакциях свободнорадикального окисления. Процесс образования АФК идет в различных структурах клетки, в норме концентрация всех видов АФК в тканях невысока и составляет 10-8 - 10-11 М (Мерзляк, 1999). Возникновение супероксидного радикала происходит в фотосистеме I (ФС I), фотосистеме II (ФС II) хлоропластов и на комплексах дыхательной цепи в митохондриях, а также в ряде реакций, протекающих в пероксисомах. Возникновение данной АФК в хлоропластах обусловлено работой Рубиско по оксигеназному типу. Как показывают литературные источники, в ФС I появление супероксидного радикала происходит в реакции Меллера (Mehler) и связано с работой 4Fe-4S-кластеров, ферредоксина и/или ферредоксин-НАДФН-редуктазы. В ФС II аналогичный процесс связан с фотоокислением воды.

В митохондриях образование супероксидного анион-радикала связано с функционированием дыхательной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) во внутренней митохондриальной мембране и захватом молекулярным кислородом электронов с гемов (b1 и b2) и относительно долгоживущих семихинонов. В эндоплазматическом ретикулюме генерация супероксидного радикала обусловлена цитохромом Р-450, а также окислением НАДФ при участии флавинсодержащего фермента. В плазматических мембранах окисление восстановленных пиридиннуклеотидов (НАДФ) также сопровождается образованием АФК. В пероксисомах был обнаружен фермент ксантиноксидаза, который при определенных условиях способен стать источником большого количества О2- (Мерзляк, 1999; Сорокина, Крысин, 1997).

Таким образом, образование АФК происходит практически во всех компартментах клетки. В небольших количествах АФК необходимы клетке, так как принимают участие в защитных реакциях, например при действии патогенов. Однако чрезмерное накопление АФК может привести к гибели растительной клетки (Минибаева, Гордон, 2008).

При воздействии различных стрессовых факторов (высокие или низкие температуры, переувлажнение, действие поллютантов, засоленность почвы и т.д.) происходит увеличение количества АФК в клетке, что может привести к различным повреждениям и нарушениям физиолого-биохимических процессов. (Гудковский, Каширская, 2005; Мерзляк, 1989, 1999; Сорокина, Крысин, 1997). Крайними результатами нарушения балансового соотношения в образовании и обезвреживании АФК может быть некроз тканей или реакция сверхчувствительности. Было выявлено четыре наиболее вероятные мишени окислительной цитотоксической атаки АФК: индукция процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах (Владимиров, Азизова, 1991), повреждение мембрансвязанных белков (Richards, Dean, 1988), инактивация ферментов (Drapier, Hibbs, 1988) и повреждение ДНК клеток (Hoffman, Mello-Fillho, 1984).

ПОЛ и его продукты выступают в роли «первичного медиатора» стресса (Барабой, 1991), представляющего один из наиболее ранних регуляторных механизмов, который в процессе эволюции трансформировался в ферментативную эйкозаноидную регуляцию (Smiley, Stremler, Prescott et al., 1991). Окисление липидных молекул приводит к необратимому изменению или повреждению мембранных структур, нарушению их проницаемости для ионов (Varga, Novak et al., 2014). Наиболее подвержены перекисному окислению входящие в состав мембран насыщенные жирные кислоты: линолевая, арахидоновая, докозагексаеновая. Окисление липидов приводит к образованию перекисей и увеличению гидрофильности молекул, в результате чего происходит ротация липидного состава мембран (Меньщикова, 2006).

Продукты окисления липидов также обладают высокой реакционной активностью. Главный продукт окисления 1,6-арахидоновой кислоты, 4- гидроксиноненаль обладает цитотоксическим и мутагенным действием и может сшивать белковые молекулы, вызывая нарушение структуры и инактивацию ферментов.

Низкомолекулярные и высокомолекулярные компоненты антиоксидантной системы

К низкомолекулярным антиоксидантам в первую очередь принято относить фенольные соединения.

Разнообразие природных фенольных соединений велико и исчисляется тысячами, но их всех объединяют строение и биогенетическая природа. Большинство известных фенольных соединений образуется с использованием в качестве ключевого предшественника шикимовой кислоты. Отсюда сам путь биосинтеза называют шикиматным путем. Шикиматный путь объединяет в себе образование фенольных соединений и образование ароматических аминокислот ( L - фенилаланина, L - тирозина и L - триптофана). При дезаминировании L - фенилаланина под действием L- фенилаланинаммиак-лиазы образуется простейший представитель фенилпропаноидов - транс - коричная кислота. Сходным путем из L - тирозина образуется n - оксикоричная кислота. Транс - коричная кислота при участии 4-гидроксилазы коричной кислоты далее превращается в n- кумаровую кислоту, а орто-гидроксилирование n-кумаровой кислоты приводит к образованию кофейной кислоты. Из кофейной затем последовательно образуются феруловая, 5-оксиферуловая и синаповые кислоты. На этом завершается процесс формирования основных представителей фенилпропаноидного блока фенольных соединений (Борисова, 2014).

Оксикоричные кислоты, подвергаясь превращениям, образуют основной предшественник флавоноидов халкон халконарингенин.

Флавоноиды исключительно разнообразны по строению. Объясняется это тем, что они обычно присутствуют в тканях растений в виде моно-, ди-, три- и даже тетра-гликозидов, причем к сахарным фрагментам часто присоединяются ацильные остатки в виде оксикоричных, оксибензойных или иных органических кислот. Из примерно 9000 известных фенольных соединений половина приходится на долю флавоноидов. (Запрометов, 1974). Фенольные соединения обладают антиоксидантным эффектом, защищая от повреждений (стабилизируя) мембраны клеток, оказывая в целом цитозащитный эффект.

