Влияние стрессовых ситуаций на организм спортивных лошадей и разработка методов их коррекции

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Влияние стрессовых ситуаций на организм спортивных лошадей и разработка методов их коррекции

06.02.01 - Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

На правах рукописи

Сапожникова Ольга Геннадиевна

г. Ставрополь - 2010 г.

Работа выполнена на кафедре терапии и фармакологии ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук Оробец Владимир Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Квочко Андрей Николаевич

доктор ветеринарных наук, профессор Никулин Иван Алексеевич

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет»

Защита состоится 8 октября 2010 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 220.062.02. при ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» по адресу: 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет»

Автореферат размещен на официальном сайте ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет».

Ученый секретарь диссертационного совета Дьяченко Ю.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Известно, что предупреждение или снижение отрицательных последствий стрессов - один из важнейших факторов сохранения здоровья, повышения продуктивности животных и снижения затрат на получение продукции. В современных условиях животные постоянно подвергаются воздействию множества стресс-факторов (стрессоров), как физических, так и психогенных. Охватывая практически всех особей, подвергнутых перегруппировке, перемещению, вакцинации, стресс снижает резистентность животных, ведет к заболеваемости и падежу, а в конечном итоге к срыву технологических режимов и значительному экономическому ущербу (А.В. Санин, 2006).

Многочисленными исследованиями доказано, что в органах и системах адаптируемого к стрессу организма происходят существенные клинико-биохимические изменения (Р.Р. Арсланов, А.И. Плаксин, О.Е. Цейтловский, 1987; Л.Х. Ашибоков, 1970; О.А. Балакшин, 1964; Ю.Н. Барминцев, А.М. Дзюбенко, 1955; И.Ф. Бобылев, 1961; Н.К. Валк, Л.П. Парышева, А.С. Романова, 1989; Е.И. Зенкович, 1993; П.П. Ипатов, 1957; А.Г. Кудряшов, 1974; Х.Ф. Кушнер, 1939; И.И. Лабутин, 1960; А.Я. Маслобоев, 1958; Н.Д. Горбунова, 2008; Г.Ф. Сергиенко, 1998; В.С. Сергиенко, 2008; P. Burquer, 1983; D. Codazza, 1984).

При изучении биохимических процессов, протекающих в условиях стресса, все большее внимание исследователей привлекают процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ). Фактически активация окисления является неспецифическим признаком стрессированости организма, а при активации некомпенсированной - и важным фактором патогенности (М.И.Рецкий,1997).

В настоящее время, когда требования к спортивным лошадям неуклонно возрастают, их организм не всегда в состоянии перенести необходимую интенсивность тренировочных нагрузок. При этом чаще всего выходят из строя такие наиболее уязвимые звенья организма, как сердечная деятельность, дыхательная система, нервно-рефлекторные механизмы координации движений, сухожильно-связочный аппарат конечностей и другие (Н.Е. Орлова, 2004; Н.Д. Горбунова, 2008; В.С. Сергиенко, 2008).

Особенности тренировки заключаются в постепенном приспособлении организма к интенсивной мышечной деятельности. Эта адаптационная реакция происходит за счет накопления энергетического материала (гликогена, липидов), увеличения потенциальных возможностей окислительного фосфорилирования путем улучшения снабжения организма кислородом, повышения активности ферментативных комплексов, экономии расходования энергетических материалов, меньшего напряжения функциональных систем. Однако интенсивный тренинг лошадей является экстремальным воздействием на организм животных, приводящим к изменению процессов биотрансформации и накоплению токсичных метаболитов (Л.К. Герунова, В.Д. Конвай, Т.В. Бойко, А.Н. Попилов, 2007).

Поскольку стресс проявляется при чрезвычайном воздействии на организм и в практических условиях животноводы встречаются с уже развившейся стресс-реакцией и с отрицательным влиянием ее на продуктивность и жизнеспособность животных, особое значение приобретает комплекс мероприятий, с помощью которых можно существенно снизить его вредное воздействие на организм, то есть стресс-реакцию завершить стадией адаптации и не допустить развития стадии шока, снижения продуктивности и тем более гибели животного.

С каждым годом ветеринарные специалисты разрабатывают новые препараты, обеспечивающие лошади возможность переносить интенсивные тренировочные нагрузки и давать оптимальные результаты на соревнованиях, однако для стимуляции восстановительных процессов можно использовать далеко не все фармакологические средства, так как многие из них содержат в своем составе компоненты, недопустимые с точки зрения антидопингового контроля (С.Ю. Концевая, М.А. Дерхо, Л.Р. Мансурова, 2007).

Поэтому разработка эффективных, недорогих и малотоксичных методов и препаратов для коррекции и профилактики стрессовых состояний имеет большое значение для животноводства, в том числе и спортивного коневодства Российской Федерации.

Цели и задачи исследований. Целью данной работы явилось изучение влияния стрессовых ситуаций на организм спортивных лошадей и разработка методов их коррекции.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

· изучить влияние стрессовых ситуаций на организм спортивных лошадей;

· изучить интенсивность свободнорадикальных процессов и установить уровень образования токсических продуктов перекисного окисления липидов при стрессовых ситуациях;

· оценить терапевтическую эффективность различных методов коррекции стресса;

· разработать научное обоснование к применению метода акупунктуры для коррекции технологического стресса и оценить его терапевтическую эффективность;

· разработать новый препарат для коррекции стресса и изучить его фармако-токсикологические параметры.

Научная новизна. Уточнены и дополнены данные о том, что интенсивные физические нагрузки сопровождаются активацией процессов перекисного окисления липидов и накоплением его токсических продуктов.

Впервые изучено влияние «Гамавита» (ЗАО «Микроплюс») при его применении по методике фармакопунктуры на некоторые морфо-биохимические показатели крови, характеризующие процессы перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной защиты организма кроликов и спортивных лошадей. В работе дано научное обоснование к применению методов акупунктуры для коррекции технологического стресса и определены биологические точки для введения лекарственных средств.

Впервые изучено влияние препарата «Фоспасим» (ООО «Хелвет») на течение стрессовой реакции, дана оценка его влияния на показатели крови мелких животных и лошадей.

