Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак
Отработка условий получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм "CVS" и гликопротеина для использования их в качестве антигенов в иммуноферментной тест-системе. Анализ вируса бешенства антител в сыворотках крови привитых кошек и собак.
| Рубрика | Сельское, лесное хозяйство и землепользование |
| Вид | автореферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 10.04.2018 |
| Размер файла | 43,3 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
1
На правах рукописи
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ПРИВИТЫХ ПРОТИВ БЕШЕНСТВА КОШЕК И СОБАК
РАХМАНИН П.В.
Щелково- 2008
Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИТИБП ))
Научный руководитель: доктор биологических наук Клюкина Валентина Ивановна,
Официальные оппоненты: профессор, доктор ветеринарных наук Белоусов Василий Иванович, кандидат биологических наук Красуткин Сергей Николаевич
Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно- исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко»
Защита диссертации состоится 27 июня 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбинат.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.
Автореферат разослан 27 мая 2008г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов
1. Общая характеристика работы
Актуальность темы. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенством среди животных и возникновения случаев заболевания людей.
Несмотря на то, что основными резервентами и распространителями рабического вируса остаются дикие хищники семейства псовых, все чаще вовлекаются в эпизоотический процесс домашние животные (Селимов М.А., 1998; Макаров В.В. и др., 2002).
В 2005году, по сравнению с 2000 годом, число заболевших бешенством животных увеличилось в 3,7 раза с 1406 до 5253 случаев. Бешенство среди различных видов животных в 2007 году распространилось на территории 49 субъектов РФ.
Интенсивность распространения бешенства домашних животных находится в прямой зависимости от численности безнадзорных собак и кошек. В Российской Федерации с 2000-2005гг увеличилось количество неблагополучных пунктов по бешенству собак и кошек до 39,4%.
Основными средствами контроля бешенства среди домашних и диких животных являются специфическая профилактика, обеспечивающая устойчивость животных к заражению бешенством, и лабораторная диагностика. Однако применение антирабических вакцин и эффективных схем иммунизации животных, часто недостаточно из-за гетерогенности популяционной и индивидуальной защиты животных (Недосеков В.В.2001, Иванов В.С.,2002).
Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейтрализующих антител является индикатором эффективности вакцинации, так как только вируснейтрализующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции (Dietschold B.,1990: Lafon M.,1990).
В соответствии с рекомендациями Комитета экспертов ВОЗ по бешенству содержание в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных вируснейтрализующих антител 0,5 МЕ/мл считается минимальным уровнем антирабических антител, соотносимого с возможностью защиты от бешенства (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines,2004).
С 2003 года обязательными условиями, подлежащими исполнению при ввозе домашних животных (кошек, собак, домашних хорьков) из стран, не входящих в Европейский Союз, являются наличие имплантированных микрочипов и уровня протективного антирабического иммунитета не менее 0,5МЕ/мл. (Регламент Совета и Европейского парламента,2003).
Общепринятым методом оценки рабического иммунитета у привитых против бешенства людей и животных является реакция нейтрализации (РН) на мышах, к недостаткам которой можно отнести трудоемкость, использование большого количества животных и длительного срока (14-21 день) наблюдения.
Среди новых, рекомендуемых МЭБ методов in vitro на культуре клеток, можно выделить тест ингибиции фокусов флюоресценции (fluorescent focus inhibition test (RFFIT) и тест флюоресценции вируснейтрализующих антител (FAVN), которые позволяют по определенному в тестируемых сыворотках количеству антирабических антител определять уровень протективного иммунитета. Постановка тестов in vitro требует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени (2-3 дня), необходимости поддержания культуры клеток, использования вирулентного вируса.
На основании этого, комитет экспертов ВОЗ по бешенству рекомендует в качестве быстрого, пробный тест на основе непрямого иммуноферментного анализа для количественного определения в сыворотках крови вакцинированных животных антител к вирусу бешенства.
К преимуществам ИФА относится высокая чувствительность, автоматизация, использование инактивированного вируса и возможность в короткие сроки (3-4 ч) количественно определять в сыворотках привитых против бешенства животных уровень антирабических антител (WHO Laboratory Techniques in Rabies, 2004).
С учетом этого, разработка тест-системы на основе непрямого иммуноферментного анализа для количественного определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак является актуальной задачей для практической ветеринарии.
Цель и задачи исследований
Основной целью данной работы являлась разработка тест-системы непрямого иммуноферментного анализа для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.
Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Отработать условия получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм «CVS» и гликопротеина (ГП) для использования их в качестве антигенов в иммуноферментной тест-системе.
Синтезировать протеин А- пероксидазный коньюгат для иммуноферментной тест-системы.
Получить контрольные сыворотки для иммуноферментной тест-системы.
Разработать тест-систему на основе непрямого ИФА для количественного определения к вирусу бешенства антител в сыворотках крови привитых кошек и собак.
Исследовать эффективность применения разработанной иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в сравнении с РН в культуре клеток.
Научная новизна работы.
Научная новизна результатов, полученных при выполнении работы, состоит в следующем:
Впервые в РФ разработана иммуноферментная тест-система на основе непрямого ИФА с применением культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и референс-препарата для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.
Отработаны условия очистки и концентрирования культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и гликопротеина вируса бешенства, пригодных в качестве антигенов иммуноферментной тест-системы.
Подобрана схема иммунизации баранов и собак для получения антирабической сыворотки, используемой в качестве контрольной при постановке непрямого ИФА.
Исследована возможность применения протеин А- пероксидазного коньюгата в иммуноферментной тест-системе для определения антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.
Установлена согласованность между результатами определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак с помощью разработанной иммуноферментной тест-системой и РН в культуре клеток.
Практическая значимость работы.
