Физиологические и биохимические параметры спермы. Методы оценки качества спермы. Современные подходы к сохранению, разбавлению и транспортировке спермы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Лекция

Физиологические и биохимические параметры спермы. Методы оценки качества спермы. Современные подходы к сохранению, разбавлению и транспортировки спермы

План лекции

1. Физиология спермы

2. Спермии, их строение, виды и скорость движения

3. Анабиоз и дыхание спермиев

4. Современные подходы к сохранению, разбавлению и транспортировки спермы

1. Физиология спермы

Сперма это сложная биологическая жидкость, состоящая из двух основных частей: мужских половых клеток (спермиев) и плазмы (секрет придаточных желез).

Количество спермы, выделяемой во время полового акта, называется эякулятом. Объем эякулята и число спермиев в единице объема имеют существенные видовые отличия. Так, бык за садку выделяет 5-10 мл спермы, баран - 0,3-2 мл (до 3 мл у баранов романовской породы). Эти животные относятся к влагалищному типу естественного осеменения.

У животных с маточным типом естественного осеменения объем эякулята сравнительно большой: у жеребца 20-150, мах 200 мл, хряка - 150-500, кобеля - 2-40 (в зависимости от породы).

Четко прослеживается обратная зависимость между объемом эякулята и концентрацией спермиев. Сперма барана и быка наиболее насыщена спермиями - концентрация составляет соответственно 0,8-2 млрд и 2-4 млрд в 1 мл. хряк и жеребец выделяют сперму с более низкой концентрацией - 01,-0,4 млрд/мл; наименее концентрированная сперма у кобеля - 0,06-0,12 млрд/мл. Соответственно этому доля спермиев по отношению к общему объему эякулята составляет: у барана - 30 %, быка-10, хряка-3-7, жеребца-3 %, остальная часть представлена секретами придатков семенников и придаточных половых желез.

Соотношение секретов эпидидимиса (придатка семенника) и отдельных придаточных половых желез и их роль в формировании жидкой части спермы (плазмы) имеет видовую специфику. Сперма содержит 85-97 % воды и 3-15 % сухих веществ сухой остаток на 9 % состоит их белков и липидов. Сперма быка и барана богата сахарами, их которых преобладает фруктоза. В значительных количествах содержатся лимонная кислота, свободные аминокислоты, эрготионин, инозотол, сорбитол, глицерилфосфорилхолин. В сперме широко представлены биологически активные вещества: ферменты (кислая и щелочная фосфотаза, гиалуронидаза, глюкозидаза, амилаза, липазы, протеазы, оксидазы и др.), антагглютинины, простагландины, гормоны: андрогены, эстрогены. В сухом веществе спермы около 1 % золы. Зольная часть содержит фосфор, кальций, магний, калий, натрий, хлор, цинк, железо, медь и ряд других элементов.

2. Спермии, их строение, виды и скорость движения

сперма биохимический анабиоз хранение

Спермий имеет микроскопически малую величину. Общая длина спермия составляет 60--70 мкм. В единице объема, соразмерном яйцу млекопитающих, вмещается около 20 тыс. спермиев. В объеме 1 см³ (без плазмы) насчитывается 12,5 млрд спермиев.

Различают 5 поперечных участков спермия: головку, шейку, тело (средняя часть), жгутик (хвост) и концевой участок жгутика. Головка имеет длину 8-- 10 мкм, шейка -- 1, средняя часть -- 8--10, жгутик -- 35--50, концевой участок жгутика -- 3 мкм. На головку приходится 49 % массы спермия, тело -- 15, хвост -- 36%. Головка является носителем генетического кода; шейка, тело и хвост -- это двигательная (локомоторная) часть спермия.

Головка представляет собой выпукло-вогнутую пластинку. Форма головки у барана и быка суживающаяся кзади, у хряка и жеребца -- равномерно овальная. Головка состоит из акросомы в виде двухслойного колпачка, прикрывающего передние 2/3 головки, системы перекрещивающихся фибрилл, образующих каркас оболочки, бокаловидной капсулы, кольцевого основания. Свыше половины массы головки составляет ядро. Хроматиновый материал ядра сконцентрирован преимущественно в нижней части головки.

Шейка является связующим звеном между головкой и средней частью. Это наиболее слабая, легкоповреждаемая часть спермия. В ней расположена проксимальная центриоль (центросома), выполняющая роль локомоторного центра. От нее берет начало осевая нить, состоящая из двух прочно спаянных между собой фибрилл. Осевая нить проходит по всей длине локомоторной части спермия, постепенно истончаясь.

Проксимальная центриоль окружена двумя базальными гранулами, имеющими вид колец элипсоидной формы. От каждой базальной гранулы отходит по 9 тонких волоконец -- фибрилл, причем фибриллы наружного кольца в несколько раз толще соответствующих им фибрилл внутреннего кольца. Фибриллы соединены между собой и с осевой нитью тонкими нитями -- спицами.

Кольцевые фибриллы содержат сократительные белки (скантин, спермозин), сходные по своему составу с актомиозином. При сокращении фибрилл хвост: изгибается, причем одни фибриллы изгибают хвост вправо, другие -- влево.

Фибриллы опоясаны спиральными элементами. Тело плотно обвито двойной спиралью; последняя заканчивается кольцевой центриолью, расположенной на границе тела и хвоста спермия. Хвост по всей длине, за исключением концевой части, опоясан тройной спиралью. Спиральные элементы придают жгутику прочность, не лишая его гибкости. В области тела они имеют митохондриальное происхождение. В митохондриях сосредоточены ферменты гликолитическсго и окислительного характера, участвующие в выработке энергии для движения спермиев.

Спермий покрывает цитоплазматическая мембрана. Благодаря наличию в ее составе серусодеращих аминокислот (нистин, цистеин) она устойчива к протеолитическим ферментам, щелочным и кислым растворам.

Спермии обладают подвижностью, которая необходима для достижения ими места оплодотворения и проникновения в глубь яйца.

Движение спермиев осуществляется в результате последовательных сокращений и расслаблений боковых фибрилл; эти движения координируются импульсами, поступающими через осевую нить от проксимальной центриоли. В результате хвост спермия совершает хлыстообразные удары. При каждом ударе хвоста головка, обладая неустойчивостью в поперечном направлении, совершает поворот вокруг оси, что обеспечивает винтообразное движение спермия по прямой линии.

