Деконтамінація та первинне культивування експлантів Agapanthus Sp.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Деконтамінація та первинне культивування експлантів Agapanthus Sp.

Агапантус (Аgapanthus sp.) - цінна, декоративна рослина, для пришвидшення розмноження якої з комерційною метою використовують культуру тканин [1]. Однак стримуючим чинником для введення в асептичну культуру є глибока контамінація експлантів грибною та бактеріальною мікрофлорою [2, 3]. Основною умовою успішного асептичного культивування є стерилізація внутрішніх тканин без їх пошкодження. Це обумовлено контамінацією поверхневих покривів органів рослин різноманітними грибковими і бактеріальними інфекціями. До того ж за вирощування на штучному живильному середовищі у процесі життєдіяльності вони поглинають з нього поживні речовини, виділяючи токсини, які гальмують біологічні процеси у клітинах рослин, накопичуючись у середовищі, і за тривалого впливу спричиняють їх загибель.

Ефективність процесу (Е1) визначають за відношенням кількості неінфікованих експлантів після стерилізації (с) до вихідної кількості експлантів, що стерилізувалися (s), у відсотках [4]:

E = - х 100%. s

Вплив стерилізаційної речовини залежить від її виду, концентрації, підготовки експлантів та експозиції. Успішне проходження процесу залежить також від щільності та чутливості тканин, що контактують із антисептиком. Вдалий вибір стерилізаційного агента полягає у тому, щоб препарат був наділений високою активністю стосовно всіх мікроорганізмів і, водночас, найменше пошкоджував тканини рослини. Застосування гіпохлориту натрію та перманганату калію для поверхневої стерилізації є малоефективним, тому нами випробувано різні схеми застосування стерилізаційних агентів системної дії (антибіотики, фунгіциди) у комплексі з гіпохлоритом, а також використання різних видів експлантів.

Мета досліджень - визначити оптимальні схеми стерилізації первинних експлантів, регенерації з них рослин in vitro та їх прискорене розмноження.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експланти агапантусу нових сортів Шарлотта (Charlotte) - Agapanthus umbellatus та Чорна магія (Black magic) - Agapanthus praecox культивували in vitro на штучному живильному середовищі Мурасіге і Скуга з додаванням 30 г/л сахарози. Обсяг вибірки становив 50 рослин за трикратної повторності. Кожна рослина була як окреме біологічне повторення [5]. Ефективність стерилізації визначали за М.Е. Ламберо- вою [4].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Встановлено вплив походження рос- лин-донорів на звільнення експлантів від чинників контамінації (табл. 1). Із рослин сорту Шарлотта, які у нативних умовах (in situ) тривалий час росли, квітували та розмножувалися вегетативно, отримано експланти з вищим показником деконтамі- нації порівняно з рослинами, що виросли з насіння і вперше утворили бутони. Це дає змогу припустити, що тривале вегетативне розмноження у природних умовах підвищує контамінацію мікроорганізмами садивного матеріалу.

На ефективність деконтамінації експлантів Agapanthus umbellatus сорту Шарлотта впливало також місце їх ізоляції з донорської рослини in vivo (рис. 1, табл. 2). Найнижча ефективність спостерігалася за

Таблиця 1. Вплив походження рослин-донорів Agapanthus umbellatus на деконтамінацію експлантів (сорт Шарлотта)

Примітка: * експланти, ізольовані із недорозвинених бутонів.

Таблиця 2 Вплив типу експлантів Agapanthus umbellatus на їх деконтамінацію (сорт Шарлотта)

Схема отримання регенерантів Agapanthus umbellatus з експлантів, ізольованих із основи суцвіття (I) та з квітки (II): 1 -- експлант перед введенням in vitro; 2 -- асептичне культивування: а -- утворення адвентивної бруньки; в -- утворення мікророслин використання пазушних бруньок, ізольованих з підземних кореневищ, - контамінація більшості експлантів проявлялася вже на 10-й день культивування, а на 30-й день вільними від контамінації залишився лише один експлант із 100 ізольованих.