Впервые в РФ разработан набор компонентов и иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак, внедрение которой в практику ветлабораторий позволит в короткие сроки провести исследования сывороток крови на наличие антирабических антител и оценить эффективность вакцинации кошек и собак.
Разработанная тест система может быть использована для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак при перевозе их через границу Российской Федерации.
2. Основные положения, выносимые на защиту
Иммуноферментная тест-система для количественного определения антител в сыворотках крови кошек и собак, привитых против бешенства.
Результаты определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в иммуноферментной тест-системе и РН в культуре клеток.
Оценка эффективности применения разработанной иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак.
Апробация и публикация результатов.
Основные материалы диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета ВНИИТБП по плану НИР ОКР на 2005-2008гг задания 08.06. 01.«Разработать новые диагностические системы и комплексные лечебно-профилактические препараты экономически значимых инфекционных болезней животных», на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии и иммунологии животных» к 100-летию Я.С. Коваленко, 16-17 мая 2006г, Международной юбилейной научно-практической конференции, посв. 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности (Курск, 2006г), Международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» 20-21 декабря 2007 (Щелково, 2007), на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Щелково,2008).
По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ.
Структура объем и диссертации.
Диссертация изложена на 104 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 3 рисунками. Список используемой литературы включает 121 источников, из которых 61 отечественных.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.Материалы и методы
Работа выполнена в 2005-2008гг в отделе иммунологии Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП).
Вирус бешенства. В работе использовали культуральную суспензию фиксированного вируса бешенства штамм «CVS», адаптированного к культуре клеток ВНК-21, с титром инфекционности 5,0 lgLD 50/см.
Антигены для ИФА. Очищенный вирус бешенства получали путем ступенчатого центрифугирования вируссодержащей суспензии при
1 тыс.g и 50 тыс. g с последующей очисткой вируса гель-хроматографией на сефарозе 4В.
Гликопротен (ГП) вируса бешенства получали обработкой очищенного вируса тритоном Х-100 в 2% концентрации и отделением ультрацентрифугированием при 50 тыс.g.
Электронно-микроскопическое изучение препаратов вируса бешенства проводили с помощью негативного контрастирования. Плавучую плотность вируса бешенства определяли дифференциальным центрифугированием в градиенте 10-60% сахарозы.
Титрование инфекционности вируса бешенства проводили путем интрацеребрального заражения мышей, согласно ГОСТ 26075-84.
Сыворотки. Исследовали сыворотки от вакцинированных против бешенства баранов (34 пробы), КРС (26 проб), кошек (26 проб), собак (24 проб) из приютов, ветлечебниц и хозяйств Московской области в период 2006-2008гг.
Антирабические сыворотки получали иммунизацией баранов и собак препаратом концентрированного очищенного вируса бешенства штамм «CVS» по разработанной в отделе иммунологии схеме совместно с аспирантом Проничевым А.Б.
Схема иммунизации включала подкожное введение животным инактивированного вируса бешенства штамм «CVS» и внутримышечные инъекции вируса с адьювантом.
Пул нормальных сывороток от клинически здоровых не вакцинированных собак, отрицательно реагирующих в ИФА и РН, использовали в качестве отрицательного контроля для ИФА.
Методы определения антител. Антитела к вирусу бешенства выявляли исследованием сывороток крови методами РН, РДП, РСК, РНИФ как описано в «Методах лабораторных исследований по бешенству» (1975).
Синтез протеин А- пероксидазного конъюгата
Конъюгат готовили меткой протеина А St. aureus с ферментом пероксидазы хрена (ПХ марка А, RZ = 2,8 - 3,0 ("Sigma") периодатным методом по В.Wilson, Р. Nakane (1978 г). Иммунологическую и энзиматическую активность протеин А-ПХ коньюгата определяли титрованием его в ИФА с сыворотками собаки, кошки.
При постановке ИФА использовали также коммерческие антивидовые анти-IgG барана (производства ИЭМ Н.Ф.Гамалеи,РАМН), анти-IgG кошки и анти-IgG собаки («Sigma») коньюгаты.
Определение белка. Общий белок определяли по Лоури и др.(1956) и спектрофотометрически на СФ-46 при длине волны 280 нм.
Непрямой иммуноферментный анализ для количественного определения антител в сыворотках крови привитых против бешенства животных. Для разработки иммуноферментной тест-системы был проведен ряд модельных экспериментов с сыворотками баранов.
Антитела в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), используя 96-луночные панели или 16 луночные стрипы. Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра «Sigma»при длине волны 490 нм.
Сенсибилизацию панелей проводили очищенным культуральным вирусом бешенства штамм «CVS» из расчета 10 мкг/0,1мл (гликопротеин 4 мкг/0,1мл) в 10мМ фосфатном буфере рН 7,8 с содержанием 0,3% обезжиренного молока и 0,05% детергента в течение 18 ч при 40 С. Центры неспецифической сорбции блокировали 2% раствором обезжиренного сухого молока и выдерживали 12 ч при температуре 40С.
После каждого этапа проводили промывку лунок 4-х кратно трис-солевым буферным раствором рН 7,5 , содержащим 1% твин-20 (ТСБ-Т).
Исследуемые сыворотки в разведении 1:100, контрольные сыворотки в разведении 1:10 и стандартный препарат в разведениях 1:100-1:30 000 на 10мМ ФБР с 0,5% сухого обезжиренного молока и 1% сыворотки КРС, инкубировали в лунках одной панели в двух повторностях в течение 1 ч при 370 С.
После 4-х кратной промывки в лунках инкубировали протеин А- пероксидазный (или антивидовой) коньюгат 1 ч при 370 С. Субстратно-индикаторный раствором для пероксидазных коньюгатов служил 0,04%-ный раствор орто-фенилендиамина (ОФД) в 0,15 М цитратно-фосфатном буфере рН - 5,0 с 2,4 мМ Н2О2.
