Биоконверсия ксантофиллов у птицы при скармливании биологически активной добавки на основе растительного сырья

Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Биоконверсия ксантофиллов у птицы при скармливании биологически активной добавки на основе растительного сырья

03.01.04 - биохимия

Вострикова Светлана Михайловна

Белгород - 2011

Работа выполнена в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Шапошников Андрей Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Бусловская Людмила Константиновна

кандидат биологических наук, доцент Яковлева Инесса Николаевна

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук»

Защита состоится «16» июня 2011 года в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.015.12 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85, e-mail: D212.015.12@bsu.edu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Автореферат разослан «___» _____________ 2011 г. и размещён на сайте http://www.bsu.edu.ru

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Н.Г. Габрук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Промышленное птицеводство ? одна из интенсивных и динамичных отраслей сельского хозяйства. Развитие этой отрасли обусловлено высокой рентабельностью, ценными питательными и диетическими свойствами получаемой продукции. В питании человека большое значение имеют куриные яйца (а в последнее время и перепелиные яйца), являющиеся прекрасными источниками белков, липидов и других питательных веществ.

Наиболее важную роль для ведения интенсивного птицеводства в условиях промышленной технологии содержания птицы играет её полноценное, сбалансированное по питательным, минеральным и биологически активным веществам кормление (В.И. Георгиевский, 1970; В.И. Фисинин, 1998; В.С. Романов, 1999; И. Егоров, 2003; Т.С. Кузнецова, 2004; Т.Н. Хамидуллин, 2005; Е.Н. Андрианова, 2007).

Так как в мире постоянно растёт спрос на продукты птицеводства, целенаправленно обогащённые важными для человека соединениями, то основной тенденцией совершенствования технологии кормления и ветеринарно-профилактических мероприятий современного птицеводства является разработка и внедрение в производство функциональных кормовых добавок, для получения функциональных продуктов питания, которые благодаря повышенному накоплению физиологически активных пищевых ингредиентов при систематическом употреблении снижают риск развития заболеваний (ГОСТ 52349-2005) и поэтому могут быть рекомендованы в профилактических целях. Это относительно новое направление в животноводстве получило название - пищевой дизайн (food design), который ставит главной целью производство продуктов питания с заданными свойствами путём целенаправленного изменения рациона кормления животных (В. Фисинин, 2007; В.И. Фисинин, А.Л. Штеле, 2008; Я.О. Хорбаньчук и др. 2009).

В такие функциональные кормовые добавки вводят йод, селен, полиненасыщенные жирные кислоты, витамины и натуральные каротиноиды. Обогащая ими комбикорма для птицы можно получать яйца с прогнозированным химическим составом и новыми функциональными свойствами (А. Османян и др., 2003; М. Сурухи, 2004; А. Штеле и др., 2004; А.Г. Кощаев, 2008; В.И. Фисинин, А.Л. Штеле, 2008а).

Основные компоненты каротиноидного комплекса желтка - ксантофиллы: лютеин и зеаксантин, источником которых могут быть вегетативная масса растений или зерно кукурузы, добавляемые в кормовые смеси.

Особенно важно, что эти же ксантофиллы в соотношении примерно 4:1 входят в состав жёлтого пятна (macula lutea) сетчатки глаза человека (G.J. Handelman et al., 1999; W. Schalch, 2000).

Поэтому актуально создавать такие добавки, которые бы обеспечивали необходимое соотношение между индивидуальными каротиноидами и учитывали физиологические особенности человека. В частности, для решения проблем связанных с дистрофией макулы необходимо создание таких добавок, которые бы обеспечивали накопление лютеина и зеаксантина в продуктах питания в соотношении 4:1, поскольку совместное действие этих двух пигментов при именно таком соотношении наиболее эффективно.

Кроме того, доказано, что нехватка ксантофиллов приводит к ухудшению воспроизводительных функций птицы, снижению выводимости и сохранности цыплят (Ж.В. Карасёва, 1984; Т.М. Околелова, А.М. Сергеева, 1988). А поскольку каротиноиды не синтезируются в ее организме, то они должны поступать с кормом.

Поэтому научный и практический интерес представляет разработанная нами новая биологически активная добавка, содержащая ксантофиллы растительного происхождения и сбалансированная по соотношению лютеин : зеаксантин.

Для внедрения в практику любой новой добавки необходимо экспериментальное подтверждение её безопасности для организма и метаболической активности.

Решение комплекса перечисленных вопросов определяет актуальность выбранного направления исследований.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - исследование биоконверсии растительных ксантофиллов у кур-несушек, перепёлок и другой птицы при скармливании биологически активной добавки.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать биологически активную добавку, содержащую диэфиры лютеина и диэфиры зеаксантина в отношении 4:1, для получения функционального продукта питания;

2. Оценить биоконверсию различных доз ксантофиллов в организме кур-несушек и перепелок;

3. Изучить морфологические и биохимические показатели тканей и органов кур-несушек при скармливании различных доз биологически активной добавки;

4. Изучить влияние различных типов ксантофиллов на их накопление в желтках яиц перепелок;

5. Оценить сохранность разработанной биологически активной добавки.

Научная новизна работы. Впервые изучены биопревращения ксантофиллов у птицы при использовании разных доз биологически активной добавки на основе растительного сырья и влияние на морфологические и биохимические параметры тканей и органов и депонирование ксантофиллов в желтках яиц. Установлено влияние разных типов ксантофиллов на их накопление в желтках яиц перепелов. Экспериментально доказана возможность обогащения яиц каротиноидами до количеств, позволяющих обеспечить человеку половину суточной потребности человека в ксантофиллах с использованием кормовой биологически активной добавки на основе местного растительного сырья. Научная новизна исследований подтверждена патентом РФ №2328137 от 9 апреля 2007 г.