Также к низкомолекулярным антиоксидантам относятся аскорбиновая кислота, б-токоферол, глутатион, полиамины, каратиноиды.

Важную роль в антиоксидантной защите организма и поддержании окислительно-восстановительного баланса играют легкоокисляющиеся белки и пептиды, в состав которых входят SH-содержащие аминокислоты: цистеин и метионин. Особое место среди них занимает глутатион - трипептид, образованный аминокислотами глутаминовой кислоты, цистеином и глицином и содержащий нетипичную (некарбоксамидную) г -связь между первой и второй аминокислотами. В отличие от фенольных соединений, он способен эффективно инактивировать реакционные нерадикальные формы АФК, а также разлагать гидроперекиси с образованием спиртов (Меньщикова, 2006).

Основной антиоксидантный эффект глутатиона реализуется посредством его участия в работе ферментативных антиоксидантов: глутатион выступает донором атомов водорода для перекиси водорода и липидных перекисей (Кулинский, Колесниченко, 1990). Вместе с тем, он является ингибитором АФК и стабилизатором мембран (Rice-Evans, 1992). Существует мнение, что взаимодействие глутатиона с органическими радикалами эффективно только в условиях удаления О2-, поэтому глутатион образует с СОД своеобразную антиоксидантную систему, ибо в противном случае развиваются реакции образования перекиси водорода и реакционных радикалов (Munday, Winterboume, 1989).

Следующий компонент низкомолекулярной антиоксидантной системы - витамин Е (б-токоферол). Главный источник витамина Е для человека - зерновые и бобовые культуры, орехи; особенно много токоферолов в проростках ржи, гороха, пшеницы. Фрукты также являются важным источником витамина Е, в то время как в овощах, за исключением некоторых салатных культур (шпинат, аспарагус) содержание токоферолов очень незначительно. Витамин Е устойчив и не разрушается под действием пищевых кислот, а также выдерживает кратковременное нагревание до 200?С. Биологическое действие витамина Е преимущественно связывается с его антиоксидантными свойствами, которые в большей или меньшей степени проявляются на всех уровнях организации - от субклеточных частиц и мембранных образований до организма в целом. На сегодняшний день классическая теория действия токоферолов предполагает передачу атомов водорода с молекулы токоферола (Тф-ОН) на пероксильный радикал ROO? с образованием гидроперекиси (Меньщикова, 2006):

Тф-ОН + (ROO?.------Тф-О. + + ROOH.

Будучи липофильными соединениями, токоферолы обладают выраженными мембранотропными свойствами и способны стабилизировать клеточные мембраны (Кузьменко, Клименко, Алексеев и др., 1994).

Кроме всех выше перечисленных низкомолекулярных соединений, антиоксидантными свойствами обладают и каротиноиды. По химической природе каротиноиды относятся к огромному классу терпеноидов, включающих также эфирные масла, фитогормоны, стероиды, сердечные гликозиды, жирорастворимые витамины, млечный сок. Их углеводородная структура состоит из цепи двух или более изопренов (С5-углеводородов). Каротиноиды относятся к тетратерпенам; они состоят из длинных ветвящихся углеводородных цепей, содержащих несколько сопряженных двойных связей, заканчивающихся на одном (g-каротин) или обоих концах (b-каротин) кольцевой циклической структурой -- иононовым кольцом (Никитюк, 1974). В зависимости от степени поглощения каротиноиды разделяются на 2 группы: каротины и ксантофилы. Все незамещенные каротиноиды -- каротины. Они не содержат атомов кислорода, являются чистыми углеводородами и обычно имеют оранжевый цвет (например, b - каротин). Каротиноиды, окрашенные в цвета от желтого до красного, характеризуются наличием кислородсодержащих функциональных групп и называются ксантофилами.

Показано, что каротиноиды - эффективные антиоксиданты, действующие в отношении алкоксильных и перекисных радикалов, синглетного кислорода, NO-радикалов и пероксинитрита (Yoshioka, Hayakawa, , Ishizuka, 2006).

Еще одним представителем низкомолекулярной антиоксидантной системы является аскорбиновая кислота (витамин С). Она синтезируется всеми хлорофиллсодержащими растениями, пресмыкающимися и земноводными.

Аскорбиновая кислота нестабильна, легко разрушается при нагревании в щелочных условиях, а также под действием кислорода в присутствии ионов металлов переменной валентности, катализирующих ее окисление с образованием неактивных продуктов. Основной источник витамина С - свежие овощи и фрукты (Меньщикова, 2006).

В экспериментальных исследованиях было установлено, что акорбиновая кислота может восстанавливать б-токоферольный радикал, тем самым возвращая витамину Е антиоксидантные свойства (Rice-Evans,1991) . Это позволяет предположить, что аскорбиновая кислота превосходит другие антиоксиданты в защите липидов от перекисного окисления, так как только это соединение достаточно реакционноспособно, чтобы эффективно ингибировать инициацию ПОЛ в водной фазе. В присутствии Fe3+ или Cu+ аскорбат становится мощным прооксидантом (Bast, Haenen, Doelman, 1991): он переводит ионы в восстановленное состояние и тем самым индуцирует разложение органических перекисей.