Реакцию ИФА останавливали через 30 мин добавлением в лунки 50мкл 4Н раствора Н2SO4 и определяли оптическую плотность при 490 нм (ОП490). Титром антигена или сыворотки считали конечное разведение, в котором ОП490 в 2 раза превышало ОП490 отрицательного контроля.
Количественное содержание антител в исследуемой сыворотке определяли по уравнению линейной регрессии, выведенному по результатам титрования стандартного препарата (зависимость ОП490 от концентрации антител (МЕ/мл) в соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO Laboratory Techniques in Rabies, 2004,р.2.2.5).
В качестве стандартного препарата использовали коммерческий антирабический -глобулин человека с содержанием вируснейтрализующих антител 9 МЕ/мл (производства НПР «Вектор»).
Результаты ИФА сравнивали с результатами исследования сывороток в РН в культуре клеток. Относительную чувствительность и специфичность разработанной тест-системы определяли согласно рекомендациям ВОЗ (WHO Laboratory Techniques in Rabies, 2004).
Статистическая обработка результатов. Определение среднего арифметического (х) при количестве опытов (n), среднего квадратичного отклонения () средней арифметической проводили согласно руководству И.В.Полякова (1975).
При определении согласованности результатов, полученных с помощью разработанной тест-системы и РН, использовали метод каппа-статистики (Shoukri M. N. 1996, С.А.Дудников, 2005).
Обработка данных, полученных непрямым ИФА и оценка их достоверности включала регрессионный анализ, который позволил рассчитать значения параметров уравнения А,В, значение коэффициента корреляции R, стандартную ошибку и построить линию регрессии (Методика статистической оценки экспериментальных данных в биологии Е.А.Рубан 1972).
Отработка условий очистки и концентрирования вируса бешенства.
Для постановки непрямого ИФА по определению уровня иммунитета, необходимо использовать антигены, обладающие высокой иммуногенной активностью и имеющие в своем составе спектр антигенных детерминант, вызывающих при введении животным выработку вируснейтрализующих антител.
Для получения очищенного и концентрированного культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» были испытаны ряд методов, позволяющих максимально освободиться от белков клеточной культуры с сохранением целостности вирусных частиц, такие как последовательное центрифугирование и гель-хроматография.
После центрифугирования вируссодержащей суспензии с титром инфекционности 5,0 lg LD50/см при 1тыс.g и концентрирования при 50 тыс. g на центрифуге VAC-60 был получен препарат вируса бешенства с титром инфекционности 5,4 lg LD50/см. и очищенный на 90%, по сравнению с исходным содержанием белка.
Хроматографический профиль очистки вируса бешенства на сефарозе 4В был представлен 2 пиками, причем комплементсвязывающая активность была обнаружена в 1-2 пиках, инфекционность в первом пике.
Результаты очистки вируса бешенства представлены в таблице 1.
Таблица 1 Результаты очистки культурального вируса бешенства
|
Материал и этапы Очистки |
Кол-во мл |
Белок мг/мл |
Инфек-ть Lg LD50/мл |
Очистка в % |
|
|
Исходная суспензия Центрифугирование 50 тыс. g Хроматография на сефадексе G-200 Антиген для ИФА |
4500 55 68 30 |
22 9,2 2,4 0,57 |
5,0 5,7 5,8 6,2 |
60 90 97,4 |
По данным электронной микроскопии, концентрированный материал первого пика содержал большое количество целых вирусных частиц с характерными выступами на наружной оболочке, типичной для вируса бешенства. Дифференциальным центрифугированием очищенного вируса бешенства на градиенте 10-60% сахарозы был выявлен один пик инфекционности в зоне 1,16 г/см, что также свидетельствовало о наличии высокоочищенного препарата.Таким образом, оптимизация условий очистки позволила получить цельновирионный препарат вируса бешенства штамм «CVS» очищенный на 97,4%, с титром инфекционности на 1,2 Lg LD50/см. выше, чем в исходной вируссодержащей суспензии.
Активность очищенного вируса бешенства оценивали в прямом ИФА с положительной антирабической сывороткой барана и анти -IgG барана пероксидазным коньюгатом в стандартных условиях. Установлено, что активность очищенного вируса бешенства составила 1:800 и была в 200 раз выше исходной.
Антигенную активность и специфичность очищенного вируса бешенства определяли иммунизацией баранов, которым 2-кратно вводили вирус внутримышечно и подкожно. Через 7,14, 30 дней брали кровь и исследовали на наличие вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в РН. Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках иммунизированных баранов составили 1:64.
Препарат цельновирионного вируса бешенства штамм «CVS» был использован для получения антирабической сыворотки для ИФА и в качестве антигена в разработке иммуноферментной тест-системы для определения уровня антител у вакцинированных против бешенства животных.
Получение гликопротеина вируса бешенства. Из большого выбора реагентов, пригодных для солюбилизации мембранных белков, нами был выбран неионный детергент тритон Х-100, обладающий способностью дезинтегрировать мембраны и удерживать белки в растворенном состоянии, не нарушая их антигенной структуры и не препятствуя взаимодействию с антителами.
Исследована возможность использования тритона Х-100 в 1%-2% концентрации для растворения мембран очищенного вируса бешенства и разделения гликопротеина.
Установлено, что при обработке очищенного вируса тритоном Х-100 в 2% концентрации солюбилизируется 80% белка, против 48% при применении 1% -концентрации. Гликопротеин вируса бешенства отделяли ультрацентрифугированием при 50 тыс.g в течение 90 мин и диализовали надосадок против 1% лизина.
Надосадок после ультрацентрифугирования содержал гликопротеин вируса бешенства, осадок содержал нуклеопротеид и небольшое количество цельного вируса, от которого освобождались хроматографией на сефадексе -G-75. После гель-хроматографии растворенного осадка на сефадексе G-75, в материале второго пика был получен нуклепротеин вируса бешенства и незначительное количество целого вируса обнаружено в первом пике.