Практическая значимость работы. Получен функциональный продукт питания с увеличенной концентрацией ксантофиллов в желтках куриных и перепелиных яиц за счет введения в рацион разработанной биологически активной добавки, на основе местного растительного сырья.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Для изготовления биологически активной добавки с повышенным содержанием ксантофиллов в качестве источника диэфиров лютеина эффективно использование лепестков цветков бархатцев, диэфиров зеаксантина - чашечек физалиса;

2. Хранить и использовать биологически активную добавку можно в течение года без доступа солнечного света при температуре 20-22єС;

3. Скармливание курам биологически активной добавки, изготовленной на основе растительного сырья, повышает содержание ксантофиллов в крови и печени; комбикорм птица перепелка желток яйцо

4. Повышение концентрации растительных ксантофиллов в корме способствует накоплению каротиноидов в желтках яиц птицы. Использование добавки способствует накоплению лютеина и зеаксантина в желтках яиц в соотношении 4:1;

5. Тип ксантофиллов растительного сырья влияет на их накопление в желтках яиц перепёлок.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были представлены и получили положительную оценку на Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы химической науки, практики и образования» (Курск, 2009); на Всероссийской школе-семинаре «Современные наукоёмкие лечебные и фармацевтические технологии для офтальмологии» для молодых учёных (Белгород, 2009); на совместном заседании кафедры биохимии и фармакологии, кафедры биотехнологии, морфологии и физиологии живых систем БелГУ и кафедры физиологии и фармакологии БелГСХА (Белгород, 2009). За разработку кормовой биологически активной добавки в 2008 г. получена серебряная медаль VIII Московского Международного салона инноваций и инвестиций (приложение 4) и диплом XIII Московского Международного салона «Архимед-2009» (приложение 5).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 статей, в том числе 5 в изданиях перечня ВАК РФ, три тезиса докладов международных конференций, один патент на изобретение РФ № 2328137, 2007 г.

Структура и объём диссертации. Диссертация представляет собой рукопись компьютерного набора объемом 137 страниц и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практического предложения, списка литературы и приложений. Текст включает 16 таблиц и 24 рисунка. Всего использовано 343 источника литературы, в том числе 193 публикации зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для достижения цели и решения поставленных задач была разработана общая схема исследований (рис. 1), в соответствии с которой на курах-несушках и перепёлках-несушках в период с 2007 по 2009 гг. были выполнены два опыта.

Рис. 1. Общая схема исследований

Согласно схеме исследований было проведено два физиологических опыта. Первый - на курах-несушках, второй - на перепёлках-несушках.

Первый опыт был проведён в условиях вивария Белгородской государственной сельскохозяйственной академии.

В опыте выясняли влияние трёх доз разработанной БАД растительных ксантофиллов на общее состояние птицы, особенности метаболизма, физические качества яиц, накопление ксантофиллов и холестерола в желтках яиц.

Группы кур-несушек кросса «Hubbard F-15» в возрасте 295 суток были сформированы по принципу аналогов по живой массе, клиническому состоянию и уровню продуктивности.

Опыт длился с 27 июня по 9 августа 2007 года. Адаптационный период составил 12, а основной - 32 суток. Схема опыта представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Схема физиологического опыта на курах-несушках

Группа	Количество птиц	Схема кормления	Доза ксантофиллов, мг/гол*сут	Длительность периода, сут.
I-контрольная	10	ОР	-	32
II-опытная	10	ОР + добавка ксантофиллов	2.37	32
III-опытная	10	ОР + добавка ксантофиллов	7.11	32
IV-опытная	10	ОР + добавка ксантофиллов	14.22	32

БАД растительных ксантофиллов, разработанная на базе Белгородского государственного университета, содержит диэфиры лютеина, находящиеся в лепестках цветков бархатцев (Tagetes sp.), и диэфиры зеаксантина, находящиеся в пузыревидновздутых чашечках физалиса декоративного (P. alkekengi), в соотношении 4:1.

Бархатцы сортов Сиера оранжевый, Родос и Оранжевый снег (T. erecta L.) и физалис декоративный были выращены в Ботаничеком саду БелГУ и в ГУ ВИЛАР. Лепестки цветков бархатцев и чашечки физалиса были отделены от остальных частей растений и раздельно высушены без доступа прямого солнечного света до воздушно-сухого состояния. Затем они были измельчены (отдельно друг от друга) на мельнице типа МПР-31 со скоростью 6000 об/мин в течение минуты.

В измельчённом растительном материале спектрофотометрическим методом было определено суммарное содержание диэфиров лютеина и диэфиров зеаксантина.

В качестве растворителя использовали ацетон. На момент проведения опыта на курах-несушках содержание диэфиров лютеина в 1 г высушенных лепестков цветков бархатцев в 2007 г составило 16.77, а диэфиров зеаксантина в чашечках физалиса декоративного - 10.96 мг.

Поэтому для обеспечения соотношения ксантофиллов 4:1 смешали измельченные лепестки бархатцев в количестве 500 г с измельченными чашечками физалиса в количестве 191 г. Полученную добавку хранили в тёмном месте.

Основной рацион (ОР) был представлен стандартным комбикормом для кур-несушек ПК-1 сбалансированный по питательным и биологически активным веществам.

В течение адаптационного периода все птицы получали только ОР. Курам давали комбикорм дважды в сутки в общем количестве 140 граммов на птицу. Потребление воды не ограничивалось.