Скорость поступательного движения спермиев зависит от температуры, рН, вязкости среды и других факторов. При оптимальных условиях спермий движется со скоростью 5--6 мм/мин.

Если головка спермия набухла и утратила выпукло-вогнутую форму, характер движения меняется -- оно становится манежным (по кругу). Это чаще всего происходит из-за пониженного осмотического давления жидкости, в которой находятся спермий. При медленных и слабых движениях хвоста, обусловленных, например, израсходованием энергетических ресурсов, движение спермиев становится колебательным. Оба вида движения (манежное и колебательное) относят к анормальным.

Важная особенность спермиев -- способность к реотаксису, т.е. ориентированному движению против тока жидкости. Реотаксис играет большую роль в механизме сближения спермиев с яйцом.

3. Анабиоз спермиев

Если медленно охлаждать сперму, движение спермиев становится все более замедленным, а затем полностью прекращается. Этот процесс является обратимым: после подогревания до 37--38°С движение спермиев восстанавливается.

Неподвижное состояние спермиев, при котором они сохраняют жизнеспособность, называется анабиозом.

Благодаря анабиозу расход энергетических ресурсов на процессы жизнедеятельности спермиев и накопление продуктов метаболизма резко тормозятся, что увеличивает срок их жизни вне организма. Это явление широко используется в искусственном осеменении. Достаточно сказать, что все существующие способы кратковременного и длительного хранения спермы основаны на создании и поддержании анабиоза. В настоящее время известно несколько методов создания искусственного анабиоза спермиев:

* понижение температуры до 2--4°С;

* глубокое охлаждение спермиев (до -196°С);

* снижение рН спермы до 6,3--6,4 применением органических кислот (угольная, лимонная и др.);

* применение химических ингибиторов метаболических процессов в спермиях (хелатон и др.).

Движения спермиев требуют значительных затрат энергии. Основными ее источниками являются углеводы (глюкоза, фруктоза, сорбит), липиды, свободные аминокислоты.

Спермин являются факультативными анаэробами, т.е. могут жить и двигаться как в присутствии кислорода, так и в бескислородной среде. В бескислородной среде движение осуществляется лишь при наличии Сахаров, которые при этом расщепляются посредством фруктолиза. При свободном доступе кислорода спермин черпают энергию за счет дыхания, окисляя помимо Сахаров и другие питательные вещества (преимущественно жиры).

Из одного и того же количества питательных веществ в процессе дыхания высвобождается в 19 раз больше энергии, чем при фруктолизе. Спермин получают около 90% энергии за счет дыхания и лишь 10% -- за счет фруктолиза; таким образом, фруктолиз служит лишь вспомогательным источником энергии.

Энергия в доступной для спермиев форме аккумулирована в митохондриях спиральных нитей в виде особого органического соединения -- аденозинтрифосфата (АТФ).

АТФ состоит из аденина, аденозина и трех молекул фосфорной кислоты. Связь первых двух молекул фосфорной кислоты богата энергией и может быть разрушена ферментативным путем.

Под воздействием фермента фосфатазы АТФ распадается на аденозиндифосфат (АДФ) и фосфорную кислоту. На втором этапе происходит расщепление АДФ на аденозинмонофосфат (АМФ) и фосфорную кислоту.

Получаемая таким путем энергия используется спермиями для движения, биосинтеза ряда веществ; часть ее выделяется в виде тепла.

Ресинтез АДФ и АТФ происходит в митохондриях спиральных нитей путем присоединения неорганического фосфора. Необходимую для этого энергию спермин получают в процессе расщепления питательных веществ, содержащихся как в самих спермиях, так и поступающих извне.

В анаэробных условиях при наличии моносахаридов (фруктоза, сорбитол, глицерилфосфорилхолин) разложение указанных веществ происходит путем фруктолиза. Фруктолиз представляет собой цепь взаимосвязанных реакций. Вначале происходит перенос одной молекулы фосфора с АТФ на фруктозу (реакция фосфорилирования), в результате образуется фосфофруктоза. Она присоединяет еще одну молекулу фосфора -- образуется дифосфофруктоза. Последняя расщепляется на две молекулы фосфоглицеринового альдегида. В свою очередь, фосфоглицериновый альдегид окисляется в фосфоглицериновую кислоту, при этом выделяется энергия, необходимая для восстановления АТФ. Отщепляя воду, фосфоглицеринвая кислота превращается в фосфопировиноградную кислоту, фосфор которой переносится на АДФ, причем образуется пировиноградная кислота и АТФ. Пировиноградная кислота, присоединяя выделившийся при окислении фосфоглицеринового альдегида водород, восстанавливается до молочной. Каждое звено этой сложной цепи превращений осуществляется при помощи особого фермента. Все эти реакции протекают с огромной скоростью -- в сотые доли секунды.

Таким образом, конечным продуктом фруктолиза является молочная кислота. Около 25% образующейся молочной кислоты спермин могут использовать для дыхания; остальное накапливается в сперме, обусловливая смещение рН в сторону кислотности. Дыхание протекает с участием ферментов, усваивающих свободный кислород (цитохромоксидаза и др.). В отличие от фруктолиза, фруктоза распадается до уксусной кислоты, которая в митохондриях спермиёв образует лимонную кислоту; последняя распадается на углекисльй газ и воду.

В процессе дыхания спермин могут окислять не только сахара, но и липиды (плазмалоген), свободные аминокислоты, низшие жирные кислоты (молочная, уксусная). Белки спермиев почти не расходуются.

Пополнение энергетическим материалом извне происходит за счет низкомолекулярных соединений (глюкоза, фруктоза, органические кислоты, свободные аминокислоты); липиды спермин могут использовать лишь из тех резервов, которые находятся в структурах самого спермия.

По соотношению процессов дыхания и фруктолиза сперму сельскохозяйственных животных принято делить на 2 типа.

1.Содержит значительные количества сахаров и слабо обеспечена дыхательными ферментами. Она способна в равной мере к дыханию и фруктолизу. К этому типу относится сперма быка, барана, козла.