Анализ состава и мол. массы выделенного гликопротеина гель-хроматографией на сефадексе G-200 в трис буфере рН 7,8 показал присутствие единственного пика белка с м.м. 40 кД.
Изучение фракции гликопротеина в ДСН-ПААГ и иммуноблотом с антирабической сывороткой показало, что основная масса белка обнаружена в полипептидах с м.м. 46-56 кД.
Специфичность выделенных фракций гликопротеина и нуклеопротеина была изучена в РСК, непрямом ИФА с антирабической сывороткой барана и прямом ИФА с мышиными пероксидазными коньюгатами моноклональных антител против гликопротеина и нуклеопротеина вируса бешенства.
Результаты серологических исследований показали, что гликопротеин не обладал комплементсвязывающей активностью и в ИФА реагировал с антирабической сывороткой в титре 1:12800, с мышиным моноклональным коньюгатом против ГП в титре 1: 640, отрицательно с мышиным моноклональным коньюгатом против НК вируса бешенства.
В сыворотках иммунизированных кроликов гликопротеин вызывал образование вируснейтрализующих и агглютинирующих антител, выявляемых в РН в титре 1:16, РНГА в титре 1: 64 и ИФА -1: 6400.
Фракцию гликопротеина лиофилизировали с декстраном Т-70 в 1% концентрации и использовали в качестве антигена для ИФА.
Таким образом, обработка очищенного вируса бешенства 2% тритоном Х-100, позволила получить гликопротеин с максимальным сохранением антигенной активности, определяемой в ИФА. При введении кроликам ГП индуцировал образование в сыворотках вируснейтрализующих антител в титре 1:16 и агглютинирующих антител в титре 1:64.
Препарат гликопротеина стабилизировали диализом против 1% лизина, хранили при -400 С и использовали в качестве антигена для ИФА.
Синтез протеин-А пероксидазного коньюгата
Коньюгат протеина А (St.aureus) с ферментом, является универсальным компонентом различных иммуноферментных тест-систем, применение которых позволяет определять антитела в сыворотках некоторых видов животных, заменив антивидовые коньюгаты. Преимуществом использования протеин А-пероксидазного коньюгата является способность IgG сыворотки крови большинства видов животных связываться с белком А. В целях стандартизации постановки непрямого ИФА была исследована возможность использования протеин А-ПХ коньюгата взамен коммерческих анти-IgG кошки, анти-IgG собаки пероксидазных коньюгатов.
Синтез протеин А - пероксидазного коньюгата проводили с использованием коммерческого препарата протеина А (St.aureus,«Sigma») с содержанием белка 10 мг/мл, который метили ферментом пероксидазы RZ-3,0 в соотношении 1:2 и отделяли от свободного фермента гель-хроматографией на сефадексе G-200.
После очистки коньюгата на сефадексе G-200 установлена иммунологическая и ферментативная активность, которой обладал материал первого пика. Специфичность и активность протеин А-пероксидазного коньюгата определяли титрованием его в сравнении с коммерческими анти-IgG кошки и анти-IgG собаки коньюгатами. Результаты представлены в таблице 2.
Согласно представленным в таблице данным, при рабочей концентрации протеин А- пероксидазного коньюгата 240-200 мкг/0,1мл, величина ОП490 с антителами сывороток кошки и собаки составил 1,290 -1,140, при низких фоновых значениях.
Следовательно, протеин А- пероксидазный коньюгат может быть использован для замены анти-IgG кошки и анти-IgG собаки коньюгатов в тест-системе при определении антител к вирусу бешенства методом непрямого ИФА. вирус бешенство антиген иммуноферментный
Таблица 2. Результаты получения протеин А- пероксидазного коньюгата.
|
Коньюгаты |
Рабоче разведение, дающее ОП490 1,0 |
ОП490 с сывороткой кошки / БСА |
ОП49 0 с сывороткой собаки / БСА |
Рабочая концентрация по ПХ, мкг/0,1мл |
|
|
Протеин А-ПХ р-р Протеин А-ПХ сух. Анти-IgG кошки АнтиIgG собаки |
1:4000 1:3200 1: 6000 1: 5000 |
1,290 / 0,120 1,220 / 0,110 1, 180/0,060 ------ |
1,140 / 0,170 1,120 / 0,190 ----- 1,210 /0,070 |
240 200 160 180 |
Включение сахарозо-желатиновой смеси позволило стабилизировать активность протин А- конъюгата и сохранить в лиофилизированном состоянии энзиматическую и иммунологическую активность в течение 2 лет (срок наблюдения).
Получение контрольных сывороток для иммуноферментной тест-системы.
Для постановки иммуноферментной тест-системы для определения уровня антител необходимо располагать контрольными сыворотками: положительной -антирабической сывороткой с содержанием вируснейтрализующих антител и отрицательной - сывороткой, не содержащей антитела к вирусу бешенства.
Антирабические сыворотки, полученные иммунизацией баранов и собак препаратом очищенного и инактивированного -пропиолактоном 1:4000 вируса бешенства, и сыворотки от невакцинированных собак исследовали на наличие антител к вирусу бешенства. Результаты серологического исследования сывороток представлены в таблице 3.
Таблица 3. Результаты серологического исследования контрольных сывороток.
|
Сыворотки |
Титры антител |
||||
|
РН |
РСК |
РДП |
РНИФ |
||
|
Нормальная сыворотка собаки |
-- |
-- |
- |
- |
|
|
Барана Собаки (1введ.) Собаки(2введен.) |
1:64 1:16 1:32 |
1:40 1:10 1:10 |
1: 128 1:2 1:8 |
1:160 1:20 1:40 |
Комплексное исследование антивирусной активности антирабических сывороток показало, что содержание специфических антител в них зависело от способа введения вируса бешенства и сроков взятия сыворотки.
Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках баранов в титрах 1:64 выявлялись в РН на 30-45 дни от начала иммунизации, комплементсвязывающих 1:160 - на 45-60 дни, преципитирующих в титре 1: 128 на 70-105 день от начала иммунизации.
Антирабическая сыворотка собаки с максимальные титром вируснейтрализующих антител 1:32 была получена на 45 день после двукратного введения очищенного вируса бешенства.
Исследование антирабической сыворотки барана в реакции непрямой иммунофлюоресценции показало, что она способна подавляю специфическую флюоресценцию в мазках мозга от мышей.
зараженных вирусом бешенства штамм «CVS», в разведении 1:160. Сыворотка вошла в диагностический набор «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» методом флюоресцирующих антител (Регистрационный № 1.2.-9/00080, утверждена 20.02 2006 г).
Антирабическая сыворотка барана с титром вируснейтрализующих антител 1:64 и собаки с титром 1:32 и пул сывороток, отрицательно реагирующих в РН, были использованы в качестве контрольных в разработке иммуноферментной тест-системы.
Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения в сыворотках крови антител к вирусу бешенства.
Для разработки иммуноферментной тест-системы непрямого ИФА использовали рекомендации, указанные в руководстве ВОЗ ( Manual of standarts Diagnostic Test and Vaccines,2004 часть 2.2.5). Оптимизация условий постановки непрямого ИФА для количественного определения антител включала: определение оптимальной дозы, времени и температуры сорбции компонентов в лунки микроплат, состава сенсибилизирующего и блокирующего буфера, режима и времени инкубации сывороток, регистрации и интерпретации результатов ИФА.
Постановку непрямого иммуноферментного анализа проводили с использованием следующих компонентов:
- антиген - препарат цельновирионного вируса бешенства с концентрацией 0,57 мг/мл, гликопротеин с концентрацией 0,12 мкг/мл;
-контрольные сыворотки: положительная - антирабическая сыворотки барана с титром вируснейтрализующих антител1:64 и собаки с титром в РН 1:32, отрицательная сыворотка -пул сывороток не содержащих антител к вирусу бешенства;
- стандартный препарат антирабический -глобулин человека с содержанием вируснейтрализующих антител 9 МЕ/мл;
- протеин А -пероксидазный коньюгат в рабочем разведении 1:4000.
Отработка оптимальных условий постановки непрямого иммуноферментного анализа для определения антител. Методом шахматного титрования препарата вируса бешенства и гликопротеина ( 0,12-10 мкг/мл) и антирабического -глобулина (1:50-1:6400) определена оптимальная концентрация вируса и ГП для сенсибилизации поверхности микроплат.
Оптимальная концентрация очищенного вируса бешенства составила 10мкг/0,1мл, гликопротеина 4 мкг/мл при времени экспозиции 1 ч при 370 С или 18 ч при температуре 40 С и использовании 10 мМ ФБР рН 7,8 с содержанием 0,3% обезжиренного молока и 0,05% тритона Х-100.
Исследования активности сорбированного на микроплаты вируса бешенства и ГП, показали сохранность этих свойств при хранении микроплат при 40 С в течение 6 мес (срок наблюдения) плотно закрытыми.
Для определения оптимальных условий сорбции контрольных и исследуемых сывороток исследовали величину ОП490 от времени и условий инкубации с вирусом, адсорбированным на микроплаты. Результатами опытов установлено, что инкубация предварительно инактивированных при 370 С в течение 30 мин контрольных , исследуемых сывороток и стандартного препарата в течение 1ч при 370С, является оптимальным при включении в 10мМ ФБР 0,5% обезжиренного молока и 1% сыворотки КРС.
Отмывка лунок микроплат на всех этапах сорбции трис-солевым буферным раствором рН 7,5 , содержащим 1% твин-20 и блокировка свободных сайтов связывания 2% раствором обезжиренного молока, позволила получить стабильные достоверные результаты ИФА.
Аналитическую чувствительность тест-системы непрямого ИФА исследовали титрованием стандартного препарата антирабического
-глобулина человека в диапазоне концентраций 0,018-9,0 МЕ/мл.
Установлено, что в оптимизированных условиях иммуноферментная тест-система непрямого ИФА обеспечивала обнаружение до 0,02-0,03 МЕ/мл антирабических антител. Тестированием в непрямом ИФА антирабических сывороток баранов установлено, что в сыворотках были обнаружены антитела к вирусу бешенства на 7 день после иммунизации.
Аналитическую специфичность тест-системы непрямого ИФА исследовали титрованием гетерологичной сыворотки, содержащей антитела к энтеровирусу и отрицательной (не содержащей вируснейтрализующих антител) сыворотки собаки.
Полученные результаты свидетельствуют, что разработанная тест-система ИФА является специфичной, так как позволяет достоверно дифференцировать антитела, специфические к вирусу бешенства (ОП490 0,9360,014), от гетерологичных антител (ОП490 0,2200,002) и антител отрицательной сыворотки (ОП490 0,1200,001).
Определение допустимых значений оптических плотностей контрольных сывороток.
Для определения допустимых значений ОП490 контрольных сывороток, проанализировали ОП490, полученные титрованием 12 повторностей положительной и отрицательной сывороток собаки в разведении 1:10.
Установлено, что результаты определений антител в разработанной иммуноферментной тест-системе считаются достоверными, если допустимые значения для положительной сыворотки ОП490 0,300 и для отрицательной сыворотки ОП490 0,15.
Если ОП490 контрольных сывороток выходят за рамки допустимых значений, то результаты ИФА будут считаться сомнительными и пробы сывороток должны быть исследованы повторно.
