Устойчивость сахарной свеклы к церкоспорозу и отбор исходных селекционных форм в условиях Центрально-Черноземного района

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

06.01.05 - селекция и семеноводство

06.01.11 - защита растений

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

УСТОЙЧИВОСТЬ САХАРНОЙ СВЁКЛЫ К ЦЕРКОСПОРОЗУ И отбор ИСХОДНЫХ СЕЛЕКЦИОННЫХ ФОРМ В УСЛОВИЯХ ЦЧР

Стогниенко О.И.

Рамонь - 2007

Диссертационная работа выполнена в лаборатории иммунитета

Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова», РАСХН

Научные руководители:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, член-корреспондент РАСХН Корниенко Анатолий Васильевич, доктор биологических наук, профессор Мелькумова Елизавета Айрапетовна

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Ващенко Татьяна Григорьевна, доктор сельскохозяйственных наук Ширнина Лариса Владимировна

Ведущая организация - Государственное научное учреждение Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Центрально-Черноземной полосы им. В.В. Докучаева

Защита состоится «9» ноября 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.065.01 Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» по адресу: 396030, Воронежская область, Рамонский район, п. ВНИИСС; факс (47340) 2-19-93.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»

Автореферат разослан «9» октября 2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат с.-х. наук Путилина Л.Н.

1. Общая характеристика работы

Актуальность исследований. В настоящее время важнейшей проблемой селекции сахарной свёклы является создание гетерозисных адаптивных гибридов, сочетающих признаки высокой продуктивности, устойчивости к болезням и экстремальным факторам окружающей среды в разных эколого-географических зонах.

В Центрально-Черноземном регионе (ЦЧР) в последние годы наметилась тенденция увеличения интенсивности развития и распространенности церкоспороза сахарной свеклы. Это связано с рядом причин: потеплением климата, увеличением осадков в весенне-летнее время, заносом более агрессивных рас патогена, а также с общей тенденцией продвижения микозов с юга на север. Используемые технологии уборки сахарной свеклы, без выноса ботвы с поля, способствуют накоплению инфекции, в связи с этим болезнь достигает максимальной степени развития, что влечет снижение урожайности и сахаристости. Приоритетным направлением в оздоровлении экологической обстановки и снижении пестицидного прессинга является создание и использование устойчивых сортов и гибридов сахарной свеклы.

Участившиеся эпифитотии в областях ЦЧР побуждают к интенсивному изучению биологии патогена, особенностей взаимодействия в патосистеме, а также поиску источников, доноров устойчивости и созданию гибридов сахарной свеклы, устойчивых к церкоспорозу.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - оценка устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу в условиях ЦЧР, отбор и создание исходного селекционного материала.

Для реализации этой цели намечены и решены следующие задачи:

1. Оценить распространенность и вредоносность церкоспороза сахарной свеклы в ЦЧР.

2. Определить биологические особенности возбудителя церкоспороза Cercospora beticola Sacc. в естественных условиях и чистой культуре.

3. Установить особенности взаимодействия в патосистеме: C. beticola - Beta L.

4. Отобрать и создать источники устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу.

Научная новизна. Впервые в условиях сложившейся экологической обстановки в результате проведенных маршрутных обследований в областях ЦЧР установлено, что церкоспороз сахарной свеклы достигает максимального уровня развития (R=90-100%, Р=100%), особенно в южных районах зоны, что приводит к недобору 13-32% урожая. Проведена оценка устойчивости коммерческих сортов и гибридов к церкоспорозу в условиях ЦЧР.

Впервые для ЦЧР выявлено популяционное разнообразие возбудителя церкоспороза. Разработанные питательные среды и режимы культивирования позволили получить споровый материал для создания инфекционных фонов определения устойчивости и отбора исходных форм для селекционной работы. Установлено, что C. beticola может существовать в мицелиальной форме на растительных остатках в почве, переходя с них на корешки проростков сахарной свеклы, и вызывать корнеед, в связи с чем уточнен цикл развития патогена.

Определена важная роль фермента пероксидазы в устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу. Получены новые данные о влиянии цитоплазмы на проявление и наследование признака устойчивости сахарной свеклы к данному заболеванию.