2. Содержит лишь следы сахаров, дыхательными ферментами хорошо обеспечена. Преобладают процессы дыхания, причем вследствие низкой концентрации сахаров расходуются преимущественно липиды. Это сперма жеребца, хряка, кобеля.

В анаэробных условиях спермин быка, барана, козла сохраняют жизнеспособность значительно дольше, чем хряка, жеребца, кобеля. Объясняется это тем, что в связи с быстрым нарастанием концентрации молочной кислоты спермин переходят в состояние анабиоза. Благодаря анабиозу расход энергетических веществ резко тормозится; в таком состоянии спермии могут сохранять жизнеспособность продолжительное время.

При снижении рН до 6,0--6,4 наступает первая фаза анабиоза, из которой спермин можно вывести подогреванием до 37--38°С. Если рН понизилась до 5,0--6,0, то наступает вторая фаза анабиоза; для восстановления подвижности спермиев требуется подщелочить среду. При рН ниже 5,0 происходит массовая гибель спермиев. Исследование спермы. Решающим показателем качества производителя служат результаты исследования спермы. Высокие экстерьерные показатели и кровность теряют всякое значение, если у производителя выявляется аспермия или неполноценная сперма.

При получении спермы для оценки производителя пользуются искусственной вагиной. Если сперма недоброкачественная, ее исследуют повторно. Нельзя забывать, что после длительных перерывов в половой нагрузке (у жеребцов весной) производитель при первом коитусе почти всегда выделяет сперму низкого качества.

Доброкачественная сперма содержит достаточное количество живых, устойчивых во внешней среде и способных принять участие в оплодотворении спермиев, ока свободна от посторонних примесей (кровь, гной, микробы).

Сперму исследуют макроскопически и микроскопически.

Исследование спермы начинают с определения объема эякулята градуированным цилиндром или стаканом .

Цвет нормальной спермы белый или желтый с желтым оттенком. Сероватый или голубоватый оттенок -- признак олигоспермии (недостаточное число спермиев). Очень желтый цвет обычно указывает на примесь мочи. Розоватый или красноватый цвет--признак примеси крови как дествие свежей травмы. Буро-красный цвет указывает на глубокую травму половых путей давнего происхождения. Зеленоватый оттенок сперма приобретает от примеси гноя. Хлопья в сперме наблюдаются при воспалении пузырьковидных желез.

Запаха нормальная сперма не имеет или она обладает легким запахом жиропота. При хронических, гнойных процессах в семенниках и в придаточных половых железах сперма может иметь гнилостный запах и зеленоватый оттенок. Консистенция спермы быка сливкообразная. барана -- сметанообразная, жеребца и хряка -- наподобие молока.

Макроскопическое исследование не дает оснований для заключения о пригодности или непригодности спермы. Но результаты его служат предпосылкой для тщательного микроскопического исследования спермы, которое позволяет установить качество спермы и спермиев, а также причины изменения ее внешнего вида.

Микроскопическое исследование спермы. Техника исследования спермы описана в учебном пособии Г. В. Зверевой и др. «Практикум по акушерству, гинекологии и искусственному осеменению сельскохозяйственных животных». Ниже рассматриваются лишь общие теоретические вопросы.

При микроскопическом исследовании спермы выявляются следующие ее элементы и примеси: 1) спермин нормальные и патологические: 2) клетки плоского, переходного эпителия, клетки семенных канальцев (зернистые); 3) форменные элементы крови -- эритроциты и лейкоциты: 4) гиалиновые шары, круглые или овальные, иногда слоистые и напоминающие зерна крахмала, амилоидные тельца, сильно блестящие -- лецитиновые зернышки, кристаллы спермина и др. Если примесей в сперме немного, это считается нормой. Если примесей много, необходимо выявить их источник и причину.

Основное внимание при микроскопическом исследовании концентрируется на количестве и подвижности спермиев. В практике обычно пользуются глазомерной оценкой густоты спермы и подвижности спермиев. По насыщенности спермиями сперму барана и быка оценивают как густую, обозначаемую буквой Г, если все поле зрения заполнены спермиями и в пространстве между ними не укладывается длина одного спермия. В 1 мл густой спермы быка содержится 1 млрд., у барана -- более 2 млрд., у хряка и жеребца 0,2 млрд. и более спермиев. Средней густоты сперма (С), когда между спермиями хорошо выражены промежутки, в 1 мл ее содержится у быка 0,5--1 млрд., у барана--1--2 млрд. у хряка и жеребца 0,1--0,2 млрд. спермиев. Редкая сперма (Р), когда пространство между спермиями превышает длину одного спермия: г 1 мл ее содержится у быка менее 0,5 млрд., у барана менее 1 мл (рис. 21). Руководствуясь этими данными и зная объем эякулята, можно определить количество спермиев в эякуляте в любой дозе спермы. Отсутствие в сперме спермиев обозначают буквой А (аспермия).

Подвижность спермиев определяют глазомерно и оценивают по десятибалльной системе. Каждый балл равен 10% спермиев, обладающие поступательным движением. Если спермин имеют манежное движение (по кругу) или только колеблются, качество спермы оценивают буквой К (колебательное движение). Сперму с неподвижными спермиями обозначают буквой Н (некроспермия).

При оценке спермы на густоту и подвижность спермиев применяйся комплексное обозначение, позволяющее удобно отражать ее качество. Например, Г--10 баллов означает, что исследуемая сперма густая s 100% спермиев обладают головным, прямолинейным движением; 9 баллов означает 90%, 8--80%, 7--70% и т. д. подвижных спермиев.

Свежеполученная сперма быка с оценкой Г и С, с подвижностью от ГО до 8 баллов считается пригодной для использования. Сперма, имеющая оценки ГН (густая, некроспермия), СК (средняя с колебательным движением), А (отсутствие спермиев в эякуляте), непригодна для использования. Независимо от оценки по густоте непригодна для использования и сперма, имеющая по подвижности меньше 8 баллов.

Свежеполученная сперма барана допускается к использованию густая с подвижностью 10--8 баллов.

Сперму жеребца и хряка также оценивают по десятибалльной системе. Сперма этих животных считается пригодной для осеменения, если подвижность спермиев у хряка не ниже 7, а у жеребца --5 баллов.