Впервые экспериментально и теоретически обосновано применение нового селенсодержащего препарата для коррекции стрессового состояния у животных, определены его фармако-токсикологические свойства и терапевтические дозы. Получена справка о приоритете на изобретение (№ 2009121939 от 08.06.2009 г.).

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые исследованы, уточнены и дополнены данные по анатомо-топографическому расположению биологически активных точек кроликов и лошадей. Получены новые данные об эффективности нетрадиционной терапии в лечении и профилактике стрессов у животных. Изучено влияние точек акупунктуры на функциональное состояние организма, проведен гематологический и биохимический анализ крови животных при акупунктурном введении препарата. Предложена схема профилактики постстрессовых осложнений у животных.

Разработаны и научно обоснованы показания к применению препарата «Фоспасим», которые вошли в нормативно-техническую документацию (ТУ 9337-020-73027337-2009) и инструкцию, утвержденную заместителем руководителя Россельхознадзора Р.Ф.

Предложен новый селенсодержащий препарат и разработана методика его применения для коррекции стрессовых состояний у лошадей. Получена справка о приоритете на изобретение «Препарат для коррекции стрессового состояния у животных» № 2009121939 от 08.06.2009 г.

Полученные результаты могут быть использованы при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по физиологии, фармакологии, клинической диагностике, внутренним незаразным болезням животных в высших учебных заведениях биологического профиля.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Стресс вызывает комплекс изменений в гематологических и биохимических показателях спортивных лошадей.

2. Применение методов акупунктуры, препаратов «Фоспасим» и «Se-C» оказывает регулирующее влияние на активность и сбалансированность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты организма при выраженной стрессовой реакции.

Апробация результатов исследования. Материалы научной работы доложены на 71-й, 72-й, 73-й и 74-й научно-практических конференциях Ставропольского ГАУ (2007 - 2010 гг.), Международной студенческой научной конференции «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки» (Троицк, 2007), Всероссийской студенческой научной конференции (Киров, 2008), Пятой Всероссийской дистанционной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (пос. Персиановский, ДонГАУ, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Перспективы развития агропромышленного комплекса России» (Москва, 2008), Международной научно-практической интернет конференции «Паразитарные, инфекционные и неинфекционные заболевания животных» (Ставрополь, 2008), IX Всероссийской научно-практической конференции (Саратов, 2009), Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди студентов высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства РФ (Москва, 2007-2008 гг.), Международной научно-практической конференции «Современные методы диагностики, профилактики и терапии заразных и незаразных болезней животных» (Ставрополь, 2009 г.), Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди аспирантов высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства РФ (Москва, Ставрополь, Махачкала, 2009-2010 гг.), Шестой Всероссийской дистанционной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (пос. Персиановский, ДонГАУ, 2009), Форуме «Развитие наноиндустрии глазами молодежи» (Ставрополь, 2009 г.), международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2010).

Реализация результатов исследований. Основные результаты научных исследований вошли в отчеты по научно-исследовательской работе Ставропольского государственного аграрного университета в 2007-2010 году. Разработано учебно-методическое пособие «Средства и методы физиотерапии животных» в соавторстве с В.А. Оробец. Разработан новый препарат «Se-C» (получена справка о приоритете). Результаты исследований внедрены в практическую деятельность конноспортивной школы с. Каменнобалковское (Благодарненского района), детско-юношеской конноспортивной школы Буденовского района Ставропольского края.

Материалы диссертации используются в лекционных и практических занятиях ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» по курсам «Ветеринарная фармакология. Токсикология» и «Внутренние незаразные болезни животных».

Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ. Подана заявка на получение патента РФ (справка о приоритете на изобретение № 2009121939 от 08.06.2009 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 230 источников, из которых 58 иностранных авторов, и приложения. Работа содержит 26 таблиц, иллюстрирована 37 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

стресс коррекция животное фармакупунктура

Работа выполнена в период с 2007 по 2010 годы на кафедре терапии и фармакологии «Ставропольского государственного аграрного университета», кафедре органической и физической химии «Северо-Кавказского государственного технического университета», лаборатории патологии обмена веществ «Ставропольского научно-исследовательского института животноводства и кормопроизводства», в конноспортивной школе СтГАУ, конноспортивной школе с. Каменнобалковское (Благодарненского района), детско-юношеской конноспортивной школе Буденовского района Ставропольского края.

В лабораторных, научно-хозяйственных и производственных опытах использовано 62 белых мыши, 84 кролика и 81 спортивная лошадь. Контрольные и опытные группы формировались с учетом принципа аналогов. В опытах использовали клинически здоровых животных.

Эксперимент проводился в 3 этапа.

На первом этапе проводилась оценка влияния стресс-факторов на конкурных лошадей. Научно-производственный опыт проводился на базе конноспортивной школы СтГАУ. Объектом исследования служили лошади в возрасте от 2 до 17 лет чистокровной арабской, ахалтекинской, буденовской, тракененской, англо-кабардинской и карачаевской пород, находящиеся в интенсивном тренинге.

На 2 этапе проводилось моделирование стресса у мелких животных (кроликов) и его коррекция:

- методом фармакупунктуры.

В качестве препарата нормализующего обменные процессы, оказывающего детоксицирующее, биостимулирующее, антиоксидантное и иммуномодулирующее действие использовали «Гамавит» (ЗАО «Микро-плюс», г. Москва). Это комплексный препарат, содержащий экстракт плаценты, а в качестве биогенного стимулятора - иммуномодулятор (нуклеина натрия), 20 аминокислот и 17 витаминов. Экстракт плаценты оказывает стимулирующее действие на функциональные отправления всего организма, улучшает регулирующее действие центральной нервной системы и вегетативной иннервации, гормональную и секреторную деятельность, состояние иммунной системы и кроветворение. Нуклеинат натрия является иммуномодулятором с широким спектром биологической активности. Он индуцирует лейкоцитарную реакцию, стимулирует клетки костного мозга, Т- и В-лимфоциты, повышает антитоксическую резистенность организма. Сбалансированная аминокислотно-витаминная смесь, входящая в состав препарата, нормализует биохимические реакции и является субстратом метаболизма. По литературным источникам данный препарат может способствовать повышению устойчивости к стрессам и улучшению резистентности организма к различным заболеваниям (А.В. Деева и др, 2003, 2007, 2008).