Впервые для сахарной свеклы разработан метод экспресс-скрининга расоспецифической устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу на основе метода отрезков листьев и предложена шкала для определения устойчивости селекционного материала сахарной свеклы к церкоспорозу.

Полученные данные имеют теоретическое значение в расширении представлений о патологическом процессе в патосистеме C. beticola - B. vulgaris v. altissima, позволяющие решать селекционные задачи, связанные с созданием новых сортов и гибридов сахарной свеклы, сочетающих признаки устойчивости и продуктивности.

Практическая значимость. Разработан экспресс-метод оценки устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу на расоспецифическом уровне для использования в селекционной практике при оценке устойчивости сахарной свеклы к биотипам и расам C. beticola, который позволяет существенно сократить время изучения устойчивости к заболеванию и выявлять формы сахарной свеклы с вертикальной и горизонтальной устойчивостью.

Для выявления устойчивости единичных растений сахарной свеклы (МС-форм и О-типов) к комплексу рас C. beticola рекомендуется использовать разработанную методику определения устойчивости к токсинам патогена.

Предложены питательные среды и установлены параметры культивирования C. beticola в лабораторных условиях с целью получения спорового материала, который используется для проведения искусственного заражения сахарной свеклы и определения устойчивости к церкоспорозу на инфекционном фоне.

Разработанную нами «Методику учета споровой нагрузки C. beticola и других фитопатогенных и эпифитных грибов на листьях сахарной свеклы» (2007) рекомендуется использовать в фитопатологической практике для оценки уровня споровой нагрузки и принятия оперативного решения о проведении фунгицидных обработок против церкоспороза.

Отобранные линии диплоидных и тетраплоидных многосемянных и односемянных форм сахарной свеклы (16007, 16012, 16014, 16019 , 16023, 205002, 205004, 205027, 205603) МС-форм (РМС2АЦ/т06, РМС16-2АЦ/т06, РМС 17-1АЦ/т06, РМС17-2АЦ/т06) следует включить в селекционный процесс в качестве исходного материала как источники устойчивости к церкоспорозу. МС-форму 1291, проявляющую признаки неполного доминирования по признаку устойчивости к церкоспорозу, рекомендуется использовать в качестве донора устойчивости.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вредоносность церкоспороза сахарной свеклы в условиях ЦЧР для правильного построения системы защиты.

2. Популяционное разнообразие патогена C. beticola: культурально-морфологические признаки, агрессивность и вирулентность штаммов. Цикл развития и стратегия захвата жизненного пространства C. beticola, позволяющие разработать эффективную схему селекции при создании устойчивых к церкоспорозу форм сахарной свеклы.

3. Причина проявления экологического дисбаланса в патосистеме: C. beticola - B. vulgaris v. altissima в условиях ЦЧР.

4. Методы оценки, схемы отбора для создания исходного материала сахарной свеклы, устойчивого к церкоспорозу.

Апробация работы. Материалы исследований ежегодно входили в план работы отдела селекции и лаборатории иммунитета ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова. Разработка опытов и обсуждение результатов проводились на заседаниях отдела селекции. Основные результаты доложены на заседании ученого совета ВНИИСС, на Международной научно-практической конференции «Особенности производства, хранения и переработки сахарной свеклы на юге России» (Гулькевичи, июнь 2005), на 2-м съезде по защите растений (Санкт-Петербург, декабрь 2005г), на Международной научно-практической конференции по интегрированной защите растений (Киев, ноябрь 2006 г.), на научно-практической конференции «Индуцированный иммунитет сельскохозяйственных культур - важнейшее направление в защите растений» (Большие Вяземы, ноябрь 2006 г.), на научной конференции профессорско-преподавательского состава ВГАУ им К.Д. Глинки (март 2006 г., март 2007 г.).

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и предложений по практическому использованию результатов исследований, списка литературы из 198 наименований, в том числе 65 иностранных авторов. Текст диссертации изложен на 187 страницах компьютерного текста, содержит 19 таблиц, 63 рисунка, 1 приложение.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных статей.