По завершении адаптационного периода определили содержание ксантофиллов в желтках яиц всех групп.

В основной период контрольная группа получала только ОР. Птицы со второй по четвёртую опытную группу наряду с ОР получали новую БАД растительных ксантофиллов в количестве 0.150, 0.450, 0.900 г на птицу в сутки соответственно (что соответствует 2.37, 7.11, 14.22 мг/гол*сут диэфиров ксантофиллов).

На протяжении всего периода опыта ежедневно наблюдали за общим состоянием птиц. Также определяли массу яиц путём индивидуального взвешивания с точностью до 1 г и индекс формы.

Визуально с помощь овоскопа определяли качество скорлупы, оценивая «мраморность»; упругую деформацию измеряли с помощью индикаторной головки часового типа - с точностью до 1 мкм (П.П. Царенко, 1988). Яйца кур на исследования физических качеств отбирали еженедельно в течение всего опыта.

По окончании первого физиологического опыта произвели убой птицы путём декапитации, отобрали образцы тканей и органов для лабораторных анализов.

С целью проверки возможности перехода лютеина в организме животных в зеаксантин был проведён второй физиологический опыт на 105 перепёлках-несушках породы фараон в возрасте 165 суток в условиях вивария в частном фермерском хозяйстве Белгородской области с. Нижний Ольшанец Шебекинского района.

Из перепёлок сформировали пять групп (I-контрольная, II-V - опытные) по 21 птице в каждой.

Опыт длился с 3 августа по 14 сентября 2009 года. Адаптационный период составил 14 суток, основной - 29 суток. Схема опыта представлена в таблице 2.

Таблица 2 - Схема физиологического опыта на перепёлках-несушках

Группа	Количествоптиц	Схема кормления	Доза ксантофиллов, мг/гол*сут	Длительностьпериода, сут.
I-контрольная	21	ОР	-	29
II-опытная	21	ОР + бархатцы	0.1	29
III-опытная	21	ОР + физалис	0.1	29
IV-опытная	21	ОР + подсолнечник	0.1	29
V-опытная	21	ОР + «ОРО ГЛО»	0.1	29

Для опыта были приготовлены индивидуализированные БАД:

- лепестки цветков бархатцев, содержавшие по спектрофотометрическим данным 12.5 ± 1.5 мг ксантофиллов на 1 г добавки (в пересчете на неэтерифицированный лютеин);

- чашечки физалиса, по спектрофотометрическим данным содержавшие 9.0 ± 0.3 мг ксантофиллов на 1 г добавки (в пересчете на неэтерифицированный зеаксантин);

- лепестки подсолнечника, по спектрофотометрическим и хроматографическим данным содержавшие 2.1 ± 0.3 мг эпоксиксантофиллов на 1 г добавки (в пересчете на лютеин);

- препарат «ОРО ГЛО», по спектрофотометрическим и хроматографическим данным содержавший 20 мг/г ксантофиллов (в основном неэтерифицированный полностью транс-лютеин).

Содержание ксантофиллов в добавках определяли спектрофотометрическим и хроматографическим методами.

Для приготовления индивидуализированных добавок были использованы лепестки цветков бархатцев, лепестки подсолнечника, чашечки физалиса декоративного собранные в 2009 году и высушенные при комнатной температуре в течение 7 дней без доступа света. Полученный материал измельчали в кофемолке (BOSCH MKM 6003).

В течение опыта все перепёлки в качестве ОР получали комбикорм, используемый в частном фермерском хозяйстве.

Контрольная группа получала только ОР, птицы со второй по пятую опытную группу - ОР с добавлением индивидуализированных БАД согласно схеме.

Все добавки вводили в количестве, обеспечивавшем поступление 0.1 мг/гол*сут ксантофиллов. Потребление воды не ограничивалось.

По завершении адаптационного периода определяли содержание ксантофиллов в желтках яиц всех опытных групп. Яйца на анализы в лабораторию отбирали еженедельно на протяжении всего опыта.

Гематологические и биохимические анализы тканей и органов кур-несушек (крови и печени) проведены в лаборатории биологических исследований БелГСХА.

В пробах крови кур-несушек определяли количество эритроцитов и лейкоцитов методом подсчёта в камере Горяева; концентрацию гемоглобина - гемоглобинцианидным методом; витамин А - спектрофотометрически; витамин Е - по модифицированному методу Биери; кальций - титриметрически по де Ваарду; фосфор - колориметрически по реакции с ванадат-молибденовым реактивом (Лабораторные исследования в ветеринарии, 1991).

В печени кур-несушек определяли витамины А и Е, каротиноиды - спектрофотометрически; кальций - трилонометрическим методом; фосфор - колориметрически по реакции с ванадат-молибденовым реактивом.

В желтках яиц кур и перепёлок определяли ксантофиллы и холестерол. Для определения суммарного содержания каротиноидов использовали спектрофотометрический метод (спектрофотометр КФК-3-01), а для определения соотношения лютеин : зеаксантин и количества холестерола - метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Полученный цифровой материал был обработан статистически (Г.Ф. Лакин, 1980). При определении достоверной разницы между контрольной и опытными группами был использован аргумент Стъюдента. Результаты рассматривали как достоверные, начиная со значения ?0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Содержание ксантофиллов и их сохранность в сырье

В качестве источника лютеина в БАД были выбраны лепестки цветков бархатцев, так как в них в основном накапливаются диэфиры лютеина (J.D. Rivas, 1989), которые усваиваются в организме птицы так же как и сам лютеин, - в организме происходит омыление эфиров. В качестве зеаксантин-содержащего компонента на основе местного сырья были выбраны пузыревидновздутые чашечки физалиса декоративного.