Для коррекции стресса животным первой группы вводили «Гамавит» подкожно в дозе 0,5 мл/кг за 8,6,4 и 2 суток до стресс-воздействия, кроликам второй группы - подкожно «Гамавит» в точки акупунктуры в области 5-го грудного, 5-го поясничного и 2-го крестцового позвонков дважды через 3 дня в дозе 0,5 мл/гол. Поиск биологически активных точек осуществляли аппаратом «Элита- 4» по методикам и атласам М.В.Плахотина (1966) и Г.В.Казеева (2000). Выбор точек основан на данных о триаде Г.Селье, так как воздействием на эти точки можно улучшить функциональную активность тимуса, селезенки, надпочечников, желудка и двенадцатиперстной кишки.

- препаратом «Фоспасим» (состав: Phosphorus D12, Aconite D12, Hyosciamus D12, Passiflora D9, Moshus D4, Ignatia D6);

- селенсодержащим препаратом «Se-C».

Наступление реакции стресса оценивали эозинофильным тестом по методу И.С. Пирамишвили (1987) - по этой методике подсчет количества эозинофилов проводят в счетных камерах и используют специальную жидкость, состоящую из эозина калия, формалина и дистиллированной воды, которая лизирует все формы лейкоцитов, кроме эозинофилов, и одновременно окрашивает эозинофилы в ярко-красный цвет.

На 3 этапе предложенные схемы коррекции стрессового состояния и профилактики стрессовых осложнений отрабатывались на спортивных лошадях.

Отбор проб крови осуществляли вакуумными системами с литий гепарином и использовали для гематологических исследований. Вторую пробирку (без гепарина) с содержимым оставляли на сутки при комнатной температуре или в термостате +37°С на 20-30 минут. Затем центрифугировали в течение 20 минут при 2000 об/мин. Надосадочную часть использовали для биохимических исследований.

Характер, объект и объем исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Характер, объект и объем исследований

№	Вид исследований	Объект и объем исследований
1	Изучение возможности использования методов фармакупунктуры при стрессе у мелких животных	1 опыт: 30 кроликов возрастом 6 месяцев. Проведено 180 гематологических и 540 биохимических исследований. Испытан 1 препарат.
2	Изучение возможности использования препарата «Фоспасим» при стрессе у мелких животных	1 опыт: 30 кроликов возрастом 7 месяцев. Проведено 180 гематологических и 630 биохимических исследований. Испытан 1 препарат.
3	Изучение возможности использования селенсодержащего препарата при стрессе у мелких животных	1 опыт: 62 белых мыши и 4 кролика возрастом 6 месяцев. Проведено 80 гематологических исследований. 2 опыт: 20 кроликов возрастом 6 месяцев. Проведено 120 гематологических и 540 биохимических исследований. Испытан 1 препарат.
4	Исследование влияния стресс-фактора на спортивных лошадей	1 опыт: 21 спортивная лошадь трех возрастных групп. Проведено 756 гематологических, 294 биохимических и 42 клинических исследования
5	Оценка применения методов фармакупунктуры при стрессе у спортивных лошадей	1 опыт: 20 лошадей. Проведено 1440 гематологических, 560 биохимических и 80 клинических исследований. Испытан 1 препарат.
6	Использование «Фоспасима» при стрессе у лошадей	1 опыт: 20 лошадей. Проведено 2160 гематологических, 840 биохимических и 80 клинических исследований. Испытан 1 препарат.
7	Изучение возможности использования селенсодержащего препарата при стрессе у спортивных лошадей	1 опыт: 20 лошадей. Проведено 840 биохимических и 80 клинических исследований. Испытан 1 препарат.

Отбор проб крови осуществляли вакуумными системами с литий гепарином и использовали для гематологических исследований. Вторую пробирку (без гепарина) с содержимым оставляли на сутки при комнатной температуре или в термостате +37°С на 20-30 минут. Затем центрифугировали в течение 20 минут при 2000 об/мин. Надосадочную часть использовали для биохимических исследований.

При определении гематологических и биохимических показателей крови пользовались методиками, представленными И.П. Кондрахиным с соав. (2004). В процессе определения биохимических показателей крови применялись наборы реактивов «БИО-ТЕСТ- Lachema»:

- определяли содержание гемоглобина гематиновым методом Сали с помощью гемометра ГС-3;

- количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывали в камере с сеткой Горяева. Часть исследований проводили на автоматическом анализаторе Abacus junior vet;

- содержание общих липидов в сыворотке крови животных определяли с сульфофосвалиновым реактивом (по Целнеру-Киршу в изложении Л.В. Орлова). Метод основан на цветной реакции продуктов распада ненасыщенных липидов в серной кислоте с реактивом, состоящим из ванилина и ортофосфорной кислоты (А.В. Архипов, А.А. Антонов, 1979; Л.В. Орлов, 1980; И.П. Кондрахин и др., 1985);

- активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ) (К.Ф.2.6.1.1.), аланинаминотрансферазы (АлАТ) (К.Ф. 2.6.1.2.) определяли с помощью биотестов фирмы Lachema динитрофенилгидрозоновым методом (Рейтмана-Френкеля);

- концентрацию общего холестерина определяли с помощью биотестов фирмы Lachema (по Ильку);

- определение содержания липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) проводили по Бурштейну в модификации Виноградовой;

- количество общего белка в сыворотке крови определяли рефрактометрическим методом;

- соотношение белковых фракции крови - турбидиметрическим (нефелометрическим) методом (В.В. Меньшиков, Л.Н. Делекторская, Р.П. Золотницкая и др., 1987);

- перекисную резистентность эритроцитов определяли методом А.А.Покровского (1969);

- содержание ТБК-продуктов (малонового диальдегида) по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (В.С. Бузлама и др., 1997);

- определение содержания креатинина в сыворотке крови проводили по цветной реакции Яффе (метод Лоппера) (В.В. Меньшиков и др., 1987);

- содержание глюкозы определяли по цветной реакции с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты методом Гультмана в модификации Хиваринена-Никкила;

- активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли методом, основанном на способности Н2О2 образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 410 нм (М.А. Королюк, 1988; В.С. Бузлама и др., 1997);

Содержание витаминов определяли методом жидкостной хроматографии на анализаторе Миллихром - 4 -УФ;

Биохимические исследования проводили с использованием фотоэлектроколориметра КФК -2.