2. Содержание работы

УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальная работа выполнялась в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А. Л. Мазлумова» в 2004-2007 гг.

Диссертационная работа выполнена в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2001-2005 гг. по заданию 11.02. «Разработать методы экспресс-диагностики устойчивости сахарной свеклы к фитопатогенам…», Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской федерации на 2006-2010 гг. по заданию 04.08.01 «Создать новые сорта и гибриды сахарной и кормовой свеклы, других сахароносных растений, сочетающих высокую потенциальную продуктивность, устойчивость к стрессовым факторам в процессе выращивания и хранения», в соответствии с планом научно-исследовательских работ ВНИИСС на 2004-2007 гг. по теме «Изучить устойчивость сахарной свеклы к церкоспорозу в условиях Центрального Черноземья».

В качестве материала для исследований использовали сортообразцы селекции ВНИИСС, ЛОСС, СКНИИССиС, ВИР, а также фертильные и стерильные линии, созданные в селекцентре ВНИИСС (авторы: Корниенко, Голева, Мазепин, Ошевнев, Грибанова) и СКНИИССиС (авторы: Шевченко, Логвинов), дикие виды B. maritima из коллекции ВИР и гибриды со свеклой сахарной (получены от Буренина).

Вегетационные опыты проводились в тепличном комплексе ВНИИС, лабораторные опыты - в лаборатории иммунитета. Полевые опыты закладывались в селекционном и семеноводческом севооборотах. Наблюдения за свеклой второго года жизни проводились на изоляционных участках.

В опыте по изучению вредоносности церкоспороза и его влиянии на продуктивность сахарной свеклы использован гибрид РМС-73, посев проведен на
3-рядковых делянках длиной 10 м, площадью 13,5 м2 в 4-кратной повторности. В качестве фактора, ограничивающего развитие болезни использован фунгицид Фундазол СП (500 г/кг), обработка проводилась при появлении первых симптомов болезни. Урожайность учитывалась путем подсчета и взвешивания корнеплодов со всей учетной площади делянки 13,5 м2. Сахаристость и технологические качества определялись на автоматической линии «Венема».

В исследования были включены изоляты гриба C. beticola, выделенные из пораженных церкоспорозом листьев сахарной свеклы по методике Билай и Элланской (Билай, Элланская, 1982), идентифицированы как CCR-1, 2, 3, 4, 5 (Стогниенко, Мелькумова, 2005). Культура гриба выращивалась на агаризованных питательных средах. Линейная скорость роста штаммов определялась по методике В.И. Билай (Билай, 1982). Изучение токсического действия гриба на различные по устойчивости формы сахарной свеклы проводили, используя культуральный фильтрат C. beticola (Стогниенко, Мелькумова, 2006). С целью быстрой оценки устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу и поиска источников устойчивости применяли модифицированный для сахарной свеклы метод отрезков листьев (Стогниенко, Мелькумова, Корниенко, 2006).

Оксидазная активность штаммов C. beticola была изучена по методу Борисовой (1982). Активность пероксидазы определяли в гомогенатах тканей листьев сахарной свеклы и в реакции окисления бензидина непосредственно перед инфицированием и на четвертый день после инокуляции споровой суспензией C. beticola. Изоферментный анализ по методу Дэвиса проводили в окрашивающей смеси (Землянухин, 1993) в модификации (Землянухина, 2003).

Устойчивость и продуктивность селекционных номеров изучалась в опыте по сравнительному испытанию, заложенному в 4-кратной повторности в селекционном севообороте однорядковыми делянками, площадью 4,5 м2.

Статистическую обработку проводили по методике Б.А. Доспехова (1979) с использованием приложений Microsoft Excel, Statistica V. 6.0.

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ И ВРЕДОНОСНОСТЬ ЦЕРКОСПОРОЗА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ В ЦЕНТРАЛЬНО-ЧЕРНОЗЕМНОМ РЕГИОНЕ

Распространенность и интенсивность развития церкоспороза

сахарной свеклы в условиях ЦЧР

Церкоспороз сахарной свеклы (церкоспорозная пятнистость листьев) принадлежит к одной из самых распространенных болезней, поражающей не только сахарную свеклу, но и другие виды и формы свеклы: Beta vulgaris L (столовую, кормовую, Мангольд), B. trigina Waldst., а также некоторые виды семейства маревых (Chenopodium polispermum L., Ch. vulvaria L.) (Салунская,1938).