Из этих растительных материалов и была создана в Белгородском государственном университете первая отечественная БАД для птиц, содержащая диэфиры лютеина и диэфиры зеаксантина в соотношении 4:1. В этой добавке используются раздельно высушенные и измельчённые лепестки цветков бархатцев и чашечки физалиса декоративного. Разработанная добавка отличается от импортных сбалансированностью по содержанию ксантофиллов (в плане соотношения 4:1) и позволяет увеличивать накопление ксантофиллов в желтках яиц птицы.

Суммарное содержание ксантофиллов в растительном сырье определяли спектрофотометрическим методом. Спектры ацетоновых экстрактов лепестков цветков бархатцев и чашечек физалиса соответствовали литературным данным для лютеина и зеаксантина по положению максимумов абсорбции (D.B. Rodrigues-Amaya, 2001).

Качественное определение ксантофиллов проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. В лепестках бархатцев основными ксантофиллами являлись диэфиры полностью транс-лютеина, в чашечках физалиса декоративного - диэфиры зеаксантина и пальмитат в-криптоксантина.

Контроль состава готовой добавки может быть выполнен тем же методом, поскольку пики эфиров зеаксантина по времени удерживания не совпадают с пиками производных лютеина. Наши исследования показали, что уровень накопления ксантофиллов в цветках бархатцев одних и тех же сортов и чашечках физалиса декоративного зависит от многих факторов и может изменяться от года к году (табл. 3).

Таблица 3 - Содержание ксантофиллов в высушенном растительном сырье в разные годы, мг/г

Содержание ксантофиллов	2006	2007	2008	2009
Диэфиры лютеина (T. erecta)	22.13±0.56	20.77±0.81	17.81±0.80	12.37±0.98
Диэфиры зеаксантина (P. alkekengi)	15.02±0.12	14.91±0.12	13.89±0.36	12.91±0.55

На момент проведения опыта на курах-несушках содержание диэфиров лютеина в 1 г высушенных лепестков цветков бархатцев в 2007 г составило 16.77 мг, а диэфиров зеаксантина в чашечках физалиса - 10.96 мг.

При хранении высушенного и грубо измельченного растительного материала без доступа прямого солнечного света содержание ксантофиллов в течение первого года хранения монотонно уменьшалось в 1.47 раза (с 22.13 до 15.05 мг/г) для диэфиров лютеина, а для диэфиров зеаксантина - в 1.64 раза (с 15.02 до 9.16 мг/г). Это позволяет использовать БАД в течение длительного времени без особых условий хранения.

Высокая сохранность ксантофиллов в БАД объясняется тем, что при высушивании мембраны хромопластов становятся плотными и непроницаемыми для кислорода воздуха. При грубом измельчении растительного сырья степень разрушения этих оболочек невелика.

Собранное и высушенное растительное сырье лучше хранить либо не измельченным, а процесс измельчения производить непосредственно перед употреблением БАД либо грубо измельчённым.

2. Биохимические параметры тканей и органов кур-несушек при скармливании биологически активной добавки

Морфологические показатели и биохимический состав крови. БАД вызвала определённые изменения в гематологическом составе крови. Во второй опытной группе наблюдается увеличение количества эритроцитов на 28.14, в третьей - на 27.74, а в четвёртой - на 37.72 % (р<0.05) (табл. 4). Во всех группах этот параметр находился в пределах границ физиологической нормы.

Таблица 4 - Морфологические показатели крови

Группа	Эритроциты, 1·1012·л-1	Лейкоциты, 1·109·л-1	Гемоглобин, г·л-1
I-контрольная	2.51 ± 0.21	19.24 ± 2.24	87.65 ± 7.14
II-опытная	3.21 ± 0.51	23.67 ± 2.77	96.33 ± 4.17
III-опытная	3.20 ± 0.21	22.08 ± 0.48	100.44 ± 7.62
IV-опытная	3.45 ± 0.06*	24.25 ± 3.34	93.76 ± 5.37

* - р<0.05

Концентрация лейкоцитов во всех группах не превышала физиологическую норму (В.М. Митюшников, 1985; А.И. Голиков и др., 1991). Во второй, третьей и четвёртой опытных группах прослеживается тенденция увеличения количества лейкоцитов на 23.02, 14.76 и 26.04 % соответственно. Статистически достоверных изменений количества лейкоцитов у птиц опытных групп, в сравнении с контролем, выявлено не было. Это отражает отсутствие отрицательного влияния БАД на организм кур. Во второй, третьей и четвёртой опытных группах наблюдается увеличение концентрации гемоглобина в единице объема крови кур по сравнению с контролем на 9.90, 14.59 и 6.97 % соответственно.

Во всех опытных группах количество гемоглобина находится в пределах нормы (И.П. Кондрахин, 1985).

Полученные данные морфологического состава крови свидетельствуют об отсутствии негативного влиянии БАД на здоровье кур-несушек. Повышение в крови концентрации гемоглобина и тенденции увеличения количества форменных элементов крови говорит о повышении уровня гемопоэтических процессов и об отсутствии кардинальных вмешательств в механизм гомеостаза.