Определение острой токсичности, ускоренное определение кумулятивного эффекта и изучение раздражающего действия проводили согласно «Методических рекомендации по токсикологической оценке новых препаратов для лечения и профилактики незаразных болезней животных» (В.Т. Самохин, 1987).

Материалы исследования анализировались, а числовые показатели обрабатывались методом двустороннего критерия Стьюдента в программе Primer of Biostatics 4,03 для Windows 98, на IBM - совместимом компьютере. Достоверными считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование влияния стресс-фактора на спортивных лошадей.

В результате обследования конкурных лошадей до и после нагрузки было установлено, что их организм находится в состоянии повышенного физиологического напряжения, о чем свидетельствуют следующие показатели.

У всех животных наблюдалась незначительная гипергликемия после нагрузки. Другим немало важным биохимическим показателем уровня энергетического обмена в активно работающих мышцах является креатинин. Его уровень до нагрузки у лошадей находился в пределах нормы, а после нагрузки он снизился на 8,3%, при этом, оставаясь в пределах нормы. Активность свободнорадикального окисления липидов оценивают по накоплению липидных перекисей, которые определяют в форме малонового диальдегида (МДА). Повышенная его концентрации у лошадей в 3 раза выше нормы до и после нагрузки свидетельствует об активизации ПОЛ. Это подтверждается и повышенной активностью фермента каталазы до нагрузки на 77% у животных выше нормы, а после нагрузки на 92% выше нормы.

Напряжение в работе сердца было зарегистрировано у всех групп животных, на что указывали близкие к верхней границе нормы значения АсАТ и превышающий в 11 раз норму показатель Де Ритиса у животных. Печеночный показатель АлАТ находился у всех лошадей в пределах нормы с закономерными физиологическими колебаниями до и после работы.

Напряженная мышечная работа вызывает сложную функциональную перестройку организма лошади под ведущим влиянием центральной нервной системы. Эти изменения отражаются на картине крови и процессах кроветворения.

Наибольшим изменениям подвержены показатели красной крови. После тренировки число эритроцитов увеличилось у лошадей на 13%, а содержание гемоглобина на 12,3%. Примерно пропорциональное увеличение обоих показателей у лошадей свидетельствует о том, что данная физическая нагрузка для них незначительна. Обращает на себя внимание значительная макроцитарная гиперхромная анемия у животных: увеличение объема эритроцитов на 14% и содержания гемоглобина в эритроците на 51% выше нормы. Это вызвано развитием ответной реакции на гипоксию, всегда возникающую в связи с повышенной физической нагрузкой.

Мышечная работа также вызывает изменения лейкоцитарной картины крови, которые находятся в прямой зависимости от натренированности и состояния сердечно сосудистой системы спортивной лошади. Так, лошади отреагировали на физическую нагрузку незначительными колебаниями показателей в пределах нормы: подъемом нейтрофилов на 3% и снижением лимфоцитов на 5%. После тренировки возрастает вязкость и скорость свертывания крови. Это связано с увеличением количества тромбоцитов и показателя тромбокрита у лошадей на 18% и 10% соответственно.

Проведенные исследования подтверждают данные зарубежных исследователей (К. Malinowski, 1990) о том, что тренировка является для лошадей сильным стресс-фактором.

Возрастная предрасположенность животных к стрессу.

Стресс приводит к повышению уровня глюкозы у животных старшего возраста: этот показатель до нагрузки превышал норму на 81,3%, а после нагрузки незначительно повышался на 5 % , это свидетельствует о срочной мобилизации энергетических ресурсов организма. Однако, в исследованиях Ю.П. Фомичева с соавт. (1974) обнаружено снижение содержания показателя, что ученые связывают с динамикой выработки кортикостероидов надпочечников. Это положение объясняет уменьшение глюкозы после нагрузки у более молодых животных.

Количество креатинина отражает работу мышц. В результате определения в сыворотке крови лошадей установлено достоверное повышение креатинина во 2 и 3 возрастной группе на 20,56% и 18,7% соответственно. По нашему мнению, это связано с тем, что животных данных групп находятся в более интенсивном тренинге. При анализе активности аминотрансфераз (АлАТ, АсАТ) и показателя Де Ритиса в группе молодых животных установлено усиление глюкозо-аланинового пути катаболизма и повышение нагрузки на печень, на что указывают многократный подъем АлАТ на 53,2% и падение показателя Де Ритиса на 60%. Возможно, это связано с тем, что у старых животных резко ослабляются реакции на стресс по сравнению с животными более молодого возраста. Стрессовая реакция вызывает активизацию перекисного окисления липидов и, как следствие, повышение активности МДА и активности каталазы на 15,3% и 58,5% соответственно в группе 2-6 летних животных. Наименее подвержены стресс-реакции оказались животных среднего возраста (8-10 лет), так как на фоне активизации ферментативного звена антиоксидантной системы наблюдается уменьшение показателя МДА на 5,4%, что указывает на снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов. Мы связываем это с более совершенным развитием механизмов антиоксидантной защиты в данном возрастном периоде.

Моделирование стрессовой реакции у кроликов и ее коррекция методом фармакупунктуры.

В опыте было экспериментально смоделировано состояние стресса у животных. Кроликов разделили на три группы по принципу аналогов (1,2 группы - опытные, 3 - контроль). Наступление реакции стресса оценивали эозинофильным тестом по методу И.С.Пирамишвили (1987) и снижению живой массы кроликов.