Анализ наблюдений лаборатории иммунитета ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова (п. ВНИИСС) по интенсивности развития (R) и распространенности (Р) церкоспороза сахарной свеклы в 80-е годы ХХ века и в первые годы ХХI века на сорте Рамонская односемянная 47 свидетельствует, что произошел рост этих показателей от R = 0,19 %, Р = 0,72 % в 1980 г. до R = 27, %, Р = 96,9 % в 2004 г.

По наблюдениям, проведенным в 2004 г. на селекционных полях ВНИИСС, по большинству селекционных образцов P=95-100%, R=25%, на некоторых этот показатель составил 35-40%, а на отдельных растениях достигал 75%.

В 2005 г. первичное заражение спорами C. beticola сахарной свеклы первого года жизни выявлено 25 июня, а первые признаки заболевания зарегистрированы в 3-й декаде июля, инкубационный период развития патогена составил около 30 дней. Максимальное развитие болезни наблюдалось в 3-й декаде августа. Проведенные в 2005 г. маршрутные обследования посевов сахарной свеклы в областях ЦЧР показали, что очаги сильного развития церкоспороза приурочены к местам с ранним севом культуры (рис. 1).

Рис. 1. Развитие и распространенность церкоспороза при разных сроках сева на примере неустойчивого к заболеванию гибрида Орикс (2005 г.)

Развитие и распространенность церкоспороза сахарной свеклы возрастали с севера на юг, в южных районах достигали максимальной степени (Р=100%), наблюдалось отмирание 1-2-го ярусов листьев.

23-27 августа 2006 г., в пик развития болезни, проведено обследование производственных посевов сахарной свеклы во всех районах Воронежской области. При 100% распространенности заболевания развитие ее разное и зависит от устойчивости сорта или гибрида (табл. 1).

Таблица 1 - Оценка развития и распространенности церкоспороза на производственных посевах в отдельных районах Воронежской области (2006 г.)

Район	Хозяйство	Сорт, гибрид	R, %	P, %
Рамонский	ВНИИСС	РО 47	25	100
		ЛО 52	17,5	100
		РМС 73	13	100
		Фрея	37	100
		Манон	37	100
		Оцеан	25	100
	ЗАО “Промкор”	ХМ 5455	62	100
		ХМ 1820	48	100
		РМС-73	18	100
		РМС-70	18	100
Панинский	Агро С	Соня	15	100
		Орикс	16	100
Аннинский	СХА “Левашовка”	Орикс	19	100
	“Заря”	Орикс	24	100
Калачеевский	ЗАО “Подгорное”	Фрея	26	100
	ООО “Спутник”	ЛМС-94	7	100
	ЗАО “Макино”	РМС 70	10	100
Петропавловский	ООО “Агростарк”	ХМ 1820	13	100
Бутурлиновский	ООО “Инвестагропромкомплекс”	Маратон	74	100
		РО 47	7	100
Богучарский	СХА “Шуриновская”	РО 99	13	44

В 2007 г. первые признаки церкоспороза в производственных посевах отмечены 13 июля (Курская область, Касторенский р-н) на сортах Льговская односемянная 52, Промета (посевы были произведены в первой декаде апреля). Теплая дождливая погода способствовала раннему развитию болезни. В восточных районах Воронежской области (Борисоглебский и Поворинский) первые церкоспорозные пятна выявлены 18 июля на гибриде Маратон, посеянном во второй декаде апреля (18 апреля). Массовое развитие болезни отмечалось в первой декаде августа на восприимчивых сортах и гибридах апрельского срока сева. Пик развития заболевания зафиксирован в третьей декаде августа. Наблюдалось отмирание листьев первого и второго ярусов листьев на гетерозисном гибриде Аляска (Белгородская область, Яковлевский р-н).