Результаты анализа крови на содержание кальция и фосфора представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Концентрация кальция и фосфора в сыворотке крови кур, г*л?№

Группа	Кальций	Фосфор
I-контрольная	0.194 ± 0.009	0.059 ± 0.001
II-опытная	0.237 ± 0.018**	0.063 ± 0.0003**
III-опытная	0.190 ± 0.012	0.068 ± 0.0008**
IV-опытная	0.209 ± 0.013*	0.072 ± 0.004*

* - р<0.05; ** - р<0.01

Исследования показали, что скармливание БАД не оказало отрицательного действия на содержание кальция и фосфора в крови. Следует отметить тенденцию к снижению концентрации кальция в третьей опытной группе на 2.26 %. Во второй и четвёртой опытных группах содержание кальция по сравнению с контролем повысилось на 22.07 (р<0.01) и на 7.36 % (р<0.05), а количество фосфора в сыворотке крови всех опытных групп превосходит контроль на 5.39 (р<0.01), 13.80 (р<0.01) и 20.87 % (р<0.05) соответственно. Результаты проведенных исследований показывают, что в опытных группах не происходит достоверного изменения в содержании витаминов А и Е (табл. 6).

Таблица 6 - Содержание витаминов и каротиноидов в сыворотке крови кур-несушек, мг*л^-1

Группа	Витамин А	Витамин Е	Каротиноиды
I-контрольная	1.55 ± 0.07	7.70 ± 4.88	0.51 ± 0.05
II-опытная	1.51 ± 0.13	13.63 ± 3.58	0.87 ± 0.11*
III-опытная	1.64 ± 0.16	13.40 ± 1.10	1.77 ± 0.22**
IV-опытная	1.28 ± 0.08	10.30 ± 0.81	1.28 ± 0.04***

* - р<0.05; ** - р<0.01; *** - р<0.001

Во всех опытных группах по сравнению с контролем происходит достоверное повышение содержания каротиноидов в сыворотке крови. Во второй опытной группе, получавшей 2.37 мг/гол*сут диэфиров ксантофиллов, содержание ксантофиллов в 1.71 раза (р<0.05) больше, чем в контроле. В третьей и четвёртой опытных группах, получавших соответственно 7.11 и 14.22 мг/гол*сут диэфиров ксантофиллов, содержание ксантофиллов больше контрольного в 3.47 (р<0.01) и в 2.51 раза (р<0.001).

Более высокое содержание каротиноидов в сыворотке крови кур третьей опытной группы, возможно, объясняется тем, что ксантофиллы, поступившие в кровь из корма, не успели транспортироваться в желток яйца. Перенос обычно происходит в течение 4-8 ч после скармливания рациона, обогащённого ксантофиллами (Т.М. Околелова, А.М. Сергеева, 1988).

Биохимические превращения в печени. Приведённые в таблице 7 данные говорят о том, что существует некоторая тенденция увеличения концентрации сухого вещества в печени третьей и четвёртой опытных групп. Концентрация сухого вещества в печени второй группы на 30.49 % (р<0.05) выше контроля. Содержание золы в печени не претерпевает достоверных изменений.

Таблица 7 - Концентрация сухого вещества и золы в печени кур-несушек, г^*кг^-1

Группа	Сухое вещество	Зола
I-контрольная	297.23 ± 13.81	12.87 ± 1.90
II-опытная	387.87 ± 17.94*	15.13 ± 3.14
III-опытная	315.47 ± 4.93	13.70 ± 1.17
IV-опытная	376.50 ± 28.00	12.60 ± 1.02

* - р<0.05

Полученные данные свидетельствует о том, что в печени под действием добавки не происходит накопления каких либо минеральных веществ.

Анализ печени на содержания кальция и фосфора (табл. 8) показал, что при введении различных доз добавки в рацион кур-несушек достоверных различий концентраций этих макроэлементов с контрольной группой нет.

Таблица 8 - Концентрация кальция и фосфора в печени кур-несушек, г^*кг^-1

Группа	Кальций, г*кг?№	Фосфор, г*кг?№
I-контрольная	0.38 ± 0.029	2.80 ± 0.410
II-опытная	0.49 ± 0.035	3.29 ± 0.808
III-опытная	0.39 ± 0.026	3.57 ± 0.215
IV-опытная	0.48 ± 0.028	3.23 ± 0.286

Содержание витамина А в печени кур опытных групп не имеет достоверных различий с контролем, кроме второй опытной группы, где витамина А меньше на 34.73 % (р<0.05) (табл. 9).

Концентрация витамина Е в печени опытных групп не имеет достоверных различий с контрольной группой.

Из таблицы 9 видно, что во второй опытной группе уровень каротиноидов в печени достоверно превышает контроль в 2.64 раза (р<0.001), а в третьей группе - в 3.46 раза (р<0.001), что соответствует 2.37 и 7.11 мг/гол*сут.

Таблица 9 - Концентрация витаминов и каротиноидов в печени, мг^*кг^-1

Группа	Витамин А	Витамин Е	Каротиноиды
I-контрольная	1167.00 ± 87.01	262.67 ± 27.76	1.91 ± 0.09
II-опытная	761.67 ± 53.72*	217.33 ± 6.84	5.04 ± 0.09***
III-опытная	1203.33 ± 114.81	278.33 ± 13.32	6.60 ± 0.42***
IV-опытная	984.67 ± 61.80	252.67 ± 12.99	13.51 ± 0.66***

* - р<0.05; *** - р<0.001

Наиболее высокий уровень каротиноидов, а именно 13.51 мг^*кг^-1, наблюдается в четвёртой опытной группе, получавшей максимальное количество ксантофиллов (14.22 мг/гол*сут). Здесь содержание каротиноидов достоверно выше контроля в 7.07 раза (р<0.001).

В целом можно сказать, что введение в рацион натуральных природных ксантофиллов в дозах: 2.37, 7.11, 14.22 мг/гол*сут не оказало отрицательного влияния на обеспеченность организма кур витаминами и оказало положительное влияние на обеспеченность каротиноидами.