Ферментативные антиоксиданты являются средством внутриклеточной защиты клетки (Меньщикова, 2006). К такому роду АО относятся в первую очередь супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, различные пероксидазы и другие белки. Работа каждого антиоксидантного фермента связана с элиминацией строго определенного окислительного субстрата. Ферментные АО обладают также специфичностью клеточной и органной локализации, которые зачастую перекрываются комплементарным образом (Меньщикова, 2006; Крысин, Сорокина, 2006). Уровень внутриклеточных ферментативных антиоксидантов находится под генетическим контролем. Воздействия, приводящие к усилению образования О2- и Н2О2, индуцируют синтез ферментативных АО (Меньщикова, 2006).

Супероксиддисмутаза (СОД) - фермент, выполняющий не только защитную, но и регуляторную функции; является ключевым звеном системы регуляции стационарной концентрации О2- (Меньщикова, 2006).

Данный фермент катализирует реакцию дисмутации О2- с образованием перекиси водорода, которая в дальнейшем разлагается с помощью фермента каталазы, и молекулярного кислорода. Эти реакции экзотермичны, катализирующие их СОД и каталаза не нуждаются в кофакторах, что делает их работу автономной, не зависящей от функционирования других клеточных структур (Меньщикова, 2006).

Биологическая выгода элиминирования О2- СОД не вполне очевидна - токсичность супероксид-аниона невысока, более того в химическом отношении он скорее восстановитель, чем окислитель. Образовавшаяся в результате реакции дисмутации перекись водорода является более сильным окислителем, дающем начало чрезвычайно активному ОН-радикалу. Вместе с тем, СОД удаляя О2-, не дает ему взаимодействовать с NO*, тем самым предотвращая образование пероксинитрита (гораздо более опасного прооксиданта, чем перекись водорода) (Меньщикова, 2006).

СОД имеет несколько изоферментных форм, отличающихся строением активного центра: медь-цинковая (Cu-Zn-СОД), марганцевая (Mn-СОД), экстрацеллюлярная (Э-СОД), железосодержащая (Fe-СОД).

Cu-Zn-СОД - главный цитозольный изофермент, но также обнаружен в ядрах, пероксисомах, лизосомах и митохондриях клеток эукариот. Mn-СОД локализована в митохондриях и матриксе хлоропластов эукариот. Данные изоформы являются преимущественно внутриклеточными ферментами и в межклеточных жидкостях быстро разрушаются (в течение 5-25 мин).

Э-СОД осуществляет дисмутацию супероксиданиона во внеклеточном матриксе; она также содержит в активном центре по одному атому меди и цинка.

Fe-СОД является наиболее древним в эволюционном плане изоферментом; имеет широкое филогенетическое распределение - от бактерий через простейших до растений-эукариот, относящихся к семействам Gingkoceae, Cruciferae, Nymphaceae (Меньщикова, 2006).

Каталаза - гемсодержащий фермент с молекулярной массой около 250 кДа. Ее каталитическая активность определяется во всех растениях и микроорганизмах, за исключением облигатных анаэробов. Разложение перекиси водорода каталазой осуществляется в двух реакциях:

Кат-Fe3+ + Н2О2-------(окисленная каталаза)

(окисленная каталаза) + Н2О2--------- Кат-Fe3+ + Н2О + О2

В окисленном состоянии каталаза может работать как пероксидаза, катализируя окисление спиртов, фенолов или альдегидов:

(окисленная каталаза) + АН2------- Кат-Fe3+ + 2Н2О + А

Также показана и прооксидантная роль каталазы: так, она может выступать источником образования АФК - около 0,5% кислорода, образующегося в результате разложения Н2О2, возникает в возбужденном состоянии.

В клетках, согласно современным представлениям, каталаза препятствует накоплению перекиси водорода, оказывающей повреждающее действие на клеточные компоненты.

Также одним главных компонентов высокомолекулярной антиоксидантной системы является пероксидаза.

Пероксидаза способна катализировать окисление различных неорганических и органических соединений. Обладая широкой субстратной специфичностью, она может проявлять свойства оксидазы. Утилизация активных форм кислорода, образующихся на мембранах, например, митохондрий или хлоропластов (Рогожин, 2004), и окисление различных полифенолов пероксидазами, вероятно, является эффективной защитой, как от самоповреждения клеток при окислительном взрыве, так и от разрушения клеточных структур в результате воздействия неблагоприятных внешних условий (Jansen et al., 2001). Кроме того, уровень ее активности может определять устойчивость растений к различным факторам внешней среды. Трансгенные растения, у которых блокирован синтез данного фермента, оказались чувствительными к окислительному стрессу (Rizhsky et al., 2002).

Фенольные соединения: структура, функции, распространение в высших растениях.

К фенольным соединениям относят вещества, содержащие в своей молекуле бензольное кольцо, которое несет одну или несколько гидроксильных групп, называемых также "фенольными". Соединения, имеющие две и более фенольные гидроксигруппы, получили название полифенолов. И хотя растительные фенолы отнесены к веществам вторичного или специализированного метаболизма, которым по определению свойственна хемоспецифичность, многие из них, например, флавоноиды или лигнин, универсальны по своей распространенности в природе. В основу классификации природных фенолов положен биогенетический принцип, согласно которому группы располагают в порядке усложнения молекулярной структуры.

Структура и классификация фенольных соединений.

Простейшим представителем фенольных соединений является сам фенол:

Рис. 1

Двухатомных фенолов (дезоксибензолов) существует уже три: пирокатехин, резорцин и гидрохинон.

Рис. 2

К трехатомным фенолам (триоксибензолам) принадлежат: пирогаллол, флороглюцин, оксигидрохинон.

Рис. 3

Число природных фенольных соединений весьма велико. К настоящему времени их известно уже более двух тысяч, и с каждым годом это количество возрастает.