Проведенные обследования показали, что в соответствии с ежегодным развитием церкоспороза в конкретных производственных условиях необходимо планировать сортовой состав. Если прогнозируется сильное развитие церкоспороза, то в сортименте необходимо увеличить долю высокоустойчивых и устойчивых сортов и гибридов. При использовании относительно устойчивых и восприимчивых, но урожайных сортов и гибридов необходимо планировать 1-2 фунгицидные обработки против церкоспороза.

Вредоносность церкоспороза в условиях Воронежской области

Для оценки ущерба наносимого церкоспорозом в условиях севера Воронежской области (табл. 2) были поставлены опыты, где фактором, ограничивающим болезнь, служили фунгициды. Обработки фунгицидом (Фундазол СП 500 г/кг, из расчета 0,6 кг/га) проводили при появлении первых симптомов заболевания.

Таблица 2 - Зависимость продуктивности сахарной свеклы от развития церкоспороза в условиях Воронежской области (2005-2007 гг.)

Год	Вариант	Р, %	R ,%	Продуктивность сахарной свеклы
				урожайность, т/га	сахаристость, %	сбор сахара, т/га
2005	1-кратная обработка фунгицидом	0	0	56,0	18,5	10,3
	Без обработки фунгицидом	32	8	42,0	19,0	8,0
	НСР 05			7,3	0,5	1,3
	Недобор (%)			25	2	22,3
2006	1-кратная обработка фунгицидом	39	2	65,5	17,5	11,8
	Без обработки фунгицидом	100	24	43,9	17,2	7,6
	НСР 05			9,5	-	1,6
	Недобор (%)			32	1,7	35,5
2007	1-кратная обработка фунгицидом	22	1,1	85,9	17,6	15,4
	Без обработки фунгицидом	100	16,2	72,1	17,0	12,2
	НСР 05			3,4	-	0,39
	Недобор (%)			16	3,4	20,7

Установлено, что при слабой степени развития болезни у относительно устойчивого гибрида РМС-73 недобор урожая корнеплодов составляет 13-16 %, при средней степени развития болезни - 32 %, при этом значительных потерь сахаристости не наблюдалось.

Помимо прямых потерь урожая корнеплодов наблюдаются и косвенные. Нижние листья на сильно пораженных церкоспорозом растениях отмирают намного быстрее, чем листья на непораженных. Одновременно с отмиранием листьев начинается медленное нарастание новых молодых листьев и рост головки корнеплода (рис. 2).

Рис. 2. Гистограмма частоты встречаемости признака высота головки корнеплода гибрида РМС-73

- слабая степень развития болезни,

- средняя степень развития болезни

Таким образом, кроме прямых потерь от недобора урожая корнеплодов при поражении церкоспорозом будут и косвенные от среза чрезмерно высоких головок. При большом разбросе вариабельности данного признака часть головок будет срезана больше нормы, что повлечет за собой потери при уборке. У других корнеплодов, которые ниже средней высоты, будет оставлена лишняя часть черешков. Превышение зеленой массы в буртах при хранении свеклы будет вызывать увеличение дыхания корнеплодов и потери сахаров, а также способствовать развитию кагатной гнили.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ CERCOSPORA BETICOLA SACC.

Биологические особенности C. beticola в чистой культуре

Культивирование C. beticola в чистой культуре. В 2004 г. нами выделены в чистую культуру 35 изолятов C. beticola и по комплексу культурально-морфологических признаков (табл. 3) дифференцированы на 5 штаммов, изучены биологические особенности в чистой культуре и возможность получения спорового материала с целью отбора устойчивого селекционного материала на искусственных инфекционных фонах.

Для культивирования C. beticola подходят многие органические среды, непременным условием успешного культивирования является добавка в среду отвара листьев сахарной свеклы (Салунская, 1959; Сюмка, 2004; Vereijssen, 2004). Нами разработана питательная среда на основе сусло-агара, с отваром листьев сахарной свеклы и добавлением гидролизата казеина (5 г/л) и пептона ферментативного (5 г/л).