3. Биоконверсия ксантофиллов у кур-несушек при скармливании биологически активной добавки

Накопление ксантофиллов в яичном желтке. Биохимический анализ яиц важен при исследовании эффективности использования добавок для обогащения яиц биологически активными веществами.

Данные по определению суммарного количества каротиноидов в желтках яиц (в пересчёте на лютеин) представлены в таблице 10.

Содержание каротиноидов во всех группах до скармливания БАД было примерно одинаково, достоверно не различалось.

При анализе полученных данных установлено, что через 15 суток кормления БАД в контрольной группе содержание ксантофиллов уменьшилось, по сравнению с исходным, в 1.44 раза, а к концу опыта (через 32 суток) - в 1.74 раза. Во всех же опытных группах содержание ксантофиллов, по сравнению с исходным, увеличивалось. Через 15 суток скармливания добавки количество ксантофиллов в желтке увеличилось в 1.43 (р<0.001), в 2.62 (р<0.001) и в 4.08 раза (р<0.001) для второй, третьей и четвёртой опытных групп соответственно.

Таблица 10 - Содержание ксантофиллов (в пересчёте на лютеин) в желтках яиц, мг/кг

Группа	до скармливания добавки	ч-з 15 суток скармливания добавки	в конце скармливания добавки (ч-з 32 суток)
I-контрольная	10.86 ± 2.08	7.52 ± 0.45	6.23 ± 0.82
II-опытная	10.99 ± 1.00	15.73 ± 0.77***	23.51 ± 2.33*
III-опытная	11.37 ± 0.86	29.83 ± 4.37***	39.48 ± 3.81**
IV-опытная	11.03 ± 1.22	45.01 ± 5.13***	103.77 ± 1.51***

* - р<0.05; ** - р<0.01; *** - р<0.001

В конце опыта (через 32 суток) исследование количества ксантофиллов показало увеличение в 2.14 (р<0.05), 3.47 (р<0.01) и в 9.41 раза (р<0.001) для второй, третьей и четвёртой опытных групп соответственно. Интенсивность окраски желтков яиц всех опытных групп возрастала с увеличением дозы ксантофиллов.

В конце опыта содержание каротиноидов превысило установленную для инкубационных яиц норму во всех опытных группах. Эти данные говорят о положительном влиянии БАД на накопление ксантофиллов в желтках куриных яиц. К тому же в желтках яиц всех опытных групп отношение лютеина к зеаксантину было близко к 4:1.

БАД в дозе 14.22 мг/гол*сут диэфиров ксантофиллов оказалась более эффективной по сравнению с другими дозами, позволяя добиться повышения содержания ксантофиллов в желтке в 9.4 раза по сравнению с исходным.

Разделение и количественное определение лютеина и зеаксантина осуществляли с использование нормально-фазовой ВЭЖХ.

Как следует из полученных данных с течением времени общее накопление ксантофиллов в желтках яиц возрастает. При этом использованная добавка обеспечивает необходимое соотношение между лютеином и зеаксантином, которое остаётся практически неизменным для всех опытных групп и попадает в интервал 3.6 ч 4.1 : 1 (рис. 2).

Рис. 2. Хроматограмма ксантофиллов желтков яиц кур-несушек в конце эксперимента

Это можно расценивать как примерно одинаковую бидоступность лютеина и зеаксантина из использованной БАД.

Динамика холестерола в желтках яиц. Экстракт желтка яиц, который использовался для определения каротиноидов, может быть использован и для определения холестерола на той же хроматографической обращенно-фазовой колонке, но с рефрактометрическим детектированием. Однако для достижения полноты экстракции холестерола соотношение желток : ацетон не должно превышать 0.1 г/мл.

Содержание холестерола в желтке достаточно велико - его пик на хроматограмме сопоставим по величине с пиками экстрагируемых вместе с ним триацилглицеролов, что исключает необходимость какой-либо дополнительной обработки пробы перед определением даже при использовании не отличающегося высокой чувствительностью рефрактометрического метода детектирования (рис. 3).

Рис. 3. Разделение компонентов экстракта желтка куриных яиц. А - ацетоновый экстракт желтка; Б - стандартный раствор холестерола. I - холестерол; II - триацилглицеролы

Результаты определения холестерола в желтках яиц кур-несушек представлены в таблице 11.

Таблица 11 - Концентрация холестерола в желтке куриных яиц, мг·г^-1

Группа	В начале опыта	В конце опыта
I-контрольная	13.8 ± 0.15	14.2 ± 0.52
II-опытная	14.5 ± 0.65	14.1 ± 0.21
III-опытная	13.9 ± 0.94	14.1 ± 0.34
IV-опытная	14.0 ± 0.82	14.4 ± 0.44

В эксперименте, выполненном для получения продукции, обогащенной ксантофиллами, при 2-х - 3-х кратном росте концентрации суммы лютеина и зеаксантина заметных различий по накоплению холестерола не было обнаружено (среднее содержание 14.1 мг·г^-1 желтка).

Морфологические и физические характеристики яиц. Важными характеристиками морфологического и физического состояния яиц являются: форма, масса, толщина скорлупы, отсутствие на ней кальциевых отложений или трещин и др.

Из таблицы 12 видно, что средняя масса яиц в начале опыта в третьей и четвёртой опытных группах достоверно меньше, чем в контрольной группе.