В растениях, наряду с фенольными соединениями простого строения, встречаются и гораздо более сложные, многоядерные, например, госсипол и гиперицин. Известны также фенольные соединения, содержащие помимо ароматических ядер непредельные белковые цепи чаще всего изопренильной природы. Такими являются кортизалин и целебиксантон.

Ряд фенольных соединений относится к азотосодержащим веществам, - некоторые алколоиды мака снотворного (Papaver somniferum) и бетацианины - красящие вещества столовой свеклы (Beta vulgaris var. Esculenta).

Для того чтобы разобраться в многочисленном разнообразии природных соединений фенольных соединений, проще всего положить в основу их классификации биогенетический принцип. Согласно современным представлениям о биосинтезе фенольных соединений являются соединения С6-С1 - ряда, т.е. соединения, состоящие из ароматического (фенольного) ядра и одноуглеродной боковой цепи. При усложнении биосинтетической последовательности образуются фенольные соединения С6-С3 - ряда, состоящие из ароматического ядра и трехуглеродной боковой цепи. Еще более сложным путем образуются фенольные соединения С6-С3-С6 - ряда (флавоноиды), состоящие из двух ароматических ядер, соедненных между собой трехуглеродным фрагментом. Почти все остальные фенольные соединения (в том числе и полимерные) образуются из этих основных структур при помощи вторичных реакций (этерификация, гликозидирование, метилирование, b - окисление, декарбоксилирование, ацилирование и окислительная конденсация). Такая классификация позволяет вычленить наиболее часто встречающиеся в растениях фенольные соединения или фенольные соединения всеобщего распространения.

Группа С6-С1-соединений. Она представлена прежде всего оксибензойными кислотами: n - оксибензойной, салициловой, b - резорциловой, протокатеховой, гентизиновой, ванилиновой, галловой и сиреневой (Запрометов, 1974). Почти все оксибензойные кислоты широко распространены в растениях. Они обычно содержатся в растительных тканях в связанной форме и высвобождаются лишь после гидролиза. Простейшим примером связанных оксибензойных кислот может выступать глюкогаллин, найденный в ревене и эвкалипте. Во многих растениях обнаружен димер галловой кислоты - м-дигалловая кислота, являющаяся родоначальником дубильных веществ гидролизуемого ряда.

Помимо оксибензойных кислот, в группу С6-С1 - соединений входят соответствующие альдегиды и спирты. Наиболее известен ванилин, который в малой концентрации обладает приятным запахом, вследствие чего распространен в хлебопекарной промышленности. Ванилин в виде гликозида содержится в стручках фасоли.

Также к данной группе соединений можно отнести несколько стоящие особняком лишайниковые кислоты - специфические фенольные соединения, синтезируемые лишайниками. Исходным компонентом в образовании лишайниковых кислот является орселлиновая кислота.

Группа С6-С3-соединений. К фенольным соединениям С6-С3 ряда - относится большая группа чрезвычайно широко распространенных фенольных соединений, которая может быть разбита на две подгруппы: производные коричной кислоты и кумарины (Запрометов, 1974).

Коричная кислота. Сама коричная кислота не является фенольным соединением, потому что она не имеет гидроксильной (фенольной) группы в бензольном ядре. В растениях она может быть обнаружена в небольших количествах в качестве промежуточного продукта биосинтеза оксикоричных кислот: n-оксикоричной, кофейной, феруловой и синаповой. Оксикоричные кислоты обнаружены у всех исследованных высших растений. Характерной их особенностью является способность к цич-транс изомерии. Другой характерной особенностью оксикоричных кислот является образование сложных эфиров с ациклическими кислотами - хинной и шикимовой. Наиболее широко известным соединением такого типа является хлорогеновая кислота.

Кумарины. Кумарин представляет собой лактон цис-0-кумаровой кислоты. Наиболее важными производными кумарина являются: умбеллиферон, эскулетин, скополетин. Умбеллиферон - производное n-кумаровой, эскулетин - кофейной и скополетин - феруловой кислоты. Все они отличаются горьким вкусом (Блажей, Шутый, 1977). Кроме кумаринов сравнительно простого строения в растениях встречаются и значительно более сложные, например фурокумаринбергаптол, содержащийся в бергамотовом масле. К настоящему времени известно около 200 кумаринов, многие из которых имеют сложное строение. Большинство кумаринов не являются фенольными соединениями, т.к. не содержат фенольных оксигрупп. Их распространение в растениях ограничивается определенными семействами, что связано с наличием фермента орто-гидроксилазы коричной кислоты. Только растения, содержащие данный фермен, могут образовывать кумарины.

Группа С6-С3-С6-соединений или флавоноиды. Под флавоноидами подразумеваются фенольные соединения, содержащие 15 атомов углерода. Девять из них чаще всего входят в состав остатка оксикоричной кислоты, который конденсируется с флороглюцином; таким образом, фенилпропановый остаток С9 в растительных фенолах является преобладающим. Этот остаток является также основным звеном макромолекулы лигнина (Блажей, Шутый, 1977).

Флавоноиды могут быть разбиты на 10 основных подгрупп в зависимости от степени окисленности (востановленности) трехуглеродного фрагмента.

Разнообразие природных флавоноидов достигается за счет наличия ассиметрических атомов углерода в гетероцикле (у катехинов, флавононов, флавонолов и лейкоантоцианидинов), различной картины гидроксилирования, метилирования, метоксилирования, гликозилирования и ацилирования ароматических ядер.