Учет живых спермиев по окраске мазка. Глазомерная оценка активности спермиев очень субъективна, поэтому В. А. Морозов предложил пользоваться окрашиванием спермы водным раствором эозиннигрозина. Живые и активные спермин не окрашиваются, а мертвые и с колебательными движениями воспринимают краску. Для определения концентрации спермиев жеребцов Г.В.Паршутиным и Е.В.Румянцевой сконструированы специальные стандарты. Они представляют собой запаянные пробирки, содержащие жидкость, имеющую цвет, соответствующий той или иной известной концентрации спермы. Для определения концентрации исследуемую сперму наливают в пробирку с диаметром стандартных пробирок, устанавливают рядом с ней пробирки стандарта и подбирают наиболее подходящий по виду стандарт, на котором отмечено количество спермиев в 1 мл спермы.

Определение числа спермиев. Для_определения количества спермиев в эякуляте пользуются счетной камере Горяева, Тома или Тюрка. Для удобства подсчета сперму разбавляют дистиллированной водой или 3-процентным раствором хлорида натрия, который одновременно убивает спермиев. Сперму разбавляют в смесителях (меланжерах), применяющихся для подсчета красных и белых кровяных клеток. Всего подсчитывают спермин в 80 малых квадратиках (16X5) счетной камеры. Считают два раза. Если итоги первого и второго подсчета расходятся более чем на 10%,, счетную камеру заряжают третий раз из того же смесителя и устанавливают среднее количество подсчитанных спермиев.

Чтобы узнать количество спермиев в одном маленьком квадратике (кубике) камеры, полученную сумму делят на 80; объем одного маленького квадратика равен 1/4 000000 мл, площадь маленького квадратика 1/400 мм², глубинна камеры 0,1 мм. Чтобы узнать количество спермиев в 1 см³, среднее число спермиев, обнаруженных в одном маленьком квадратике, умножают на 4 000000, а затем на степень разведения спермы. Зная количество спермиев в 1 мл спермы и объем эякулята, легко подсчитать общее количество спермиев в эякуляте.

В настоящее время станции искусственного осеменения пользуются электрофотоколориметрическим методом, основанным не на прямом подсчете спермиев, а на учете степени оптической плотности спермы, т.е. мутности. Этот метод позволяет быстро (2--3 мин) определить концентрацию спермиев в сперме, но так как фотоэлектроколориметр создан для анализа истинных растворов, а сперма является взвесью и в ней содержится большее или меньшее количество эпителиальных и других клеток, то результат нередко может быть неточным.

Для получения более точных результатов М. П. Рязанский разработал прямой метод подсчета числа спермиев в сперме (за 37--40 с) на скоростном автоматическом счетчике клеток -- целлоскопе. С этой целью можно использовать и венгерский прибор «Пикоскель».

Патологические формы спермиев. Микроскопическое исследование эякулята показывает, что среди нормальных спермиев всегда находится более или менее значительное количество патологических форм. Чаще аномалии выявляются в хвостовой части спермиев, основании головки и шейки. С возрастом к моменту физиологической зрелости производителя количество аномальных спермиев уменьшается. Могут встречаться самые различные патологические формы спермиев: гигантского размера или карликовые, спермин с двумя-тремя головками, но общим хвостиком, с двумя хвостиками, с укороченным хвостиком, его деформацией или отсутствием, с протоплазматической капелькой, слишком большой или маленькой головкой, и другие формы. Иногда встречаются спермии, лишенные головки, но способные двигаться.

Л. А. Черномаз отмечает как признак патологических спермиев либо выраженный перфораторий или его отсутствие. Нарушение структуры перфоратория и оболочки спермия является признаком начальных изменений спермиев при их хранении.

Большое количество патологических спермиев свидетельствует о нарушении спермиогенеза, о вредном влиянии патологически измененных секретов придаточных половых желез и мочевых путей или, наконец, указывает на нарушение правил получения спермы и ее хранения во внешней среде от выделения до исследования. В качестве конкретных причин образования уродливых форм спермиев отмечают: 1) слабо развитые семенники; 2) поражения семенника и придатка (гигантские и карликовые спермин); 3) длительные промежутки между коитусами, обусловливающие старение и распад спермиев в придатке (отдельные головки, изолированные хвостики); 4) половое истощение производителя вследствие большой половой нагрузки или недостаточного кормления (спермин с протоплазматическими капельками в области шейки, тела и хвоста -- незрелые спермии). Чем ближе к головке расположена капелька, тем моложе спермий.

Большое значение в образовании патологических форм спермиев придается нарушению терморегулирующей функции мошонки.

Закручивание хвостов спермиев в сторону происходит при смешивании спермы с гипотоническим раствором (неправильная подготовка разбавителей, попадание воды).

Если в сперме жеребца содержится до 150--300 патологических спермиев на 1000, она считается нормальной. Быки, дающие сперму с содержанием более 18%, а бараны более 14% уродливых спермиев, должны рассматриваться как бесплодные.

Значительное количество патологических спермиев следует, безусловно, расценивать как признак наступающей импотенции. Более подробными данными о закономерностях связи различных типов патологических спермиев с характером патологического процесса и его локализацией в половом аппарате производителя мы пока еще не располагаем.

Резистентность спермиев -- их устойчивость к 1 % -ному раствору хлористого натрия. Показателем резистентное™ спермиев служит то количество миллилитров 1%-ного раствора хлористого натрия, которое после смешивания с 0,02 мл спермы прекращает поступательное движение спермиев (колебательное движение может оставаться). Производственный опыт показал, что резистентность не является объективным показателем ценности, т. е. активности спермы.

Оценка спермы по редукции метиленовой синьки (метод Н. П. Шергина). Метод основан на учете интенсивности потребления спермиями кислорода, растворенного в сперме. Об интенсивности дыхания спермиев можно судить по степени обесцвечивания раствора метиленовой синьки, добавленного к сперме. Чем интенсивнее дыхание спермиев, тем быстрее обесцвечивается этот раствор. Если у быка время обесцвечивания спермы превышает 30 мин, а у барана -- 12 мин, она считается непригодной для осеменения. Выживаемость спермиев -- продолжительность их жизни вне организма. Определение выживаемости спермиев может служить косвенным признаком их оплодотворяющей способности. При определении выживаемости спермиев в разбавленной или неразбавленной сперме необходимо строго придерживаться инструкции.