Порівняно вищою була ефективність деконтамінації рослин за використання експлантів, ізольованих із квіток, однак вихід адвентивних бруньок був меншим та потребував більше часу.

Застосування основ суцвіть як експлантів під час уведення в культуру in vitro ага- пантусу сорту Шарлотта дало можливість отримати 53% живих експлантів, а ефективність деконтамінації становила 15%. Пізніше цей метод удосконалено нами за результатами випробування ефективності додаткової деконтамінації, що застосовувалася на фоні суміші гіпохлориту натрію та перманганату калію (табл. 3).

Незважаючи на раніше встановлену [6] ефективність застосування антибіотиків для деконтамінації експлантів хости, їхня дія не проявилася щодо Agapanthus [7]. Окрім того, застосування левоміцетину порівняно з контролем (без додаткових деконтамінантів лише суміш гіпохлориту натрію та перманганату калію) вповільнювало утворення та зменшувало кількість адвентивних бруньок - із 3,2 до 1,1% стосовно сорту Шарлотта та із 7,1 до 3,8% щодо сорту Чорна магія.

Таку особливість могла спричинити контамінація експлантів не лише бактеріальною, а й грибною інфекціями. Наприклад, було встановлено грибну інфекцію в ендоспермі Castanea sativa Mill. [8].

Ефективність застосування як додаткової деконтамінації фунгіциду Фундазол (беноміл) статистично не відрізнялася від контролю. Варіант із застосуванням Преві- кур Енерджі 840 SL був ефективнішим як порівняно з контролем, так і з рештою досліджуваних варіантів за усіма показниками. Зокрема, виживання експлантів у сорті Шарлотта порівняно з контролем зросло із 52,1 до 71,5%, показник деконтамінації зріс із 14,2 до 40,8%. Зменшився період, необхідний для утворення в експлантів адвентивних вегетативних бруньок, які відокремлювалися і у наступних субкультивуваннях утворювали мікророслини. Також зафіксовано збільшення виходу регенерантів з експлантів із 3,2 (на контролі) до 24,3%. Максим Форте 050 FS був ефективнішим від контролю за усіма показниками, але поступався Превікур Енерджі 840 SL.

Отже, зростання частки живих експлан- тів після стерилізації та скорочення тривалості необхідного періоду для утворення адвентивних бруньок і збільшення виходу регенерантів свідчить не лише про вплив деконтамінації (фунгіцидна дія), але й про стимулюючий ефект від застосування цього препарату на регенераційний процес. Таблиця 3

Вплив комплексного застосування антибіотиків і фунгіцидів із гіпохлоритом натрію на деконтамінацію експлантів (основа суцвіття) Agapanthus umbellatus

Походження первинних експлантів впливало на утворення рослин-регенерантів (рис. 2).

Із основи суцвіття формувалася одна велика рослина, тоді як з квітки впродовж довшого періоду формувалася більша кількість регенерантів менших розмірів. Сам експлант розростався у конгломерат, який від розростання його частин розпадався на шматки. Одні з них мали типові для цього виду листки, а інші - квіткові пелюстки- оцвітини зеленого кольору.

За культивування експлантів, ізольованих із квітки, регенеранти збільшувалися у розмірах та набували зеленого забарвлення. У місцях прикріплення закладалися бруньки як квіткові, так і вегетативні, розросталося квітколоже. Однак утворення пагонів з таких бруньок відбувалося повільніше порівняно із бруньками, що утворилися в основі суцвіття. Частина експлантів набувала ознак вітрифікації (гіпергідрата- ції). Проте із основи суцвіття утворювався один, рідше - два регенеранти, тоді як на експлантах квіткового походження їх утворювалося 5-9 (рис. 3), іноді до 20 шт.

У першому випадку рослини були більших розмірів та утворювали дочірні рослини, в другому - регенеровані рослини були менших розмірів і щільно розміщувалися одна біля одної на експланті.