Катехины, дигидрохалконы, лейкоантоцианидины, влавононы и флавонолы являются бесцветными веществами, все остальные подгруппы представляют собой окрашенные соединения.

Функциональная роль фенольных соединений в растениях.

Как уже было упомянуто ранее фенольные соединения разнообразны как по своей структуре, так и по функциональным значениям, которые они выполняют в растительном организме. Практически все фенольные соединения играют важную роль в защитных реакциях растений. Хорошо установлено, что растительные клетки реагируют на механические повреждения или проникновения патогенов повышением активности фенилаланинаммиак-лиазы, 4-гидроксилазы транс-коричной кислоты, пероксидазы и других ферментов. Это сопровождается "вспышкой" новообразования фенольных соединений. Связываясь с нефенольными полимерами клеточных стенок, лигнин и оксикоричные кислоты способствуют их упрочнению и таким образом препятствуют проникновению патогенов, а также неконтролируемой потере воды. Следует отметить, что усиление процессов лигнификации является одной из стратегий метаболической адаптации к действию стресс-факторов разной природы. Так, холодовое закаливание растений пшеницы приводило к повышению содержания фенольных веществ в 2,5-3 раза, причем в молодых органах синтез их мономерных форм происходил достаточно интенсивно. При этом фенольные соединения, сходные, но не идентичные лигнину древесины, могут участвовать в индукции апоптозподобных процессов (Олениченко, 2006).

Среди защитных функций фенольных соединений выделяют фотопротекторную роль. Известно, что растения, произрастающие в районах тропиков и в альпийских зонах, содержат большее количество фенолов, чем растения умеренных широт. Пигментированные формы культурных растений с высоким содержанием антоцианов происходят в основном из горных районов, например, столовая свекла по сравнению со своим предшественником - листовой свеклой мангольд. Установлено, что эпидермальные клетки, пропуская видимый свет, поглощают до 95% УФ лучей, благодаря повышенному содержанию фенольных соединений, в первую очередь, флавоноидов (Макаренко, 2013).

Считается, что флавоноиды, в частности, антоцианы, снижают риск фотоокислительных повреждений клеток за счет уменьшения количества активных форм кислорода (Feild et al., 2001). Кроме того, они могут связывать ионы тяжелых металлов в устойчивые комплексы. Установлено, что флавоноиды зеленого чая, красного винограда обладают выраженными противораковыми свойствами именно благодаря своему антиоксидантному характеру действия.

Защитная функция фенольных соединений проявляется и в качестве так называемых детеррентов (от лат. deterreo - отпугивать) или антифидантов (от аnti - против и англ. feed - питание) - соединений, снижающих привлекательность и пищевую ценность растительных тканей для фитофагов. Увеличение содержания лигнанов, таннинов, пирокатехола, феруловой кислоты и т.д., наблюдаемое в немолодых листьях, делает их малосъедобными для личинок и взрослых насекомых. Кроме того, прочные белково-танниновые комплексы труднопереваримы, поэтому многие млекопитающие избегают есть растения или их части, накапливающие таннины.

Для многих фенольных соединений характерна сигнальная функция в индукции nod-генов, ответственных за формирование клубеньков у бобовых растений. Салициловая кислота запускает процесс термогенеза у початков цветущих растений многих видов семейства Ароидные, а также реакцию сверхчувствительности при ранениях и атаке патогенов. Часто фенольные соединения определяют взаимоотношения между представителями растительного и животного царств, выполняя таким образом роль пищевых аттрактантов. Например, привлекающая насекомых и птиц окраска цветов, фруктов и семян обусловлена антоцианами, флавононами, флавонолами, нафтохинонами, меланинами и др.

Растительные фенолы являются своего рода модуляторами процессов роста и развития растений, оказывая при этом как стимулирующее, так и ингибирующее влияние. Фенольные соединения, содержащие ортогидроксильную группировку, ингибируют активность ИУК-оксидазы, а монофенолы и метадифенолы, наоборот, ее стимулируют. Фенольные соединения наряду с фитогормоном АБК входят в состав так называемого в- ингибиторного комплекса, который ответственен за физиологический покой как семян, у которых он предотвращает прорастание даже в сочных плодах (томаты, огурцы и т.д.), так и вегетирующих растений.

Важная роль фенольных соединений в регуляции ростовых процессов тесно связана с их структурной функцией. Фенольные соединения могут ограничивать рост клеток растяжением посредством образования поперечных связей (преимущественно из диферуловой кислоты) со структурными полисахаридами и гидроксипролином белков первичной клеточной стенки. Более жесткий матрикс образуется при откладывании лигнина, что обусловливает необратимое торможение роста при формировании вторичной клеточной стенки (Горшкова, 2007). Не вызывает сомнений значение фенольных соединений и как аллелопатических агентов, которые участвуют во взаимоотношениях между растениями (Гродзинский, 1991). Кроме того, фенольные соединения являются резервными веществами. Экспериментально доказано, что в клетках высших растений за один день может подвергаться катаболизму, с разрывом бензольного кольца и дальней- шим окислением до углекислого газа, до 10-20% ранее образовавшихся фла- вонолгликозидов (Запрометов, 1974). Хорошо известно, что фенольные соединения играют важную роль в окислительно-восстановительных реакциях, например, в качестве компонентов электрон-транспортных цепей дыхания и фотосинтеза (уби-, филло- и пластохиноны). Некоторые фенольные соединения служат, наоборот, разобщителями или ингибиторами дыхания (салициловая кислота, кумарин, ротенон, платанетин и др.), что широко используется в практике исследований.

Распределение фенольных соединений в тканях и органах растений.