Таблица 3 - Сравнительная характеристика культурально-морфологических признаков штаммов гриба C. beticola

Признаки	Штаммы C. beticola
	CCR-1	CCR-2	CCR-3	CCR-4	CCR-5
Тип колонии	мицелиальные
Окраска колонии	серая	абрикосово-кремово-белая	светло-зеленовато-серая	темно-серая	сиреневато-розово-белая
Характер поверхности	радиально-складчатая	гладкая	радиально-складчатая
Экссудат	-	неокрашенный	янтарный	вишневый, розовый
Окраска реверса	зеленовато-черная	янтарная	зеленовато-черная	бордово-черная
Конидиеносцы (к-во клеток)	1-2	стерильная форма	2	2	8-10
Конидии: - размер, мкм	93-130х3,6		88-124х5,2	41-72х5,2	104-156х5,2
- форма	обратно-булавовидная		обратно- булавовидная
- количество перегородок, шт.	8-10		6-8	9-10	15-21

Оптимальной для роста гриба C. beticola является температура в пределах 25-27С. Образование конидий происходит на 18-21-й день культивирования. Конидии вырастали в течение двух дней и имели типичные морфологические признаки.

Штаммы C. beticola исследованы нами в опытах по изучению оксидазной активности. Нами установлено, что штаммы C. beticola проявляют наибольшую ферментативную активность при температуре 18С (рис. 3).

Рис. 3. Оксидазная активность штаммов C. beticola в зависимости от температуры культивирования

Рост патогена в подустьичном пространстве, связанный с растворением клеточных оболочек и внедрением в ткани, после проникновения патогена в устьице, наиболее активно проходит при температуре 18-22С, т.е. при прохладной дневной температуре или в теплые ночи. Стерильная форма CCR-2 проявляет ферментативную активность при низких температурах (14С). Возможно, это является приспособлением, необходимым патогену, для того чтобы осваивать субстраты после отмирания листьев сахарной свеклы, когда гриб осенью с растительными остатками попадает в почву и переходит к сапротрофному образу жизни.

Фитотоксические свойства C. beticola. При изучении фитотоксических свойств C. beticola по отношению к сахарной свекле лист с черешком помещали в токсин патогена. Через 0,5 часа нахождения в токсине наблюдалось вначале резкое открытие устьиц, а затем закрытие. Спустя два часа форма замыкающих клеток устьиц менялась из бобовидной формы в прямую, удлиненную; устьичная щель также вытягивалась, изменялась и конфигурация замыкающих клеток, при этом наблюдалось отслоение протоплазмы от клеточной стенки. Через 16 часов отмечалась гибель устьичных клеток. Первая визуальная реакция листьев на влияние токсинов наблюдалась через 2-3 часа: тургор листа уменьшался, а поверхность листовой пластинки становилась матовой, через 6 часов начинали увядать вершина и края листа. Наибольшие различия в устойчивости листьев сахарной свеклы к действию токсинов различных штаммов наблюдались через 20 часов, что заключалось в темпах увядания листьев.

Таким образом, существует определенный уровень устойчивости сахарной свеклы к воздействию токсинов различных штаммов C. beticola, обусловленный биохимическими особенностями взаимодействия паразит-хозяин. церкоспороз свекла возбудитель грибковый

Биологические особенности C. beticola в естественных условиях ЦЧР

Инкубационный период после первичного инфицирования составляет около 30 дней, после вторичного - в среднем 20 дней. Пик развития болезни приходится, в зависимости от сложившихся погодных условий, на 25 августа. Эта дата может варьировать в зависимости от географического положения: в южной зоне ЦЧР - 20 августа, в более северных районах возделывания - 5 сентября.

Вирулентность и агрессивность штаммов. Вирулентность проявляют все выделенные спорогенные штаммы, агрессивность же их разная. Судя по динамике нарастания заболевания и степени развития болезни, слабо агрессивным можно считать штамм CCR-5, в то время как сильно агрессивными являются CCR-4 и CCR-3.