Для определения оптимального разведения исследуемых сывороток их титровали в разведении 1:50-1:1600. В результате исследований было выбрано в качестве рабочего разведение 1:100, при котором достоверно различались положительные (ОП490 0,8360,004) и отрицательные (ОП490 0, 1200,012) сыворотки.
Количественное определение антирабических антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак
Количественное определение антирабических антител проводили на основе сравнения ОП490 исследуемой сыворотки в разведении 1:100 с кривой титрования стандартного препарата -глобулина человека с применением линейного регрессионного анализа. Для этого титровали стандартный препарат -глобулин человека в диапазоне концентраций
0,03-9 МЕ/мл и строили линию регрессии, как функцию ОП490 (ось У) к концентрации антител (ось Х). Используя результаты титрования стандартного препарата, рассчитывали коэффициенты А, В уравнения регрессии: IgУ=А +В IgХ.(МЕ/мл).
На основании расчетов коэффициентов регрессии А и В было выведено уравнение У= 0,56+ 0,108 х ХМЕ/мл.
Коэффициент корреляции результатов определения ОП490 и концентрации антител в стандартном препарате составил 0,84.
Установлена пороговое значение ОП490 =0,620 о.е., по которой определено минимальное содержание в сыворотках крови антирабических антител (0,5 МЕ/мл). При ОП490 0,620 о.е. уровень антирабических антител в исследуемой сыворотке более 0,5 МЕ/мл.
Следующим этапом было сравнение результатов количественного определения антирабических антител в 41 сыворотках привитых кошек и собак, полученных с помощью иммуноферментной тест-системой с применением в качестве антигенов очищенного вируса и гликопротеина с результатами РН в культуре клеток. Чувствительность и специфичность тест-системы ИФА и РН в культуре клеток определяли в соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO Laboratory Techniques in Rabies, 2004). Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4. Результаты исследований сывороток в тест-системах ИФА и РН
|
Результаты ИФА с очищенным вирусом бешенства |
РН 0,5МЕ/мл |
РН 0,5МЕ/мл |
|
|
0,5МЕ/мл 23 В |
21A |
2 |
|
|
0,5МЕ/мл 18 D |
1 |
17 С |
|
|
Результаты ИФА с ГП Вируса бешенства |
РН 0,5МЕ/мл |
РН 0,5МЕ/мл |
|
|
0,5МЕ/мл 27 В |
24A |
3 |
|
|
0,5МЕ/мл 15 D |
2 |
13 С |
Примечание:
Относительная чувствительность А/В х100%,где:
А- количество проб 0,5МЕ/мл в разработанной тест-системе, совпадающих с количеством проб в РН;
В- количество проб 0,5МЕ/мл в РН;
Относительная специфичность С/Dх100%,где:
C-количество проб 0,5МЕ/мл в разработанной тест-системе, совпадающих с количеством проб в РН;
D- количество проб 0,5МЕ/мл в РН;
Там образом, разработанная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых кошек и собак с применением в качестве антигена очищенного вируса бешенства, обладала большей чувствительностью и специфичностью (91% и 94%), по сравнению с ИФА на основе гликопротеина вируса бешенства (88% и 86% соответственно).
Применение разработанной тест-системы для определения антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак
С помощью разработанной иммуноферментной тест-системой было исследовано 17 сывороток от вакцинированных кошек и щенков,собак, а также 24 сыворотки КРС (стадо дойных коров Тульской области после однократной вакцинации, сыворотки взяты 6 мес п/в). Исследовали сыворотки крови кошек и собак 3-х групп: кошки и собаки, подвергнутые плановой вакцинации (1группа), ранее вакцинированные, с неизвестным сроком после вакцинации (2 группа), ранее не вакцинированные (3 группа). Исследовали сыворотки кошек и собак после плановой вакцинации в ветеринарных клиниках, взятые на 30,60,90 дни после вакцинации и определяли динамику накопления антирабических антител.
Согласно полученным данным, после однократной вакцинации уровень антител у кошек на 30 день составил 1,0-2МЕ/мл, собак 2-4МЕ/мл, на 60 день 3,5-4 МЕ/мл и 6-8 МЕ/мл, на 90 день после вакцинации 2-2,5 МЕ/мл и 4-6,5 МЕ/мл соответственно.
Установлено, что у 56% кошек и 77% собак, 2 группы с неизвестным сроком вакцинации и у 97% 3 группы наблюдался низкий ( мене 0,5МЕ/мл) уровень антирабических антител.
Содержание антирабических антител 1,5-3 МЕ/мл на 30-45 дни п/в определен в сыворотках крови кошек и собак, содержащихся в приюте, питомнике и домашнего содержания, подвергнутых ежегодной, обязательной вакцинации.
Из 24 сывороток КРС, в 16 сыворотках уровень антирабических антител составил 1-2 МЕ/мл, в остальных 0,32-0,6 МЕ/мл.
Исследование эффективности применения иммуноферментной тест-системы и РН для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.
Для оценки эффективности разработанной иммуноферментной тест-системы были отобраны по результатам ИФА и исследованы в РН 17 сывороток от привитых против бешенства кошек, собак и щенков с содержанием антител 0,5-0,9 МЕ/мл и 5 сывороток менее 0,5 МЕ/мл.