Изучение морфологического состава крови у экспериментальных животных показало, что при применении «Гамавита» отмечалось повышение количества эритроцитов на 3% (1 опытная) и 27% (2 опытная) и уровня гемоглобина - на 8% и 22,5% соответственно по сравнению с контролем, что вероятно связано с повышением уровня окислительно-восстановительных процессов в организме и стабилизирующем влиянии на гемопоэз.

Исследования в пределах группы показали общие черты и особенности стресс-реакции, нами отмечено наибольшее повышение эритроцитов на 14 день исследования: в 1 группе на 34,6%, во 2 опытной группе на 73,6% и на 32% в контрольной группе по сравнению с первоначальными значениями. Изменения в концентрации гемоглобина коррелируют с динамикой эритроцитов: повышение на 13% в 1 опытной группе, на 66,2% - во 2 опытной группе, на 22,5% - в контрольной.

Повышение в контрольной группе активности фермента АлАТ на 35% свидетельствует об изменениях, происходящих в печени. Объясняется это деструктивными изменениями гепатоцитов и выходом из них ферментов в кровь. Нагрузка на сердечно-сосудистую систему во II опытной группе оказалась ниже всего, о чем свидетельствуют показатели АсАТ и Де Ритиса (уменьшение на 45 и 60% соответственно). Однако, усилив обменные процессы с помощью акупунктуры, мы вызвали напряжение функции печени, на что указывает высокий уровень АлАТ.

Наиболее сильно выраженное снижение активности трансаминаз наблюдалось на 7 сутки после стресс-воздействия: уменьшение АсАТ на 73,6% в 1 опытной группе, на 90% - в группе фармакупунктуры, на 55% - в контроле. Динамика АлАТ следующая: в 1 опытной группе понижение на 53,8%, во 2 опытной группе - на 60%, в контроле - на 48%. Эти изменения, по нашему мнению, можно объяснить началом стадии резистентности и активным включением трансаминаз в синтез новых белков.

Снижение концентрации МДА у подопытных животных к началу стадии резистентности на 36,6% (1 опытная) и 83% (2 опытная) свидетельствует о снижении интенсивности пероксидации липидов.

Постстрессовая адаптация вызвала повышение энергетических затрат за счет липидов и продуктов их метаболизма. Этим объясняется повышение уровня общих липидов в контрольной группе на 33%, что, по нашему мнению, свидетельствует об изменении энергетических процессов, в опытных группах наблюдается снижение этого показателя на 89% и 76% соответственно. При этом дефицит основного источника энергии восполняется за счет гликонеогенеза из аминокислот и липидов.

Содержание липофильного витамина Е в сыворотке крови устойчиво снижается на 14 день исследования: на 15,4% в 1 опытной группе, на 14,3% во 2 опытной, на 37,5% в контроле по сравнению с первоначальными показателями. Уровень же гидрофильной аскорбиновой кислоты в первые сутки уменьшается, а затем значительно возрастает: в 7 раз в 1 опытной группе, в 10 раз в группе фармакупунктуры, в 5 раз - в контроле.

Прирост живой массы составил на 4-й день - в I опытной группе на 2% и 10% в группе II, на 14 день - 4 и 14% соответственно, на 21 день - 8 и 17,5% соответственно относительно контроля.

Разработка схемы применения препарата «Фоспасим» при стрессе у мелких животных.

В опыт подобрали три группы кроликов (n=30). Животным первой группы препарат не применяли, они служили контролем. Кроликам второй группы «Фоспасим» вводили дважды с интервалом три дня, животным третьей группы - однократно. Для морфологических и биохимических исследований отбирали пробы крови до введения, после однократного введения препарата и через 6 суток после первого применения.

Нами было выявлено увеличение в пределах физиологической нормы содержания эритроцитов и количества гемоглобина после введения «Фоспасима», что вероятно связано с увеличением уровня окислительно-восстановительных процессов в организме. Так количество эритроцитов во второй и третьей группах через 6 дней после первого введения составило соответственно 4,97±0,15 и 5,01±0,15 1012/л, гемоглобина -109,3±2,52 и 111,3±3,06 г/л (р<0,05), против 4,6±0,17 1012/л и 106,0±1,0 г/л в контрольной.

Количество ЛПВП увеличилось во второй и третьей группах соответственно в 2,4 и 2,7 раза, a ЛПНП снизилось - в 2,3 и 3,5 раза соответственно по сравнению c первоначальными значениями. Динамика уровня ЛПНП коррелировала со снижением концентрации холестерина в опытных группах на 4,8 и 7,5% и общих липидов на 4,0 и 9,5 % соответственно (р<0,05). B контрольной группе все сравниваемые показатели за период наблюдения существенно не изменились (р>0,05).

Наблюдаемое уменьшение процента перекисного гемолиза эритроцитов y животных опытных групп в 2,7-2,8 раза подтверждают снижение интенсивности СРО в мембранах эритроцитов и повышении их механической прочности.

Снижение влияния стресс-факторов способствует повышению прироста живой массы, что наблюдалось во второй и третьей группах, где прирост живой массы за месяц был выше, чем в контрольной группе соответственно на 68 и 96 г по сравнению c контролем (р<0,05).

Разработка и оценка препарата «Se-C» для коррекции стрессового состояния у животных.

Учитывая преимущества и недостатки известных стресс-корректоров, а также перспективность использования селена в ветеринарии нами был разработан новый селенсодержащий препарат «Se-C», обладающий антистрессовым эффектом и адаптогенным действием, отличающийся от аналогов тем, что дополнительно снабжен аскорбиновой кислотой, а в качестве неорганической формы селена использован селен в наноразмерном состоянии и нулевой валентности (Se0). Это повышает эффективность препарата и снижает его токсичность.

Токсикологическая оценка препарата.

Для определения летальных доз препарата использовали клинически здоровых белых мышей массой 20-22 г, исследования проводили согласно «Методических указаний по токсикологической оценке новых препаратов для лечения и профилактики незаразных болезней животных» (ВНИИ незаразных болезней животных, 1987 г.).