За субкультивування in vitro встановлено вплив віку рослин донорів експлантів на ефективність регенерації із них рослин- регенерантів (рис. 4, табл. 4). Використання донорів експлантів віком 30 і 45 днів зумовлювало низьку приживлюваність (27-58%).

Рис. 2. Утворення первинних регенерантів Agapanthus umbellatus із експлантів на 45-й день культивування: 1 -- регенеранти із основи суцвіття; 2 -- регенеранти із квітки; 3 -- вітрифіковані регенеранти із квітки

Рис. 3. Утворення первинних регенерантів Agapanthus umbellatus із експлантів на 90-й день культивування: 1 -- регенеранти із основи суцвіття; 2 -- регенеранти із квітки; а -- утворення дочірніх рослин

За висотою пагона регенеранти цих варіантів істотно відрізнялися від рослин, ізольованих із 90-денних донорів. Так, висота регенерантів сорту Шарлотта із донорів віком 90 днів становила 82 мм при 16 і 18 мм у регенерантів із донорів віком 30 і 45 днів відповідно. Отже, для клонального мікророзмноження агапантусу сортів Шарлотта, Чорна магія доцільним є використання рослин-донорів експлантів віком 90 днів.

Таблиця 4 Вплив віку донорів експлантів на приживання та морфогенез регенерації рослин

ВИСНОВКИ

Тривале вирощування рослин донорів in situ збільшує частку контамінації ізольованих із них експлантів. Встановлено високу ефективність від ізоляції експлантів представників роду Agapanthus із основи суцвіття внаслідок їх найменшої контамінації. Для перших субкультивувань доцільно застосовувати вихідні рослини віком 90 днів. Встановлено високу ефективність деконтамінації експлантів способом замочування їх у розчині системного фунгіциду Превікур Енерджі 840

Рис. 4. Вплив віку вихідних рослин на приживання ізольованих мікропагонів через: 1 -- 30 днів; 2 -- 45 днів; 3 -- 90 днів

ЛІТЕРАТУРА

антибіотик фунгіцид експлант рослина

1. 4 klover aims to delight everyone // Gartner tidende. - 2012. - No. 2. - P. 44.

2. Baskaran P. Rapid in vitro micropropagation of Agapanthus praecox / P Baskaran, JV Staden // Rapid South African Journal of Botany. - 2013. -Vol. 86. - P. 46-50.

3. Somaclonal Variation and Stability of GUS Gene Expression in Transgenic Agapanthus (Agapanthus praecox ssp. orientalis) Plants at the Flowering Stage / Shiro Mori, Eriko Oka, Hiroto Umehara et al. // In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant. - 2007. - Vol. 43. - No. 1. - Р. 79 -87.

4. Пат. 2324338 Российская Федерация. Способ получения биомассы in vitro / М.Э. Ламберова, В.Н. Хмелев, А.А. Ламберова и др.; заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова». - Заявл. 25.01.2007; опубл. 20.05.2008, Бюл. № 14 (7 с.).

5. Широконос А.М. Оптимальні вибірки рослин у дослідженнях картоплі в культурі in vitro / А.М. Широконос, В.В. Мацкевич // Фізіологія і біохімія культурних рослин. - 2002. - Вип. 34, № 4. - С. 353-359.

6. Мацкевич В.В. Особливості стерилізації експлантів хости / В.В. Мацкевич, Л.М. Філіпова, Р.Д. Диба // Науковий вісник НЛТУ України. - 2013. - Вип. 23.5 - С. 183-187.

7. Мацкевич В.В. Особливості введення in vitro Aga- panthus umbellatus / В.В.Мацкевич, Р.Д. Диба, Л.М. Філіпова // Тези доповідей державної науково-практичної конференції «Новітні технології в рослинництві». - Біла Церква, 2013. - С. 4.

Размещено на Allbest.ru