Цикл развития C. beticola и стратегия захвата жизненного пространства. При совместном культивировании C. beticola и проростков сахарной свеклы установлено, что при соприкосновении мицелия гриба с корешком проростка он плотно покрывал его поверхность мицелием. Выше гипокотиля мицелий гриба не рос на поверхности, однако наблюдалось побурение тканей гипокотиля и стебелька (здесь происходило проникновение мицелия в ткани). Впоследствии происходило побурение семядольных листьев и гибель проростка.

К общеизвестному циклу развития C. beticola (Салунская, 1938, 1959, Станчева, 2003, Vereijssen, 2004), по уточненным нами данным, можно добавить, что одним из этапов цикла развития является проникновение мицелия гриба с растительных остатков из почвы или с околоплодника семени в корешок проростка, поражение корешков и семядольных листьев проростков (корнеед) и следующее за этим первичное заражение листьев свеклы (рис. 4). C. beticola в почве может существовать не только в виде стромы, но и в мицелиальной форме.

В связи с уточненными нами биологическими особенностями C. beticola можно отнести к разряду R-стратегов. У этого вида не обнаружена половая стадия (телеоморфа); гриб образует несколько вегетативных генераций за сезон, затрачивает достаточно энергии на размножение конидиями - вегетативными спорами, имеет высокую конидиеобразовательную способность и минимальное развитие мицелия в тканях растений.

Рис. 4. Жизненный цикл C. beticola

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПАТОГЕНА И ХОЗЯИНА В ПАТОСИСТЕМЕ: C. BETICOLA SACC. - BETA L.

Установление типов устойчивости сахарной свеклы к C. beticola имеет экологическое значение, т.к. позволяет возделывать эту ценную культуру без использования химических препаратов - фунгицидов.

Биохимические аспекты устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу

Ферментативная активность листьев и ее значение в протекании патологического процесса. Установлена важная роль активных форм кислорода в развитии защитного ответа растений при заражении их возбудителями болезней. Связывание пероксидазы (ПО) с хитином и его олигомерами в несовместимой патогенной системе формирует условия для лигнификации зоны проникновения фитопатогена (Максимов и др., 2005). По литературным данным (Мелькумова, 1987; Громова,1988; Фомченко, 1992; Langlai, 1991; Reuveni, 1992), отмечается тенденция быстрого увеличения активности окислительного фермента пероксидазы у устойчивых растений после внедрения патогена.

Нами установлено, что образцы сахарной свеклы, проявляющие более высокую пероксидазную активность после инфицирования (Монодоро, Кубанский МС-82, +МС-74, РМС-73), в полевых условиях более устойчивы к церкоспорозу. Изучаемые образцы сахарной свеклы различаются между собой по общей и удельной активностям пероксидазы, а также ПО-спектрам (рис. 5)

Рис. 5. Зимограмма пероксидазы в образцах листьев сахарной свеклы

1 - Кубанский МС-82; 2 - +МС-74; 3 - Р 06; 4 - B. maritima x P 06; 5 - B. maritima; 6 - РМС-73; 7 - Монодоро; 8 - Рамонская односемянная 47; 9 - P 06 x B. Maritima Анализируя пероксидазную активность листьев сахарной свеклы после инфицирования родительских форм, гибридов от прямых и обратных скрещиваний, можно отметить сильное влияние материнской формы на проявление и наследование данного признака в потомстве (рис. 6).

Рис. 6. Пероксидазная активность (ФЕ/мл) листьев

 до инфицирования, - четвертый день после инфицирования

Таким образом, можно предположить, что пероксидазная активность в листьях свеклы как один из факторов устойчивости к церкоспорозу наследуется цитоплазматически. При гетерозисной селекции сахарной свеклы на основе ЦМС необходимо в скрещиваниях использовать материнские мужскистерильные компоненты (МС) с высокой пероксидазной активностью, для того чтобы гибриды обладали высокой устойчивостью к церкоспорозу.

Устойчивость к воздействию токсинов как фактор устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу

Образование токсина патогеном представляет фактор вирулентности, устойчивость растений к специфическому токсину рецессивна (Дейли, 1985).