Испытуемые дозы препарата рассчитывали в мг на кг массы тела животного. Дозы эффекта определяли опытным путем. Препарат растворили дистиллированной водой из расчета 1мг действующего вещества в 1 мл. Животным, разделенным на группы, препарат вводился в возрастающих дозах. Введение исследуемого препарата опытным группам осуществлялось внутримышечно, с соблюдением правил асептики и антисептики; контрольным животным вводился соответствующий объем дистиллированной воды. Продолжительность наблюдения за состоянием животных составила 14 дней. В этот период учитывали внешний вид и поведение животных, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение к пище и воде, подвижность, ритм и частоту дыхания и сердцебиения. Также обращали внимание на возникновение и характер интоксикации, определяли сроки гибели животных.

В результате опыта по изучения острой токсичности препарата «Se-C» на белых мышах при однократном внутримышечном введении его можно классифицировать по ГОСТ 12.1.007-76 и отнести ко 2 классу опасности.

Ускоренное определение кумулятивного эффекта проводили на двух группах мышей (n =10). Препарат в опытной группе вводили внутримышечно в бедренную мышцу. Вторая группа служила контролем и получала воду для инъекций.

Пероральная ежедневная доза составляла 1/10 от установленной ЛД50 в остром опыте (3,45мг/кг) и вводилась первые 4 дня. На 5-6 сутки эту дозу увеличили в 1,5 раза (5,175 мг/кг) и вводили последующие 4 дня. На 9-е сутки дозу повысили в 2 раза (6,9 мг/кг) и вводили 6 дней. На 15 сутки дозу доводили 1/5 ЛД50, полученную в остром опыте (17,25 мг/кг) и вводили до выявления кумулятивного эффекта.

К= ЛД50х / ЛД50а

Где К - коэффициент кумуляции;

ЛД50х - летальная средняя доза при многократном введении;

ЛД50а - летальная средняя доза при однократном введении.

К «Se-C» = 131,82/34,51=3,82

Согласно классификации химических веществ по степени кумуляции (по Л.Н. Медведю, 1964) препарат «Se-C» можно отнести к 3 группе (умеренная кумуляция).

Для изучения раздражающего действия препарата использовали метод конъюнктивальных проб. Для его постановки использовали 4 кроликов возрастом 6 месяцев. Препарат, разведенный из расчета в 1 мл воды для инъекций 1 мг, вводили глазной пипеткой под верхнее веко, а во второй глаз (контроль) - 1 каплю воды. Реакцию учитывали дважды:

через 5 минут - отсутствие расчесов;

через 24 часа - отсутствие различий между опытом и контролем.

Из результатов проведенного исследования можно сделать вывод, что препарат не обладает раздражающим действием и его можно применять животным.

Оценка влияния препарата на животных

Для оценки влияния на организм и прирост живой массы использовали клинически здоровых кроликов, содержащихся в условиях вивария с полноценным рационом кормления.

Анализ полученных результатов свидетельствует об увеличении содержания общего белка в сыворотке крови опытных животных на 13,2%, активности каталазы в крови на 59,5%, селена в крови в 7 раз, притом, что в контрольной группе эти показатели оставались на прежнем уровне. До введения препарата у кроликов обеих групп наблюдалось повышенное содержание глюкозы в крови, применение препарата способствовало нормализации углеводного обмена и снижению уровня глюкозы на 22,2%, в то время как в контроле этот показатель остался практически неизменным. Содержание холестерина в сыворотке крови за время проведения опыта снизилось в опытной группе на 14,7%, тогда как в контрольной повысилось на 1,6%, а содержание лейкоцитов у контрольных животных снизилось на 13,2%, в то время как у опытных повысилось на 13,6 (что обусловлено наличием витамина С в составе препарата). Прирост живой массы за 31 день в контрольной группе в среднем составил 330 гр., а в опытной 450 гр., что на 26,6% больше.

Изучение влияния препарата «Se-C» на организм кроликов в условиях стресса.

Для изучения действия препарата на стрессовое состояние сформировали 2 группы (опытную и контрольную) кроликов (n=10) в возрасте 6 месяцев. Животным до проведения опыта фармакологические препараты не вводили. После моделирования стрессовой ситуации животным опытной группы препарат вводили внутримышечно, однократно курсом в течение 5 дней в дозе 1,13мг/кг по действующему веществу (ДВ). Животные контрольной группы препарат не получали. Кролики находились в одинаковых условиях кормления и содержания. Отбор проб крови проводили после стрессового воздействия, через 5 и 10 дней после первого введения.

При анализе гематологических показателей крови кроликов можно отметить, что применение препарата способствовало повышению содержания гемоглобина в пределах ошибки в опытной группе на 12% через 5 дней и на 13% через 10 дней после первого введения препарата (относительно контроля). Одновременно происходит увеличение количества эритроцитов на 12% и 14,6% соответственно. Это свидетельствует об улучшении эритропоэза. Повышение уровня углеводного обмена на 10,5% у животных опытной группы имеет приспособительное значение вследствие повышенного расхода энергетических ресурсов. Селен, входящий в состав препарата способствует снижению интенсивности свободнорадикальных процессов, что выражается в повышении активности каталазы на 30% и объясняется эффективным антиоксидантным действием препарата «Se-C».

Это подтверждается уменьшением концентрации токсичного продукта МДА на 32% к 10 дню исследования. Снижение активности трансаминаз АсАТ на 4% и АлАТ на 12,7% , в то время как в опытной группе показатели остались практически без изменений, свидетельствует о большем включении аминокислот в синтез новых белков для обеспечения адекватной реакции организма на стресс-воздействие. Снижение активности аланинаминтрансферазы коррелировало с уменьшением общего билирубина. Это свидетельствует об уменьшении нагрузки на печень и отсутствии токсического действия препарата.

Изучение возможности использования методов фармакупунктуры при стрессе у спортивных лошадей.

Для коррекции последствий стресса животным первой группы вводили «Гамавит» подкожно в дозе 50 мл/гол однократно за 8, 6, 4 и 1 день до стресс-воздействия, лошадям второй группы - подкожно «Гамавит» в точки акупунктуры в области 5-го грудного, 5-го поясничного и 2-го крестцового позвонков в дозе 9 мл/гол двукратно с интервалом 3 дня.

Повышение количества эритроцитов после курса фармакупунктуры (до нагрузки) на 14% в I опытной группе и на 13,7% во II группе относительно контроля возможно связано с избытком кортикостероидов или повышенной физической нагрузкой.