Флавоноиды широко распространены в растительном мире. Особенно богаты флавоноидами высшие растения, относящиеся к семействам розоцветных Rosaceae (различные виды боярышников, черноплодная рябина), бобовых Fabaceae (софора японская, стальник полевой, солодка), гречишных Polygonaceae (различные виды горцев -- перечный, почечуйный, птичий: гречиха), астровых Asteraceae (бессмертник песчаный, сушеница топяная, пижма), яснотковых Lamiaceae (пустырник сердечный).

Более часто флавоноиды встречаются в тропических и альпийских растениях. Обнаружены и у низших растений: зеленые водоросли (ряски), споровые (мхи, папоротники), хвощи (хвощ полевой), а также у некоторых насекомых (мраморно-белая бабочка).

Находятся флавоноиды в различных органах, но чаще в надземных: цветках, листьях, плодах; значительно меньше их в стеблях и подземных органах (солодка, шлемник байкальский, стальник полевой). Наиболее богаты ими молодые цветки, незрелые плоды. Локализуются в клеточном соке в растворенном виде.

Простейшие фенольные соединения встречаются в растениях крайне редко. Фенол был обнаружен в иглах и шишках сосны (Pinus silvestris), в составе эфирного масла листьев черной смородины и некоторых других растений. Пирокатехин в довольно малых количествах найден в чешуе лука (Allium cepa) и листьях бадана (Bergeniz crassifolia), а флороглюцин - в шишках секвойи (Sequoia sempervirens). Чаще других встречается гидрохинон, который был выделен из коры и листьев груши и листьев бадана. Известны также гликозиды этих простейших фенольных соединений. Например, глюкозид гидрохинона - арбутин является одним из характерных компонентов листьев, коры и семян груши, глюкозид флороглюцина - флорин содержится в кожуре плодов цитрусовых (Запрометов, 1974).

Фенольные соединения ряда С6-С3-С6 наиболее широко распространены в природе, и многие из них принимают участие в формировании аромата и цвета растительных продуктов. Например, катехины содержатся в плодах и овощах в свободном или связанном (в составе полимерных форм) состоянии. Много катехинов содержится в винограде, айве, черной смородине, яблоках. Катехины хорошо растворимы в воде и имеют слабый вяжущий вкус. Продукты окисления - хиноны - и полимеризация катехинов - флобафены - придают плодам и овощам при термической и механической обработке темную окраску.

Интенсивность накопления фенольных соединений зависит от периода развития, органа растения, возрастного состояния и климатических условий. Наличие фенольных соединений наблюдается во всех органах, однако наибольшее количество фенольных соединений наблюдается в надземных органах в фазу вегетации и цветения растения.

Поллютанты и их влияние на антиоксидантную систему растений.

В последние десятилетия в связи с быстрым развитием промышленности во всем мире, происходит загрязнение среды тяжелыми металлами. Они являются одними из наиболее распространенных поллютантов в условиях города, оказывая токсичное, негативное влияние на все живые организмы, в том числе и на растения (Титов, Таланова и др., 2007).

К основным проявлениям токсического действия тяжелых металлов на растения относятся: нарушение процессов роста и деления клеток, приводящее к нарушению развития морфологических структур; усиление процессов свободнорадикального окисления и липопероксидации, угнетение процессов фотосинтеза и повреждение фотосинтетического аппарата (Ерофеева, Наумова, 2010).

Характеристика поллютантов.

К тяжелым металлам относят химические элементы, которые имеют плотность более 5 г/см3 и атомную массу свыше 40 Да, обладающие свойствами металлов. Среди них имеются элементы, жизненно важные для существования растений (Cu, Zn, Co, Cr, Mn), а также элементы (Cd, Hg, Pb), функциональная роль которых в настоящее время доподлинно неизвестна. Во всех международных документах, посвященным проблемам загрязнения окружающей среды, более 10 тяжелых металлов признаны опасными, а самыми токсичными из них являются ртуть, свинец и кадмий (Алексеев, 1987; Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989).

Увеличение концентрации тяжелых металлов в растениях напрямую коррелирует с увеличением содержания их в почве. Однако прямая взаимосвязь обнаруживается не всегда, т.к. поток тяжелых металлов из почвы в растения определяется не только валовым содержанием, но и содержанием в почве их подвижных форм. Доступность металлов для поглощения растениями зависит от того, компонентами какой из почвенных фракций они являются:

1) свободные ионы металла и растворимые комплексы;

2) ионы металла, занимающие ионообменные сайты и специфически адсорбированные на неорганических почвенных компонентах;

3) металлы, связанные с органическими веществами (гумус, аминокислоты, сахара и т.д.);

4) преципитаты или нерастворимые соединения (оксиды, карбонаты, гидроксиды);

5) металлы в структуре силикатов

Растениям легко доступны металлы из первой и второй фракций.

Тяжелые металлы (в частности кадмий) в растения из почвы могут поступать несколькими путями.

Во - первых, в ризосферу секретируются молекулы веществ, хелатирующие ионы металлов (фитосидерофоры), что приводит к повышению их растворимости.

Во - вторых, доказана способность специфических металлоредуктаз восстанавливать связанные почвой ионы металлов.

В - третьих, в прикорневом слое почвы растворимость соединений тяжелых металлов может увеличиваться вследствие понижения pH почвенного раствора под действие протонов, поступающих из корня. Низкие значения pH обеспечивают перевод труднодоступных ионов тяжелых металлов в почвенный раствор.