Таблица 12 - Масса яиц, г

Группа	В начале опыта	В конце опыта
I-контрольная	74.8 ± 1.5	71.0 ± 0.9*
II-опытная	74.5 ± 1.2	76.5 ± 0.8
III-опытная	69.6 ± 1.6*	69.3 ± 0.9
IV-опытная	64.1 ± 2.9**	74.7 ± 1.4**

* - р<0.05; ** - р<0.01

К концу опыта масса яиц в контрольной группе достоверно уменьшилась на 5.09 % (р<0.05), а в четвёртой опытной группе достоверно увеличилась на 16.50 % (р<0.01). Во второй и третьей группах масса яиц осталась на том же уровне, впрочем, полученные данные не являются статистически достоверными.

Было, также выявлено, что скармливание БАД не оказало отрицательного влияния на форму яиц, «мраморность» скорлупы и упругую деформацию.

4. Влияние структуры каротиноидов на их конверсию у перепёлок-несушек

Появление в печати сведений о том, что зеаксантин в организме животных и человека может быть получен изомеризацией лютеина (R.A. Bone et al., 2007), поставило под сомнение необходимость создания БАД, сбалансированной по отношению лютеин : зеаксантин (4:1). В ходе выполнения работы у нас возник ряд вопросов, связанных с накоплением других ксантофиллов в желтках яиц при введении их в рацион птицы.

Для того чтобы найти ответы на эти вопросы был проведён дополнительный опыт на перепёлках-несушках. Для проверки усвояемости ксантофиллов из растительных материалов нами были подготовлены индивидуализированные БАД, содержащие: диэфиры лютеина (бархатцы), диэфиры зеаксантина (физалис), эпоксиксантофиллы (подсолнечник) и неэтерифицированный лютеин («ОРО ГЛО»).

Количественное определение ксантофиллов в желтках яиц перепелок для оценки суммарного уровня накопления проводили в пересчете на лютеин. В целом накопление ксантофиллов, как и при кормлении кур (В.Л. Владимиров и др. 2005; Л.А. Дейнека и др., 2007), увеличивается при использовании добавок бархатцев, физалиса и «ОРО ГЛО» (рис. 4).

Рис. 4. Изменение накопления ксантофиллов в желтках перепелиных яиц при использовании индивидуализированных добавок

Полученные спектрофотометрические данные свидетельствуют о том, что в желтках перепелиных яиц в случаях с добавками бархатцев и «ОРО ГЛО» основной компонент - лютеин.

Поскольку при использовании добавки, содержащей эпоксиксантофиллы (подсолнечник), не обнаружено увеличения накопления ксантофиллов в желтке, то можно предположить, что в организме ферментов, отвечающих за деэпоксидирование, нет. Поэтому растения, накапливающие эпоксикаротиноиды, не эффективны в кормлении птицы для увеличения накопления ксантофиллов. Добавки диэфиров и неэтерифицированных ксантофиллов примерно одинаково эффективны, т.е. этерификация не сказывается на биодоступности ксантофиллов, что соответствует литературным данным (L. Wu et al., 2009).

Дополнительная информация по качественному составу ксантофиллов была получена при хроматографическом исследовании (нормально-фазовая хроматография) тех же образцов желтка (рис. 5). Анализ хроматограмм показал, что использование добавок, содержащих диэфиры лютеина (бархатцы) или неэтерифицированный лютеин («ОРО ГЛО»), как и в выше рассмотренном эксперименте по кормлению кур, приводит к примерно одинаковому соотношению между лютеином и зеаксантином (в диапазоне 1 : 5ч7) с логичным недостатком зеаксантина. Но уже ко второй неделе наблюдалось очень большое различие для образцов, полученных с использованием добавки на основе физалиса (накапливающего в основном диэфиры зеаксантина): доля зеаксантина в желтках таких яиц даже превысила долю лютеина (46 против 36 %, соответственно). Практически весь рост накопления ксантофиллов в этом случае (по сравнению с контрольной группой) был связан с ростом накопления именно зеаксантина.

Рис. 5. Разделение ксантофиллов желтка яиц перепелок: А- с добавкой бархатцев; Б - с добавкой физалиса

Результаты проведенных исследований показали, что в группе перепёлок получавшей добавку с диэфирами зеаксантина (физалис) в желтках накапливается преимущественно зеаксантин. Это говорит о том, что если превращение лютеина в зеаксантин и происходит, то очень медленно и в незначительных количествах. Поэтому создание сбалансированной по содержанию лютеина и зеаксантина БАД является оправданным направлением пищевого дизайна.

Кроме того тот факт, что в группах, получавших добавку с этерифицированным и неэтерифицированным лютеином (бархатцы и препарат «ОРО ГЛО»), накопление ксантофиллов примерно одинаково, подтверждает целесообразность использования природных (нативных) диэфиров ксантофиллов без дополнительных стадий омыления, что упрощает технологию получения БАД и увеличивает ее стабильность при хранении.

ВЫВОДЫ

1. В сырье для изготовления биологически активной добавки концентрация диэфиров лютеина в лепестках цветков бархатцев составила 18.27, а диэфиров зеаксантина в чашечках физалиса декоративного - 14.26 мг в расчёте на один грамм воздушно-сухого сырья.

2. В процессе хранения биологически активной добавки в течение года без доступа прямого солнечного света при температуре 20-22є С концентрация диэфиров лютеина снизилась в 1.47 раза, концентрация диэфиров зеаксантина - в 1.64 раза, что позволяет хранить и использовать добавку в течение года.

3. Использование биологически активной добавки в рационе кур-несушек способствует:

- повышению уровня каротиноидов в сыворотке крови максимально до 1.77 мг*л^-1 (при дозе диэфиров ксантофиллов 7.11 мг/гол*сут); в печени до 13.51 мг*кг^-1 (при дозе диэфиров ксантофиллов 14.22 мг/гол*сут);

- повышению концентрации кальция в сыворотке крови максимально до 0.237 г*л?№ и фосфора - максимально до 0.072 г*л?№.