Физическая нагрузка (тренировка) вызвала следующие изменения гематологических показателей: увеличение концентрации гемоглобина на 5% и 6,7%; эритроцитов на 5% и 7,4%, уровня гематокрита на 8,8% и 6% соответственно относительно контроля. Это свидетельствует о лучшей подготовленности лошадей опытных групп к физической нагрузке, так как от интенсивности газообмена напрямую зависит работоспособность животного.

Курс фармакупунктуры вызвал повышение содержания глюкозы на 10% в 1 группе и на 17,8% во II опытной группе до нагрузки и на 11,5% и 12,8% соответственно после нагрузки.

В мышцах наряду с АТФ имеется и другой макроэрг - креатинфосфорная кислота, из которой синтезируется креатинин. Опыты показали нормализацию данного показателя: повышение в 1 группе на 35% до нагрузки и на 7,4% после нагрузки и снижение во 2 - на 18,8% и 35% соответственно.

В результате исследования было установлено снижение АсАТ на 12,6% и 34% до нагрузки и на 26,3% и 42% соответственно после нагрузки. Можно отметить, что применение препарата вызвало ослабление нагрузки на сердечно-сосудистую систему по сравнению с контрольной. Уровень АлАТ снижался незначительно, это свидетельствует о стабильном функционировании печени и положительном влиянии фармакупунктуры на обменные процессы.

Установлено, что на фоне применения фармакупунктуры наблюдается снижение интенсивности процессов ПОЛ, что подтверждается снижением концентрации МДА на 6,5% и 36,5% до нагрузки и на 14,7% и 60% после нагрузки соответственно, и уменьшением избыточной активации ферментативного звена системы АОЗ на 18% до нагрузки и на 34,7% после нагрузки во II опытной группе.

Изучение возможности использования препарата «Фоспасим» при стрессе у спортивных лошадей.

Для оценки эффективности препарата были сформированы 3 группы: одна контрольная и две опытные по 10 животных в каждой. Лошадям опытных групп внутримышечно вводили препарат «Фоспасим» (состав: Phosphorus D12, Aconite D12, Hyosciamus D12, Passiflora D9, Moshus D4, Ignatia D6) по двум схемам:

1. 1 мл на 100 кг живой массы однократно в течение 5 дней.

2. 10 мл на животное однократно в течение 5 дней

Нами выявлено снижение АсАТ на 29 - 33% по обеим схемам в сочетании с резким падением показателя Де Ритиса - в 4,7 - 7,2 раза, что указывает на улучшение работы сердечно-сосудистой системы. Повышение АлАТ можно рассматривать как усиление аланинглюкозного пути с выбросом из клеток глюкозы за счет ее дефосфорилирования, о чем говорит повышение глюкозы после курса препарата. Снижение активности каталазы по схеме 1 на 88% после нагрузки и по схеме 2 - на 86% свидетельствует о хорошо функционирующей антиоксидантной системе. Концентрация МДА находится на высоком уровне, это объясняется повышением обменных процессов в организме в условиях стресса. Однако наблюдается снижение показателя МДА после применения препарата, этим обеспечивается сдерживание активации процессов перекисного окисления липидов и предупреждается поражение организма животных продуктами ПОЛ. При анализе гематологических показателей следует отметить, что значительных колебаний в сравнении с данными до применения препарата не наблюдалось. Так, после однократного введения и интенсивной нагрузки наблюдается снижение количества лимфоцитов на 9,5%, концентрации гемоглобина на 3%, повышение количества эритроцитов на 0,5%, увеличение гематокрита на 3,2%, снижение среднего содержания гемоглобина в эритроците на 4,3%, снижение концентрации гемоглобина в эритроците на 4,38%, уменьшение среднего объема тромбоцитов на 1,6%. Таким образом, все показатели находятся в пределах физиологической нормы с закономерными колебаниями до и после нагрузки. Это свидетельствует о том, что применение препарата не вызывает глубоких изменений в системе крови и способствует поддержанию параметров на физиологическом уровне.

Изучение возможности использования препарата «Se-C» при стрессе у спортивных лошадей.

Для изучения действия селенсодержащего препарата сформировали 2 группы лошадей (опытную и контрольную, n=10). После моделирования стрессовой ситуации животным опытной группы препарат вводили внутримышечно, курсом в течение 5 дней в дозе 1мл/100 кг живой массы. Животные контрольной группы препарат не получали. Лошади находились в одинаковых условиях кормления и содержания. Отбор проб крови производили до и после интенсивного тренинга.

Морфологические показатели конкурных лошадей находятся в пределах физиологической нормы на разных этапах тренировок. У животных контрольной группы оказалось меньшее количество эритроцитов и гемоглобина, как в пробах крови, так и в расчете на один эритроцит. Показатель гематокрита, наоборот, был выше на 23,6%, подтверждая состояние гипогидратации. У опытных лошадей содержание гемоглобина возрастает до 160±9,5г/л, аналогичным образом изменялось количество эритроцитов. Объясняется это тем, что конкурные лошади подвергаются интенсивным физическим нагрузкам, требующим большого мышечного напряжения для совершения прыжка. Относительная стабилизация энергетических реакций в организме способствует повышению адаптационных процессов и активизации гликонеогенеза, что меняет характер течения обменных процессов. При этом дефицит основного источника энергии восполняется за счет гликонеогенеза из аминокислот и липидов.

Динамика активности за время опыта таких органоспецифичных ферментов, как АсАТ и АлАТ в крови лошадей имела тенденцию к увеличению. Однако, под влиянием препарата ингибируется активность трансаминаз, чтобы не допустить сверхнормативного перерасхода аминокислот в процессах гликонеогенеза, особенно АсАТ. Уровень токсического продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида стремительно снижается в опытной группе, что свидетельствует о наличии антиоксидантных свойств у препарата.

ВЫВОДЫ

1. Интенсивные физические нагрузки сопровождаются активацией процессов перекисного окисления липидов и накоплением его токсических продуктов.