В результате исследования могут быть установлены следующие недостатки:

1) асперматизм-- (Азм) --отсутствие спермы;

2) олигосперматизм (Озм) -- малый объем эякулята;

3) аспермия (А) --отсутствие в сперме спермиев;

4) олигоспермия (О) -- недостаточное число спермиев в эякуляте;

5) некроспермия (Н) -- мертвые спермин;

6) тератоспермия (Т) -- патологические спермин и др.

Производителя можно использовать для естественного или искусственного осеменения, если его сперма отвечает требованиям действующей инструкции по осеменению животных.

Биологическая проба спермы. Решающее значение для оценки спермы имеет определение ее оплодотворяющей способности. Установлено, что оплодотворяющая способность может быть определена только в отношении определенной группы самок, находящихся при конкретных условиях существования и времени осеменения. Оплодотворение зависит от степени родства самки и производителя, от состояния их здоровья, упитанности, качества кормления и др. Поэтому для определения оплодотворяющей способности спермы лучше всего использовать здоровых ремонтных телок. Сперма считается нормальной, если оплодотворяемость от первого осеменения составляет не менее 70%, с пониженной оплодотворяющей способностью спермы дают маложизненное потомство, и их нельзя использовать ни при искусственном, ни при естественном осеменении.

Правильно поставленная биологическая проба спермы на здоровых животных -- самый надежный критерий ее оценки. Все другие методы определения оплодотворяющей способности спермы являются только косвенными, т.е. они позволяют лишь условно судить об оплодотворяющей способности спермы.

Наблюдения показали, что даже всестороннее лабораторное исследование спермы иногда не отражает ее качеств. От некоторых жеребцов с прекрасными лабораторными показателями спермы оплодотворяемость кобыл оказывалась низкой, если интервалы между садками были больше 48 ч. Осеменение кобыл через 24--36 ч этими производителями давало резкое повышение плодовитости. Этот факт X. И. Животков объясняет неодинаковой выживаемостью спермиев отдельных производителей в половом аппарате матки и предлагает применять у ценных производителей «биологическую пробу», заключающуюся в осеменении кобыл через различные промежутки времени.

На основании учета итогов этих осеменений устанавливают индивидуальную половую нагрузку.

4. Современные подходы к сохранению, разбавлению и транспортировки спермы

При правильном применении разбавителей спермы создаются следующие преимущества:

1) получается больший объем спермы, что имеет важное практическое значение для интенсивного использования ценных производителей;

2) в сперме, смешанной с некоторыми разбавителями, спермии переходят из активного в анабиотическое состояние;

3) удлиняется срок переживаемости спермиев вне организма вследствие замены секретов придаточных половых желез искусственной средой и ослабления концентрации в сперме токсических веществ, бактериостатического действия добавляемых в разбавитель антисептиков и других веществ.

Впервые для разбавления спермы И. И. Иванов использовал физиологический раствор хлорида натрия. Однако обычный 0,9%-ный физиологический раствор оказался малопригодным для разбавления спермы, так как его вязкость меньше вязкости спермы, поэтому спермии в ней быстро оседают: рН физиологического раствора колеблется в пределах 5,6--6,2 и даже ниже, так как дистиллированная вода поглощает из воздуха углекислоту. Затем предложили готовить физиологический раствор с учетом видовых особенностей спермы; применялся подщелоченный сахаро-физиологический раствор хлорида натрия. Были предложены: ГФО -- глюкозо-фосфатный разбавитель для овец; ГСЛ -- глюкозо-сульфатный разбавитель для лошадей; ГТС -- глюкозо-тартатный разбавитель для свиней; ГТКр -- глюкозо-тартатный разбавитель для кроликов; ГТСо -- глюкозотартатный разбавитель для собак, желатинированный и другие разбавители.

К. Н. Кожишковский и Г. Н. Павлов (1927) установили важность включения в разбавитель лецитина и желтка куриного яйца для переживания спермиев. На основе этого с первой половины XX столетия широкое распространение получили глюкозо-цитратно-желточные разбавители.

В настоящее время для краткосрочного хранения спермы применяют следующие реактивы.

Все компоненты для приготовления разбавителей должны быть химически чистыми, проверенными на токсичность и соответствовать ГОСТу, указанному в инструкции по искусственному осеменению. Компоненты хранят в сухом темном месте в плотно закрытых банках. Биологический контроль является обязательным для новой серии каждого препарата, особенно антибиотиков, добавляемых в разбавитель, так как некоторые из них могут оказаться губительными для спермиев. Для приготовления разбавителей необходимо применять только дистиллированную воду. В ней нет хлористых соединений, разрушающих оболочку спермиев.

Глюкоза, фруктоза, лактоза, сахароза или гликокол (аминоуксусная кислота) снижают электропроводность раствора, предупреждая агглютинацию спермиев, связанную с потерей ими электрических зарядов. Глюкозу и фруктозу спермин могут использовать как источник энергии.

В сперме быка и барана при хранении начинают образовываться молочная кислота и другие продукты обмена. Для их нейтрализации, задержки набухания коллоидов цитоплазмы, оболочки спермиев, уменьшения их проницаемости вводят в состав разбавителей лимоннокислый натрий (цитрат), являющийся естественным буфером спермы (его рН 7,8--8,0). Поскольку в сыворотке спермы жеребца и хряка содержится много солей, то в разбавитель для спермы таких животных лимоннокислый натрий не вводят или добавляют в очень незначительном количестве.

Одним из первых факторов внешней среды, действующих на сперму, является температура. При ее понижении (особенно ниже плюс 18°) спермин подвергаются температурному шоку и гибнут. Для ослабления шока в разбавитель вводят желток куриного яйца, содержащий около 7% неокисленного лецитина. Он одновременно является питательным веществом, предохраняющим расходование липидов цитоплазмы спермиев. Яйца должны быть обязательно свежими, с ярко окрашенным желтком, от здоровых кур, получающих полноценные корма и достаточное движение. В хорошем яйце содержится полный набор незаменимых аминокислот, углеводы, жироподобные вещества, пигменты, микроэлементы, витамины. Такое яйцо по наличию в нем жизненно необходимых веществ можно сравнить только с молозивом. Яйца с загрязненной скорлупой негодны. На поверхности скорлупы выявляли до 13 видов микробов и 7 видов плесневых гриб:? Поэтому использование яиц в искусственном осеменении должно осуществляться с соблюдением правил асептики. Если сперму предусмотрено хранить в замороженном состоянии, то в разбавитель добавляют глицерин.