Согласованность двух тестов определяли методом каппа-статистики (Landis Koch, 1997). Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4 Результаты ИФА и РН при определении уровня антирабических антител
|
Сравниваемые Тесты |
Результаты РН |
Всего |
Выявленная превалентность в ИФА |
|||
|
0,5МЕ/мл |
0,5МЕ/мл |
|||||
|
ИФА |
0,5МЕ/мл |
15А |
2 |
17В |
(15+2)/22=0,77 |
|
|
0,5МЕ/мл |
1 |
4С |
5D |
(1-4)/22=0,13 |
||
|
Всего |
16 |
6 |
22 |
|||
|
Выявленная превалентность в РН |
(15+1)/22=0,72 |
(2-4)/22=0,09 |
Согласованность результатов 2-х тестов определяли по следующим показателям:
-абсолютная согласованность результатов непрямого ИФА (17-2)/22=0,68
-случайная согласованность положительных результатов 0,77 х 0,72= 0,55
-случайная согласованность отрицательных результатов 0,09х0,13= 0,001
-обобщенная случайная вероятность согласованности результатов 0,55х0,001=0,005
-наблюдаемая согласованность результатов без учета случайности 0,68-0,005=0,675
-неслучайная максимально возможная согласованность методов 1-0,005=0,995
-критерий (каппа-статистика): 0,675/0,995=0,67
Значение каппа показывают:
-очень хорошая согласованность каппа 0,81-1,00;
-хорошая согласованность каппа 0,61-0,80
-умеренная согласованность каппа 0,41-0,60
-слабая согласованность каппа 0,21-0,40
-очень слабая согласованность каппа 0,01-0,20
-незначимая согласованность каппа 0
Определенная нами величина каппа 0,67 входит в интервал значений 0,61-0,80 и выражает параметр * хорошее*. Следовательно, в нашем случае значение К-критерия, равное 0,67, свидетельствует о хорошей согласованности результатов двух тестов.
Чувствительность разработанной тест-системы непрямого ИФА относительно РН составила 88% и специфичность 80%.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработана иммуноферментная тест-система на основе непрямого ИФА с использованием вируса бешенства штамм»CVS», референс-препарата с известным содержанием вируснейтрализующих антител и протеин-А пероксидазного коньюгата для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.
Практические предложения
Для практического использования предлагаются:
Инструкция по применению набора «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных». Регистрационный № ПВР.1.2.-9/00080, утверждена 22.02.06. Инструкция по изготовлению и контролю «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» и утвержденная директором ВНИТИБП 01.2006г.
«Методические указания по определению уровня антител у привитых против бешенства кошек и собак методом ИФА», рассмотренны и одобрены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.
Научно-техническая документация: «Временная инструкция по изготовлению и контролю набора компонентов для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства
кошек и собак методом ИФА».
Временные технические условия «Иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак».
«Временная инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак».
НТД и акты комиссионных испытаний одобрены Ученым советом, утверждены директором ВНИТИБП (03.2008г.).
Выводы
1. С использованием последовательного центрифугирования при 1 тыс.g и 50 тыс.g и гель-хроматографии на сефарозе 4В получен очищенный и концентрированный вирус бешенства штамм «CVS» 97,4% чистоты по белку, инфекционностью на 1,2 lgLD 50/см выше исходной и активностью в ИФА 1:800.
2. Обработкой вируса бешенства штамм «CVS» 2% тритоном Х-100 получен гликопротеин вируса с сохранением антигенной активности, определяемой в ИФА в титре 1:600.
3. При введении животным очищенный вирус бешенства и ГП вызывал образование в сыворотках вируснейтрализующих антител в титрах 1:8 -1:64 и содержанием антирабических антител 2-12 МЕ/мл.
4. Иммунизацией баранов и собак инактивированным -пропиолактоном 1:4000 очищенным вирусом бешенства штамм «CVS» получены антирабические сыворотки с титром вируснейтрализующих антител, определенных в РН 1:16-1:64 и содержанием 4-24 МЕ/мл антител, пригодные в качестве контрольных положительных сывороток и референс-препаратов для иммуноферментной тест-системы.
5. Показано, что протеин А- пероксидазный коньюгат в рабочем разведении 1:4000 и концентрации по ПХ - 240 мкг/0,1мл может быть использован в иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках привитых кошек и собак.
6. Разработана иммуноферментная тест-система непрямого ИФА для количественного определения в сыворотках крови антитела к вирусу бешенства с чувствительностью 0,02-0,03 МЕ/мл антирабических антител. Установлено, что относительно РН, чувствительность и специфичность тест-системы непрямого ИФА с использованием в качестве антигена очищенного вируса была выше ( 91% и 94%), в сравнении с использованием гликопротеина вируса (88% и 86% соответственно).
7. Установлена пороговая величина ОП490 =0,620 о.е., по которой определен в сыворотках крови привитых кошек и собак уровень антирабических антител менее 0,5 МЕ/мл.
8. Установлена согласованность (K=0,67) результатов, полученных при определении уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в разработанной иммуноферментной тест-системе и РН в культуре клеток. Чувствительность разработанной тест-системы непрямого ИФА относительно РН составила 88%, специфичность 80%.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Клюкина В.И., Гринь С.А. Рахманин П.В., Востряков К.В. Современная эпизоотическая ситуация бешенства в республике Карелия. Материалы международной юбилейной научно-практической конференции посв. 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России. Курск, 2006, - С 131-132
Клюкина В.И, Рахманин П.В.. Серологическое обнаружение антирабических антител. Материалы Международной научно-практической конференции к 100-летию рождения Я.С.Коваленко «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных 16-17 мая 2006 г. -Щелково-2007, - С 251.
Клюкина В.И, Гринь С.А., Рахманин П.В., Проничев А.Б. Получение и изучение иммунохимических свойств компонентов вируса бешенства.. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 20-21 декабря 2007 г. -Щелково-2007, - С 95-99.
Рахманин П.В.,.Клюкина В.И, Проничев А.Б., Востряков К.В. Определение антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»,20-21 декабря, 2007г,-Щелково-2007, - С 99-103.
Клюкина В.И, Востряков К.В., Рахманин П.В., Проничев А.Б. Ситуация по бешенству в Ненецком Автономном округе. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 20-21 декабря 2007 г.