2. Наиболее сильно повреждающему действию стресс-факторов подвержены молодые животные, что выражается в накоплении токсических продуктов перекисного окисления липидов, мобилизации системы антиоксидантной защиты, усилении обменных процессов в печени. Животные средней возрастной категории наиболее адаптированы к действию интенсивной физической нагрузки, что необходимо учитывать при планировании тренировок и участии в соревнованиях.

3. Применение «Гамавита» (ЗАО «Микроплюс») по методу фармакупунктуры способствует снижению уровня пероксидации липидов, повышении активности ферментативного звена антиоксидантной защиты. Экспериментально установлено уменьшение вводимой дозы и усиление терапевтического эффекта.

4. Применение стресс-корректора «Фоспасим» (ООО «Хелвет») не вызывает глубоких изменений в системе крови и способствует нормализации активности ферментов, малонового диальдегида, глюкозы, активизируя собственную ответную реакцию организма на неблагоприятное воздействие.

5. Новый селенсодержащий препарат «Se-C» для коррекции стресса у животных, созданный с использованием нанотехнологий, относится ко 2 классу опасности (ГОСТ 12.1.007-76).

6. Применение препарата в дозе 1,13 мг/кг оказывает регулирующее влияние на активность и сбалансированность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты организма, так как при наличии клинически выраженной стресс-реакции способствует снижению интенсивности процессов перекисного окисления липидов, что проявляется уменьшением концентрации в крови продуктов ПОЛ. Основными элементами в общей направленности действия препарата «Se-C» являются:

· гепатопротекторное действие - снижение признаков цитолиза и холестаза, нормализация дезинтоксикационной функции печени;

· антиоксидантная активность - регулирующее воздействие на активность процессов перекисного окисления и системы антиоксидантной защиты, особенно в условиях стресса;

· адаптогеные свойства - повышение резистентности к неблагоприятным воздействиям (стресс);

7. Наряду с использованием новых фармакологических лекарственных средств, применение нетрадиционных методов коррекции стресса и профилактики постстрессовых осложнений является экономически целесообразным и терапевтически эффективным.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для коррекции последствий стресса спортивным лошадям рекомендуется вводить подкожно «Гамавит» (ЗАО «Микроплюс») в точки акупунктуры в области 5-го грудного, 5-го поясничного и 2-го крестцового позвонков в дозе 9 мл/гол двукратно с интервалом 3 дня.

2. При транспортировке лошадей следует применять препарат «Фоспасим» (ООО «Хелвет») в дозе 1 мл на 100 кг живой массы, однократно подкожно. При подготовке к соревнованиям - в дозе 1 мл на 100 кг живой массы однократно в течение 5 дней.

3. Для предотвращения стресса препарат «Se-C» необходимо вводить внутримышечно, курсом в течение 5 дней в дозе 1мл/100 кг живой массы (1,13 мг/кг по ДВ).

4. Материалы исследований могут быть использованы в учебном процессе в высших и средних учебных заведениях с биологической специальностью, а также в практике работы со спортивными лошадями.

Список научных трудов, опубликованных по теме диссертации

1. Оробец, В.А. Применение гамавита в фармакопунктуре/ В.А. Оробец, О.Г. Сапожникова// Мат. междунар. студенческой науч. конф. «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки». - Троицк УГАВМ, 2007. - С. 183-185.

2. Сапожникова, О.Г. Перекисное окисление липидов и система АОЗ у кроликов при технологическом стрессе и его коррекции/ О.Г. Сапожникова// Молодые аграрии Ставрополья: Сборник научных статей. - Ставрополь: АГРУС, 2008. - С. 77-79.

3. Сапожникова, О.Г. Иммунокоррекция стресса методом фармакопунктуры/ О.Г. Сапожникова, В.А. Оробец // Знания молодых - новому веку. Материалы Всероссийской студенческой научной конференции: Сборник научных трудов. - Киров: Вятская ГСХА, 2008. - С. 140-142.

4. Сапожникова, О.Г. Акупунктурная коррекция технологического стресса/ О.Г. Сапожникова, В.А. Оробец// Современные проблемы устойчивого развития агропромышленного комплекса России. Мат. Пятой Всероссийской дистанционной науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. - пос. Персиановский, ДонГАУ, 2008. - С. 76-77.

5. Оробец, В.А. Разработка новых методов коррекции стресса у мелких животных/ В.А. Оробец, О.Г. Сапожникова// Перспективы развития агропромышленного комплекса России: Сб. материалов Всероссийской научно-практической конференции. - ФГОУ ВПО МГАУ. - Москва, 2008. - Ч.1. - С.192-193.

6. Сапожникова, О.Г. Лечение и профилактика последствий стресса у мелких животных/ О.Г. Сапожникова, В.А. Оробец // Паразитарные, инфекционные и неинфекционные заболевания животных: Сб. научн. трудов по мат. Междунар. науч.практ. интернет конф. (1-15 декабря 2008 г). - Ставрополь: АГРУС, 2009. - С. 90-92.

7. Оробец, В.А. Средства и методы физиотерапии животных/ В.А. Оробец, О.Г. Сапожникова// Учебно-методическое пособие. - Ставрополь, «Радуга». - 36 с.

8. Оробец, В.А. Влияние стресса на биохимический статус конкурных лошадей/ В.А. Оробец, Н.Е. Орлова, О.Г. Сапожникова// Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития: материалы IX Всерос. науч.-практ. конф. 2009 г. - Саратов, ИЦ «Наука», 2009. - С. 273-276.

9. Оробец, В.А. Динамика гематологических показателей у конкурных лошадей под действием стресса/ В.А. Оробец, Н.Е. Орлова, О.Г. Сапожникова// Труды Кубанского государственного аграрного университета. Серия ветеринарные науки, №1 (ч.2.). - 2009. - С. 307-310.

10. Кудаев, Д.О. Допинг в конном спорте/ Д.О. Кудаев, О.Г. Сапожникова, В.А. Оробец, // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний сельскохозяйственных животных: сборник научных трудов по материалам 73-науч.-практ. конференции (23-25 февраля 2009 г.). - Ставрополь: АГРУС, 2009. - С 49-50.

...