В разбавитель добавляют пенициллин, стрептомицин и белый стрептоцид или смесь из перечисленных препаратов, выпускаемым под названием «спермосан-3», в дозах, рекомендуемых «Ветеринарными правилами при воспроизводстве сельскохозяйственных животных» (1971 г). Опыты показали, что добавление к разбавителю стрептоцида положительно отражается на жизнеспособности спермиев, но также приостанавливает роста микробов. Пенициллин задерживает рост микробов, но не повышает оплодотворяемости. Стрептомицин, угнетая рост микробов, в больших дозах отрицательно влияет на спермиев.

Ни антибиотики, ни сульфаниламидные препараты не прекращают размножения микроорганизмов, обусловливающих глубокие морфологические изменения спермиев.

Подготовленный разбавитель подогревают на водяной бане до 35°. При более высокой температуре желток в разбавителе свернуться. При низкой температуре спермин погибнут от температурного шока, так как не успеют проявиться защитные свойства, наступающие через несколько минут после разбавления. Поэтому сперма и разбавитель должны иметь одинаковую температуру. Перед разбавлением необходимо оценить качество спермы и разбавителя.

Для оценки разбавителя на чистое предметное стекло помещают каплю проверенной на активность спермы и к ней добавляет 2--3 капли разбавителя, пробу накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. Понижение активности спермиев - свидетельство непригодности, а отсутствие заметных изменений в сперме служит основанием для использования разбавителя. Перед разбавлением эякулята нужно знать активность и концентрацию спермиев. Эти показатели должны удовлетворять требованиям инструкции, поскольку они являются основой для определения степени разбавления. Степень разбавления зависит также от необходимого количества доз и других условий. Эякулят разбавляют, добавляя по частям необходимое количество разбавителя и тщательно перемешивая жидкость. Обычно сперму быка разбавляют в 10 (1:9) -- 15(1 :14) раз. В Италии и Англии разбавляют сперму 1 :20:50, в Германской Демократической Республике -- 1: 25. Некоторые специалисты рекомендуют разбавлять сперму быка 1: 100 и даже 1:200. Такое различие в степени разбавления объясняется разным подходом к определению количества спермиев, необходимого для оплодотворения. Одни авторы считают, что в дозе для осеменения одной коровы должно быть минимум 10--15 млн. спермиев, другие -- 50--100 млн.

Хорошим разбавителем для спермы быка, жеребца, хряка и других производителей является свежее молоко. Как показали исследования Н. Н. Михайлова, молочный разбавитель обладает большой буферностью, понижает степень раздражения спермиев, увеличивает вязкость разбавленной спермы и имеет концентрацию водородных ионов (рН), сходную с маточной слизью. Молоко является самой биологически полноценной средой для спермиев, а потому сперму ею можно разбавлять без опасения. Молочный разбавитель повышает переживаемость спермы, ее оплодотворяющую способность, которая при температуре 0° сохраняется до семи суток. Поэтому оплодотворяемость коров, кобыл при применении молочного разбавителя выше, чем при употреблении желточно-цитратных разбавителей. В качестве разбавителя можно применять и сухое молоко в количестве 10 г на 100 мл дистиллированной воды. (Г. В. Зверева). Разбавитель из сухого молока широко применяется в Англии.

Из многочисленных сред для разбавления и хранения спермы хряков при температуре 16--20° в настоящее время используют глюкозо-хелато-цитратную (Н. Т. Плишко) и глюкозо-хелато-цитратно-сульфатную. Одним из основных компонентов этих сред является хелатон (двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты -- CioHi₄OsNa₂N2). Н. Т. Плишко установил, что хелатон, снижая обменные процессы в сперме, увеличивает срок переживаемости спермиев и предохраняет их акросому и оболочку от разрушения. Он тормозит размножение микробов, а на некоторые из них оказывает бактериолитическое действие. Наибольшая переживаемость спермиев хряка отмечается при разбавлении спермы 1 :3. Уменьшение и увеличение степени разбавления снижает переживаемость спермиев (Н. Г. Балашов, М. В. Силаева).

При осеменении свиней фракционным методом А. В. Квасницкий предложил ряд разбавителей, назначение которых--заполнить полости рогов матки, поэтому их называют заполнителями: 1) глюкозо-солевой (30 г глюкозы и 4,5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды); 2) солевой (9 г NaCJ на 1 л дистиллированной воды); 3) молочный (свежий обрат коровьего молока).

Эти заполнители оказывают на слизистую оболочку матки более благоприятное действие, чем желточно-цитратные и другие разбавители.

В Болгарии (Братанов, Иосифов, Стоянов) предложили медовый разбавитель для спермы жеребца, быка и барана. Авторы установили, что 7%-ный водный раствор меда очень благоприятно действует на спермиев. Добавление в разбавители для спермы быка и барана фосфатов и сульфатов улучшает их качество. Авторы не рекомендуют пользоваться медом с горьким вкусом.

В последние годы появились сообщения о применении самых разнообразных разбавителей, которые проходят производственную проверку. Во всех случаях приготовления и использования разбавителей спермы необходимо строго руководствоваться действующей инструкцией по искусственному осеменению соответствующего вида животных, утвержденной МСХ. Хранение спермы. При хранении неразбавленной и разбавленной спермы вне организма происходят изменения плазмы и нарушение акросомного аппарата спермиев. Поэтому чем дольше удастся сохранить жизнеспособность спермиев вне организма животного, тем шире можно применять метод искусственного осеменения, так как запасы спермы позволяют без задержки осеменять маток в любое время года, а главное, дают возможность перевозить сперму на различные расстояния и осеменять маток в хозяйствах, расположенных на десятки и даже тысячи километров от станции искусственного осеменения.

Изучение физиологических свойств спермиев показало, что сохранение спермы вне организма животного и эффективное использование ее возможно при соблюдении следующих двух условий.