Рис. 4. Модель возможных путей поступления кадмия в растения и его транспорта (по М.Н. Запрометову)

Ионы металлов могут поступать в корень апопластным или симпластным путем. Токсичные металлы могут эффективно поступать в клетку посредством трансмембранных переносчиков. Далее более подробно будет рассмотрен механизм поступления исследуемого поллютанта кадмия.

Считается, что кадмий, не входящий в число необходимых элементов, эффективно поглощается корневой системой растения. Поступление кадмия увеличивается с повышением его концентрации в почве или питательном растворе. Однако получить воспроизводимые результаты, которые раскрывают механизмы его поглощения, невозможно вследствие трудности удаления адсорбированного кадмия с поверхности корня и явных симптомов токсичности.

Факторы, влияющие на поглощение кадмия являются pH почвы (при значение pH = 6 и более, его растворимость и биодоступность снижается) и хелатирующие агенты. Агенты либо снижают доступность кадмия, либо повышают. Кромы вышеуказанных почвенных факторов на процессы аккумуляции кадмия влияет наличие некоторых катионов. Так, ионы Са2+ снижают поступление этого металла, вследствие уменьшения адсорбции корнями; высокие концентрации Zn2+, Fe3+ ингибируют поглощение и транспорт кадмия в надземные части растений.

Изучение Ю. П. Мельничуком и K. Tanaka поступления кадмия в стебель показало наличие нескольких периодов его передвижения. В лаг-фазе (первые 30 - 60 мин) он накапливается в стебле. На протяжении следующих 6 часов происходит насыщение кадмием ксилемы и примыкающих тканей. Потом наступает линейная фаза, характеризующаяся постоянной скоростью накопления кадмия. Кадмий из ксилемы попадает не только в паренхимальные клетки, связанные с сосудами, он распространяется радиально во все ткани, включая эпидермис.

Действие поллютантов на антиоксидантную систему растений.

Одним из наиболее опасных последствий повышения содержания тяжелых металлов в растениях является развитие в клетках окислительного стресса, вызванного образованием избыточного количества активных форм кислорода (АФК), обладающих чрезвычайно высокой реакционной способностью (Sandalio et al., 2001). При этом некоторые тяжелые металлы участвуют в окислительно-восстановительных реакциях в клетке и могут непосредственно генерировать АФК в реакциях Габера-Вейса и Фентона (Co, Cr, Cu и Fe), тогда как другие (Cd, Ni, Pb, Zn и др.) не принимают участие в этих реакциях и вызывают накопление АФК опосредованно, например, за счет вызываемых ими нарушений в структуре хлоропластов и митохондрий (Sandalio et al., 2001) или инактивации ферментов антиоксидантной защиты (Dietz et al., 1999; Schьtzendьbel, Polle, 2002).

У высших растений АФК в норме быстро инактивируются благодаря работе антиоксидантной системы (АОС). При действии же неблагоприятных факторов внешней среды, в том числе тяжелых металлов, образование АФК значительно усиливается, вызывая повреждение белков и нуклеиновых кислот, окисление липидов (Finkel, Holbrook, 2000; Колупаев, 2007; Djebali et al., 2008). Например, в присутствии кадмия в клетках корня и листа гороха окислительный стресс вызывает заметное увеличение количества поврежденных белков, образованных вследствие их карбонилирования (необратимого окислительного повреждения) активными формами кислорода (Romero-Puertas et al., 2002). Для нуклеиновых кислот наиболее токсичной формой АФК является гидроксил-радикал, повышение содержания которого приводит к нарушению пуриновых и пиримидиновых оснований молекулы ДНК (Владимиров, 1972).

Окислительный стресс является также причиной перекисного окисления липидов (ПОЛ), при котором возникает целый каскад последовательных свободнорадикальных реакций с образованием различных химических соединений (спиртов, альдегидов, кетонов), обладающих высокой биологической активностью и токсичностью. В результате ПОЛ нарушается структура клеточных мембран, снижается их пластичность, изменяется про- ницаемость (Сазанова и др., 2012).

Основными причинами возникновения окислительного стресса в клетках растений в присутствии тяжелых металлов, независимо от их окислительно-восстановительной активности, являются: ингибирующее действие их ионов на скорость электронного транспорта на мембранах хлоропластов и митохондрий, изменения в структуре антиоксидантных ферментов в результате связывания токсичных ионов с сульфгидрильными группами белков, а также замена в молекуле необходимых ионов металлов на токсичные ионы, что приводит к снижению их активности. Наконец, в присутствии тяжелых металлов уменьшается содержание некоторых антиоксидантных неферментных соединений, таких как глутатион, вследствие использования его молекул на синтез ФХ. Все это способствует увеличению содержания АФК в клетке растений и развитию окислительного стресса (Сазанова и др., 2012).

Однако, несмотря на явно выраженные негативные последствия, вызываемые повышением содержания АФК в клетках, растения обладают довольно высокой устойчивостью к окислительному стрессу. Это обусловлено наличием у них достаточно эффективной системы антиоксидантной защиты (Hall, 2002; Полесская, 2007; Gamalero et al., 2009). Основными антиоксидантными ферментами являются: суперок- сиддисмутаза, каталаза, гваякол-зависимая пероксидаза, глутатион- трансфераза, а также ферменты аскорбат-глутатионового цикла, среди которых аскорбатпероксидаза, глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза (Noctor, Foyer, 1998).

Согласно результатам многих исследований, активность антиоксидантных ферментов в присутствии тяжелых металлов, как правило, увеличивается, что способствует снижению уровня АФК. Возрастание активности является следствием синтеза ферментов de novo и, как показывает анализ литературы (на примере кадмия), практически не зависит от концентрации металла и вида растений.