4. Скармливание биологически активной добавки курам-несушкам в течение двух недель ведёт к увеличению концентрации ксантофиллов в желтках яиц от 15.73 до 45.01, в течение четырёх с половиной недель - от 23.51 до 103.77 мг/кг. При этом, чем больше доза ксантофиллов, тем выше их концентрация в желтках яиц.

5. Структура каротиноидов растительного сырья влияет на их конверсию у птицы:

- эпоксиксантофиллы не накапливаются в желтках яиц;

- этерифицированные ксантофиллы конвертируются в желток в виде неэтерифицированных ксантофиллов.

6. В биологически активной добавке, изготовленной на основе растительного сырья, соотношение диэфиров лютеина и зеаксантина составило 4:1, после скармливания его птице такое же соотношение ксантофиллов оказалось и в желтках яиц.

Практические предложения: Для получения функционального продукта питания (яичной продукции) рекомендуется использовать биологически активную добавку, содержащую диэфиры лютеина (полученные из лепестков цветков бархатцев) и диэфиры зеаксантина (полученные из чашечек физалиса) в соотношении 4:1. Для покрытия суточной нормы (5 мг ксантофиллов) человеку достаточно употребления двух яиц.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

* - работы, опубликованные в рекомендованных ВАК РФ изданиях

1. * Владимиров, В.Л. Исследование каротиноидного состава желтка куриных яиц / В.Л. Владимиров, А.А. Шапошников, Д.В. Дейнека, С.И. [т.е. М.] Вострикова, В.И. Дейнека // Доклады РАСХН. - 2005. - №6. - С.46-48.

2. * Шапошников, А.А. Биологическая ценность добавления каротиноидов в корм кур-несушек / А.А. Шапошников, С.М. Вострикова, Т.С. Гусева // Ветеринария и кормление. - 2007. - №6. - С. 11.

3. Дейнека, Л.А. Пищевой дизайн: исследование накопления ксантофиллов в желтке куриных яиц / Л.А. Дейнека, А.А. Шапошников, С.М. Вострикова, В.И. Дейнека // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. - 2007. - №5. - С.133-138.

4. Дейнека, В.И. Определение холестерола в желтке куриных яиц / В.И. Дейнека, А.А. Шапошников, Л.А. Дейнека, С.М. Вострикова, И.А. Гостищев, Т.С. Гусева // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. - 2008. - №3. - С. 164-171.

5. Дейнека, В.И. Каротиноиды: строение, биологические функции и перспективы применения / В.И. Дейнека, А.А. Шапошников, Л.А. Дейнека, Т.С. Гусева, С.М. Вострикова, Е.А. Шенцева, Л.Р. Закирова // Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация. - 2008. - №6. - С. 19-24.

6. Вострикова, С.М. Изучение накопления ксантофиллов в желтке куриных яиц при введении в диету специальных биологически активных добавок / С.М. Вострикова, А.А. Шапошников, Л.А. Дейнека // Тезисы международной конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии». - Москва 2008. - С. 159.

7. * Гостищев, И.А. Хроматографический контроль качества яичной продукции: определение холестерола в желтке / И.А. Гостищев, С.М. Вострикова, А.А. Шапошников, Л.А. Дейнека, В.И. Дейнека // Сорбционные и хроматографические процессы. Воронеж. - 2009. - Т.9, вып. 4. - С. 566-573.

8. Вострикова, С.М. Каротиноиды желтка куриных яиц: возможности пищевого дизайна / С.М. Вострикова, А.А. Шапошников, В.И. Дейнека, Л.А. Дейнека // Акт. проб. хим. науки, практики и образования: Сб. ст. Междунар. научно-практ. Конфер., 19-21 мая 2009 г., ч. 2. - Курск 2009. - С. 96-99.

9. * Шапошников, А. Источники биологически активных ксантофиллов для яичной продукции / А. Шапошников, В. Дейнека, Г. Симонов, С. Вострикова, М. Третьяков // Птицеводство. - 2009. - №4. - С. 41.

10. Вострикова, С.М. Пищевой дизайн и профилактика офтальмологических заболеваний / С.М. Вострикова, Т.Н. Сёмкина, Л.А. Дейнека, А.А. Шапошников, В.И. Дейнека // Сборник материалов Всероссийской школы-семинара «Современные наукоёмкие лечебные и фармацевт. технологии для офтальмологии» для молодых учёных, г. Белгород, 28 сентября - 1 октября 2009 г. - Белгород: ИПЦ «ПОЛИТЕРРА», 2009. - С. 20-29.

11. * Дейнека, В.И. Спектральный и хроматографический анализ ксантофиллов в различных растительных добавках и их влияние на накопление лютеина и зеаксантина в желтке перепелиных яиц / В.И. Дейнека, А.А. Шапошников, Л.А. Дейнека, С.М. Вострикова, Л.Р. Закирова, И.Е. Олейникова // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. - 2010. - №21. - С. 143-149.

12. Патент 2328137 Российская Федерация, МПК А 23 К 1/00, А 23 К 1/16. Биологически активная добавка для кур и способ её получения / Дейнека Л.А., Дейнека В.И., Шапошников А.А., Гусева Т.С., Третьяков М.Ю., Вострикова С.М., Шаркунова Н.А.; заявитель и патентообладатель Белгородский государственный университет. - № 2007113094/13; заявл. 09.04.2007; опубл. 10.07.2008, Бюл. №19; приоритет 09.04.2007. - 5 с. : ил.

Размещено на Allbest.ru

...