1. Сперма может сохраняться при неактивном состоянии спермиев. Чем меньше активность спермиев, тем более длительно можно xранить сперму. Уменьшать активность спермиев удается: а) понижением температуры; б) созданием условий, угнетающих обмен вещее» спермиев (кислая среда, добавление хелатона); в) разведением секретов придаточных половых желез растворами, не возбуждающими спермиев и не разрушающими их липопротеидного покрова.

2. Предотвращение интоксикации спермиев бактериотоксинами и бактериолизинами. Для этого необходимо получать сперму чистой и смешивать ее с разбавителями.

При выборе способов хранения спермы необходимо учитывать видовые особенности. Сперма животных с влагалищным типом естественного осеменения (бык и баран) более устойчива во внешней по сравнению со спермой животных с маточным типом осеменения (жеребец и хряк).

Каким бы методом ни хранилась сперма, одним из основных условий является перевод спермиев в анабиотическое состояние, что в организме жизнеспособность спермиев может сохраняться надолго; следовательно, при создании соответствующих условий сперму можно хранить и вне организма при плюсовой температуре, решение этой задачи уже намечается. Лабораторные исследования показали, что надежным регулятором скорости обмена сперме является температура. С ней связаны многие методы хранения спермы.

Кратковременное хранение спермы при температуре (2--4°) является распространенным методом хранения барана и жеребца. Температура, близкая к 0°, значит переживаемость спермиев и замедляет обменные процессы: гемолиз спермиев быка и барана тормозятся в 20--25 раз посравнению с интенсивностью этих процессов при температуре тела животных.

Для охлаждения спермы используют холодильник, холодильные или термосы различной конструкции, в которых температура сохраняется около 2--4°. Применение желточных разбавителей значительно повышает устойчивость спермиев к температурному шоку. Поэтому сперму необходимо охлаждать медленно и постепенно. После разбавления ее выдерживают при комнатной температуре (18--20°) 20--30 мин. Затем ампулы, флаконы, пробирки со спермой обвертывают небольшим слоем ваты, помещают в полиэтиленовые мешочки и кладут в холодильник или термостат со льдом. Через 30 мин мешочки со спермой укладывают так, чтобы сверху были закрыты кусочками льда, что обеспечивает необходимую температуру (2--4°). При такой методике хранения сперму быка используют для осеменения коров максимум трое суток с активностью не ниже 7 баллов, хотя ее жизнеспособность сохраняется более длительное время.

Через 24 ч хранения разбавленной спермы быка перфораторий спермия несколько увеличивается, становится более контрастным, а через 72 ч он набухает и начинает распадаться (Г. В. Зверева и Л. А. Черномаз). Следовательно, качество спермы и оплодотворяющая способность с каждым днем хранения снижаются. В Англии разбавленную и сохраненную сперму быка при температуре 2--3° используют только в течение двух суток. При этом 75% спермы расходуют в первый день после ее получения. Разбавленную сперму барана используют для осеменения овец 24 ч с активностью не ниже 8 баллов. Исследования А. И. Лопыгина и В. К. Рабочева показали, что свежеполученная сперма барана сохраняет оплодотворяющую способность в половых органах овцы в течение 27--30 ч. Этот показатель при хранении спермы при нулевой температуре в течение одних суток снижается на 20%, а через двое -- почти на 30%.

Сперму жеребца используют для осеменения кобыл после сохранения ее не более двух суток с активностью не ниже 5 баллов.

При хранении спермы любым способом всегда следует учитывать одинаковую способность спермиев реагировать на охлаждение. Такое свойство спермиев отмечается не только у разных производителей, но и у разных эякулятов одного и того же производителя. У некоторых быков и хряков сперма при 0° сохраняется плохо, а при температуре 4--5° получаются удовлетворительные результаты (И. В. Смирнов, В. И. Поставная). В производственных условиях для хранения :пермы при температуре 2--4° пользуются термосами, сконструированными специально для искусственного осеменения. При отсутствии специального термоса, если возникает необходимость перевезти несколько порций спермы в карантинированное хозяйство, можно пользоваться сосудом со снегом. При хранении спермы решающее значение имеет конструкция термоса, а постоянство температуры спермы и ограждение ее как от перегревания, так и от переохлаждения и особенно от резких колебаний температуры.

В обычном пищевом термосе емкостью 1 л при наличии в нем не менее 200 г льда температура поддерживается в пределах 0--1°. При хранении на морозе ниже --5° на термос следует надеть войлочный ватный чехол. Если температура ниже --20°, термос заполняют холодной водой (5--8°). Крышку и горловину термоса смазывают вазелином или маслом, чтобы они не смерзались. В термосах, заполненных водой, при сильных морозах сперма может храниться в течение 2--3 суток (до замерзания ²/₃ воды), Долговременное хранение спермы. В процессе хранения сперма при 2--4° в ней протекают обменные процессы, отрицательно влияющие на оплодотворяющую способность спермиев. Длительное хранение половых клеток возможно только в условиях полного анабиоза, когда сильно замедляются все биохимические процессы.

Научно обоснованную теорию анабиоза при замораживании животных сформулировал известный русский ученый П. И. Бахметьев (1902). Изучение животных и растительных организмов показало, что одной из причин анабиотического состояния является потеря воды протоплазмой клеток в результате снижения. Сложное явление анабиоза явилось основой к проведению исследований по хранению спермы при низких температурах. Первые опыты по замораживанию спермы жеребца при температуре --15° были проведены И. И. Ивановым (1907). Затея в исследованиях его сотрудников К. Н. Кожишковского и Г. Н. Павлова была изучана способность спермиев млекопитающих и человека переносить охлаждение в течение длительного времени при температуре --23°. Позднее Янель (1938) докалал, что спермии человека обладают исключительно высокой устойчивостью к охлаждению в жидком азоте (--196°) и даже в жидком гелии (--269°).

В 1948 г. И. В. Смирнов впервые осуществил замораживание спермы жеребцов, кроликов, быков и баранов в пакетах из алюминиевой фольги на поверхности твердой двуокиси углерода (--79°) и в жидкого кислорода (--183°). Однако большая часть спермиев погибала, и после оттаивания лишь 5--30% спермиев сохраняли поступательное движение. Применяя многократное осеменение на протяжении стадии возбуждения полового цикла, И. В. Смирнов в 1950-- 1951 гг. получил первых ягнят и телят.