Рахманин П.В., Клюкина В.И, Проничев А.Б. Иммуноферментная тест-система определения уровня иммунитета у вакцинированных против бешенства кошек и собак. Ветеринария и кормление.№ 3, 2008, -С 45-46
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Первые сведения о вирусе бешенства, описанные древними врачами. География распространения бешенства и экономический ущерб от него. Эпизоотологические данные и этиология заболевания. Патогенез, клиническая картина, основные методы профилактики бешенства.
реферат [25,4 K], добавлен 06.02.2012Определение распространения бешенства животных в Троицком районе Челябинской области. Оценка полноты проведения профилактических ветеринарных мероприятий против бешенства животных на территории района. Экономическая эффективность профилактики бешенства.
дипломная работа [3,2 M], добавлен 19.02.2023Определение, актуальность проблематики стрессовых и агрессивных состояний для владельцев кошек и собак. Перечень и краткая характеристика поведенческих отклонений у домашних животных. Причины и предрасполагающие факторы стрессовых и агрессивных состояний.
реферат [46,8 K], добавлен 10.10.2014Инвазионные болезни, их ущерб животноводству. Морфология и биология возбудителей, эпизоотология болезней. Аноплоцефалидозы лошадей, мезоцестоидозы собак, дипилидиоз и дифиллоботриоз плотоядных. Гельминтозное заболевание собак, кошек и пушных зверей.
реферат [22,3 K], добавлен 17.01.2011Эпизоотическая обстановка по бешенству в Волоколамском районе. Анализ заболеваемости по бешенству. Клинические признаки, лечебные мероприятия применяемые на практике, их результативность. Ветеринарные мероприятия по профилактике и ликвидации бешенства.
презентация [1,9 M], добавлен 18.05.2019Таксономия, этапы репродукции вируса ринотрахеита кошек. Основной путь заражения. Особенности культивирования в различных живых системах. Клинические признаки заболевания. Принципы диагностики герпес-вирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции.
реферат [1,6 M], добавлен 02.06.2015Эпизоотическая характеристика инфекционных болезней кошек, понятие их специфической профилактики. Особенности эпизоотологического и клинического проявления кальцивирусной инфекции у кошек. Анализ результатов лечения кошек, больных кальцивирозом.
дипломная работа [130,1 K], добавлен 16.05.2017Особенности пищеварения у собак. Влияние кормления собак на их здоровье. Развитие и работоспособность служебных собак. Нормы и потребности собак в энергии, питательных и биологических активных веществах. Кормовые продукты для собак, режим их кормления.
реферат [65,6 K], добавлен 06.01.2015Общая характеристика болезней ушей у кошек, их классификация и разновидности, главные причины возникновения. Этиология и патогенез отита кошек, причины возникновения, принципы диагностики и меры профилактики. Основные правила ухода за ушами кошек.
курсовая работа [77,7 K], добавлен 31.03.2014Изучение этиологии, общая характеристика и определение клинических признаков панлейкопении кошек как острозаразной вирусной болезни, характеризующейся поражением кишечника. Дифференциальная диагностика, лечение и система профилактики панлейкопении кошек.
реферат [18,1 K], добавлен 20.01.2012Особенности и сущность ринотрахеита кошек, его идентификация, основные возбудители, распространение, влияние на организм, осложнения, патологоанатомические признаки, диагностика, профилактика и лечение. Общая профилактика инфекционных болезней кошек.
реферат [17,1 K], добавлен 26.09.2009Анализ развития собаководства в мире. Применение служебных собак в охране объектов. Характеристика хозяйства и условия работы в питомнике по разведению служебных собак. Методика перевода собак с одного типа кормления на другой. Зоогигиена и ветеринария.
реферат [43,2 K], добавлен 21.11.2016Потребность собак в питательных веществах. Кормовые продукты для собак животного и растительного происхождения. Рационы и режим, общие правила кормления животных. Нормы потребности взрослых собак в аминокислотах и витаминах, минеральных веществах.
дипломная работа [3,0 M], добавлен 04.11.2014Первостепенные источники инвазии для человека. Возрастная динамика описторхоза и дипилидиоза. Различия в экстенсивности и в интенсивности заражения кошек в районах с различной степенью урбанизации. Воспалительная реакция в тонком кишечнике кошек.
статья [193,4 K], добавлен 18.07.2013Принципы и этапы организации тренировочного процесса и наиболее рационального использования служебных собак в исследуемом подразделении. Выявление организации специального дрессировочного, тренировочного процесса и использования собак в питомниках.
презентация [1,4 M], добавлен 14.06.2016Обмен и взаимодействие минеральных веществ в организме животных. История открытия ряда микроэлементов, их биологическая роль в состоянии здоровья кошек, дозы, показанные для добавления в рацион. Потребности кошек в питательных веществах и энергии.
курсовая работа [39,4 K], добавлен 16.02.2017Специализация различных производственных групп охотничьих собак. Проведение испытаний собак, предназначенных для охоты. Оценка рабочих качеств охотничьих собак. Характеристика основных стандартов. Русско-европейская лайка, ее особенности и работа.
контрольная работа [29,0 K], добавлен 02.01.2017Предрасполагающие факторы мочекаменной болезни у кошек. Анатомические особенности органов мочеотделения как пусковые механизмы мочекаменной болезни у кошек. Значимость рационального подбора рациона кормления для мелких домашних животных в условиях города.
реферат [28,8 K], добавлен 10.08.2017Особенности содержания кошек. Устройства для транспортировки. Кошачий туалет, заточка когтей. Кормление кошки, свежий и сухой корм. Потребность кошек в воде, минеральных веществах, микроэлементах и витаминах. Санитарно-гигиенические условия содержания.
курсовая работа [78,4 K], добавлен 22.01.2012Структура и организация ветеринарной службы. Основные правила обследования животных. Приемы взятия, упаковки и пересылки патологического материала. Проведение профилактической прививки и дегельминтизации. Вакцинация против сибирской язвы и бешенства.
отчет по практике [34,3 K], добавлен 06.02.2011