Гречиха обыкновенная: морфология, онтогенез, накопление фенольных соединений.

Морфологические характеристики гречихи.

Существует несколько видов гречихи (обыкновенная, татарская, полузонтичная, округлая). В производственных условиях встречаются два вида: гречиха обыкновенная, которая представлена большим числом возделываемых селекционных и местных сортов, гречиха татарская, которая встречается как сорное растение в посевах культурных растений.

Гречиха относится к семейству Гречишные с 30 - 35 родами и около 1000 видов, распространенными по всему миру, но преимущественно в умеренных областях северного полушария (Яковлев, Челомбитько, 2001). Характерная особенность семейства - срастание прилистников в пленчатую трубку (раструб), охватывающую членистый стебель.

Центр формообразования гречихи обыкновенной - Юго - Западный Китай. В последующем антропогенно она распространилась в северные региона Китая, Корею, Японию, а затем в Европу и Сибирь. Этому способствовали уникальные питательные особенности зерна, способность к интенсивному росту, неприхотливость к почвам и наличие скороспелых форм. (Marshall, Pomeranz, 1983).

Корневая система. Корневая система у гречихи стержневая, проникает в почву на глубину до 1 м и распределяющаяся в ширину до 24 см. Основная масса корневых ответвлений находится на глубине до 40 см. М.П. Архангельский (1940), изучая корневую систему гречихи, установил, что средняя длина ее корней составляет 71, 5 см, средний диаметр - 26, 5 см. В верхнем слое почвы их мало. Особенность корневой системы заключается в том, что ее развитие слабое сравнительно надземной части. Несмотря на это корневая система способна усваивать питательные вещества даже из труднорастворимых соединений (установлено Д.Н. Прянишниковым). В значительной мере это обусловлено выделением органических кислот (муравьиной, уксусной, щавелевой) (Елагин, 1984).

Стебель. Стебель у гречихи пористый, ребристый, состоит из междоузлий, которых в зависимости от сорта может быть от 6 до 20. Высота от 50 до 120 см, окраска чаще всего зеленая с красноватым оттенком, который может усиливаться при большем освещении растений. На нижней части стебля (подсемядольное колено) при достаточном увлажнении почвы и затенении этой части растения образуются стеблевые корни, но почти не развивается плодоносных побегов. На средней части находятся ветви первого, второго, третьего и последующих порядков. (Якименко, 1982). Ветвление зависит от условий произрастания: плодородия почвы, степени удобренности. Чем реже посев, тем сильнее растения ветвятся. На загущенных посевах ветвление ограничивается ветвями первого порядка. На верхней части стебля формируются генеративные органы - цветки и плоды (Елагин, 1984).

Лист. При прорастании появляются два семядольных листочка, округло - почковидной формы с заметным жилкованием и большим количеством устьиц. Затем развиваются черешковые листья сердцевидно - треугольной формы, которые на верхушке стебля и ветвей переходят в сидячие, стреловидные. В месте прикрепления листа к стеблю находится раструб, который образуется в результате срастания прилистников. Раструбы короткие, перепончатые охватывают стебель над основанием черешка. Черешки зеленые или окрашены в красноватый цвет, отходят от основания раструбов. Число листьев за период вегетации растения в среднем составляет 10 - 25 (Якименко, 1982).

Цветки. Цветки обоеполые, с 5-раздельным венчиковидным околоцветником, не разрастающимся при плодах. Тычинок 8, между их основаниями расположено 8 нектарников. Гинецей лизикарпный, состоит обычно из 3 плодолистиков, образующих верхнюю одногнездную завязь с одним ортотропным базальным семязачатком, сидящем на ножке, соответствующей редуцированной центральной колонке. Такой тип строения завязи является отличительной чертой семейства. Столбик сросшийся, с тремя головчатыми рыльцами (Драгавцева, 2006).

Плод. Плод гречихи трехгранная орешек, реже зерновка, выдающийся при созревании из околоцветника. Плод в 2 -3 раза длинее околоцветника, с острыми или тупыми цельнокрайними ребрами и гладкими гранями. Встречаются также четырехгранные и многогранные плоды. Они бывают крылатые и бескрылые, грани плоские или сильно выпуклые. Плод покрыт плотной кожистой оболочкой, которая в зависимости от условий выращивания бывает светло - серой, серебристой, темно - серой, светло - коричневой, темно - коричневой и почти черной. Оболочка плотно прикрывает плод, не срастаясь с ним, поэтому легко отделяется при его обрушивании (Елагин, 1984).

Гречиха обыкновенная не имеет большого разнообразия форм, характерных для культур с широким ареалом. Тем не менее возделывание ее в разных почвенно - климатических зонах, влияние определенных условий внешней среды способствовали формированию отдельных экологических типов, которые различаются между собой по морфологическим признакам, биологическим особенностям и хозяйственной ценности. В основу экологической классификации гречихи положены следующие признаки: высота и толщина стебля, его облиственность, мощность и темп развития растений, отношение к теплу, влаге, свету, длина вегетационного периода.

Особенности онтогенетического развития растений гречихи.

Вегетационный период можно разделить на четыре фазы: 1) прорастание семян и появление всходов; 2) ветвление и бутонизация; 3) цветение; 4) плодообразование и созревание. Однако у гречихи все фазы, за исключением всходов, накладываются одна на другую и продолжаются вплоть до самой уборки. Поэтому их нельзя строго отграничить во времени, а можно отмечать лишь начало фазы и массовое ее наступление (И.Н. Елагин 1984).