В дальнейшем английские ученые Полдж и Раусон (1952), используя защитное действие глицерина при охлаждении спермиев, разработали пригодный для производства метод длительного хранения спермы быка в жидком азоте (--196°). В настоящее время этот метод хранения спермы быка широко применяется у нас и за рубежом. Хранение спермы в жидком азоте позволяет значительно увеличить породные качества разводимого скота, так как в тысячи раз увеличивается количество осеменяемых самок спермой ценных производи. Осеменение коров такой спермой возможно на протяжении ряда лет. У спермы быка, хранящейся в жидком азоте, оплодотворяющая способность остается удовлетворительной на протяжении 25 лет. Метод долговременного хранения спермы значительно увеличивает возможность организации международного обмена спермой выдающихся быков. Для хранения спермы таких быков внутри страны и ее экспорта за многие годы во многих странах организованы специальные «банки мы».

Для длительного хранения спермы в жидком азоте и для ее возки необходимо иметь специальное холодильное оборудование: холодильные камеры, азотные термосы, вакуумные контейнера, транспортные резервуары. Более распространенными для хранения спермы являются сосуды Дьюара.

Для замораживания пригодна сперма быка с активностью спермиев не ниже 8 баллов и концентрацией их не менее 0,8 млрд. в 1 мл. Замораживание спермы можно осуществлять быстрыми и ступенчатыми методами.

В последнее время у нас и за рубежом чаще замораживают сперму быков в гранулах, особенно мелких (ОД--0,3 мл), так как эта расфасовка обеспечивает более эффективное использование сосудов Дьюара для хранения спермы, несколько лучшую выживаемость и оплодотворяющую способность спермиев. После оценки сперму разбавляют средой № 1 (11%-ный раствор лактозы 63 мл, желтка 30 мл, глицерина 7 мл) 1 : 1, затем средой № 2 (11%-ный раствор лактозы 81,5 мл, желтка 15 мл, глицерина 3,5 мл) доводят степень разбавления до нужного показателя. Для замораживания спермы гранулами по 0,5--1 мл используют среду: вода дистиллированная 100 мл, лактоза 11,5 г, желток куриного яйца 20 мл, глицерин 5 мл.

После разбавления сперму охлаждают при 2--5° в течение 4--7 ч. Затем берут фторопластовую пластину, на которой с двух сторон имеется по 300--324 лунки для накалывания спермы, обеззараживают ее с помощью бактерицидных ламп, опускают в широкогорлый сосуд с жидким азотом и охлаждают до тех пор, пока прекратится кипение азота. Охлажденную пластину приподнимают над поверхностью жидкого азота и при помощи шприца наносят разбавленную сперму объемом по 0,1 мл в каждую лунку. Спустя 2--3 мин после нанесения спермиев последнюю лунку, пластину погружают в жидкий азот на 1-- 3 мин. После этого, вынув пластину, замороженные гранулы собирают пластмассовые коробочки с небольшими отверстиями и хранят их в жидком азоте. При таком способе замораживания температура внутри гранул спермы понижается более равномерно, что обусловливает лучшее сохранение и высокую активность спермиев в оттаянной сперме. Главным недостатком замораживания спермы в гранулах является их незащищенность. В Польше гранулы покрывают желатиновыми капсулами. Под руководством Ф. И. Осташина разработана Харьковская технология замораживания спермы в обдивованных (покрытых тонкой полимерной пленкой) гранулах.

Во Франции предпочитают быстро замораживать сперму в пайеты, которые одновременно служат инструментам для «вменения коров. Этот способ начали использовать и в нашей стране. Хороший результат дает технология замораживания спермы в соломинках по 0,25--0,4 мл (И. Хабибуллин). Важный фактор-- сезон года. В жаркие летние месяцы оплодотворяемость ко-от замороженной спермы, как правило, низкая. Наиболее благоприятное время для заготовки замороженной спермы -- весна и осень. Сперма некоторых быков плохо замораживается.

Разработана методика замораживания спермы жеребцов в алюминиевых пакетах (Е. М. Платов и др.), которую начинают использовать в практике. Каким бы способом ни производили замораживание спермы с применением жидкого азота необходимо всегда строго соблюдать правила техники безопасности.

Транспортировка спермы. В настоящее время осеменение спермой -- наиболее распространенная форма искусственного осеменения. В принципе безразлично, на какое расстояние перевозится сперма, важно, чтобы осеменение ею давало оплодотворяемость чем при естественном осеменении или при искусственном осеменении свежеполученной спермой. При транспортировке спермы необходимо соблюдать условия, чтобы сохранить ее жизнеспособность от момента получения до осеменения. Сперму обычно перевозят в термосах, в которых она хранится. При этом необходимо исключить возможность повреждений емкостей со спермой и термосов. Сперму, помещенную для кратковременного хранения, необходимо предохранять от колебаний температуры. Замороженную сперму перевозят в сосудах Дьюара, в которых хранят. При транспортировке таких сосудов с жидким азотом наземными видами транспорта их необходимо тщательно закреплять, так как падение сосуда может сопровождаться взрывом. При перевозке сосудов Дьюара на самолете их заполняют азотом только наполовину гидравлической емкости.

К каждой партии отправляемой спермы прикладывают ордер, с котором указывают дату и часы получения спермы, кличку производителя, дозу и оценку спермы.

Транспортировка спермы должна проводиться с соблюдением ветеринарных правил действующей инструкции по искусственному осеменению животных данного вида.

Оценка спермы на пунктах искусственного осеменения. На пунктах искусственного осеменения оценивают только активность движение спермиев. Для проверки качества спермы, сохраняемой при температуре 2--4°С, открывают термос, берут из флакона каплю спермы, кладут на предметное стекло и исследуют под микроскопом подвижность спермиев. Пробу надо брать быстро, чтобы не допускать нагревание спермы.

Исследуют сперму при температуре 40--41°, для этого используют обогревательные столики различных конструкций (В. А. Морозова и др.) или термостаты. Нельзя подогревать предметное стекло на пламени спиртовки или другими методами без контроля температуры. При активности спермиев быка ниже 7, барана 8, жеребца 5 и хряка 6 баллов сперму не используют для осеменения.

...