Таблица 4 - Шкала устойчивости сахарной свеклы к токсинам C. beticola

Реакция на токсины	Устойчивость, степень	Устойчивость, балл
Нет реакции на токсины, лист зеленый в тургоре, так же как и на контроле - воде	высокая устойчивость	5
Снижение тургора, поверхность листовой пластинки становится матовой	устойчивость	4
Лист вялый, более светлый по сравнению с контролем, края листа подсохшие	относительная устойчивость	3
Усыхание 30% листовой поверхности	восприимчивость	2
Усыхание 50% и более листовой поверхности до полного усыхания листа	сильная восприимчивость	1

Прослеживается различная степень устойчивости сахарной свеклы, B. maritima, прямых и обратных гибридов между ними к токсинам различных штаммов гриба, что свидетельствует о расоспецифичной устойчивости к церкоспорозу (рис. 7).



Рис. 7. Устойчивость листьев свеклы к воздействию токсинов штаммов

C. beticola через 20 часов после помещения в токсины, к - контроль H2O

Степень токсичности штаммов C. beticola различна, что обуславливает их агрессивность и может служить доказательством существования физиологических рас.

На основании проведенных нами теоретических и экспериментальных исследований установлено:

1. Горизонтальная - видонеспецифическая устойчивость сахарной свеклы к церкоспорозу обусловлена следующими факторами: форма розетки, характер поверхности листовой пластинки, толщина, длина и угол отхождения черешка, угол наклона листовой пластинки, количество устьиц на площади поверхности листа, динамика открытия и закрытия устьиц.

2. Вертикальная - видоспецифическая устойчивость обусловлена пероксидазной активностью листьев в ответ на инфицирование, устойчивостью к токсинам.

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И СХЕМА СОЗДАНИЯ ГЕТЕРОЗИСНЫХ ГИБРИДОВ, УСТОЙЧИВЫХ К ЦЕРКОСПОРОЗУ

Методы оценки устойчивости селекционного материала сахарной свеклы к церкоспорозу

На первых этапах селекции сахарной свеклы на устойчивость к церкоспорозу оценку проводили на естественном инфекционном фоне в условиях эпифитотийного развития болезни. Следующим этапом стало создание фитопитомников-церкоспорников. Позже было предложено создавать искусственные инфекционные фоны. (Шевченко, 1932, 1971; Береговая,1939; Фрадкина и др., 1975; Петриченко, 1985). Впоследствии был предложен метод инокуляции растений сахарной свеклы в полевых условиях мицелиальной массой выделенных в чистую культуру изолятов C. beticola и размноженных в лабораторных условиях (Holder, 1996; Сюмка и др., 2004). Однако у этих методов есть определенные недостатки: зависимость от погодных условий, дороговизна наработки мицелиальной массы, однако каждый, на определенном этапе селекции, актуален.

Нами разработана методика экспресс-скрининга устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу на основе метода инфицирования отрезков листьев (Person, 1957).

Методика лабораторного экспресс-скрининга устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу на расоспецифическом уровне

Нами установлено, что наибольшей продолжительностью жизни ex situ обладают отрезки вершин листьев сахарной свеклы (во влажной камере сохраняются живыми 10-14 дней, иногда до 21 дня). Отрезки из средней и нижней частей листовой пластинки на 3-4-й день становятся стекловидными и быстро погибают.

Разложенные в кюветах отрезки листьев инокулировали спорово-мицелиальной суспензией в концентрации 105 шт./мл, поместив на каждую половину отрезка листа по капле суспензии. Кюветы накрывали стеклом, которые устанавливали на инкубацию при температуре 25-27С, с использованием естественного освещения. На пятый день инкубации проводили определение степени устойчивости по шкале, разработанной нами (табл. 5).

Таблица 5 - Шкала устойчивости сахарной свеклы при искусственном заражении C. beticola

Поражение, балл	Степень устойчивости, балл	Реакция растения-хозяина	Визуальные признаки
0	Высокоустойчивый (5)	R (resistant)	Отрезок листа зеленый, в месте инокуляции видимые признаки поражения отсутствуют.
1	Устойчивый (4)	I R	В местах инокуляции образуется точечный некроз1-2мм, иногда наблюдается реакция сверхчувствительности
2	Относительно устойчивый (3)	I (intermediate)	В месте инокуляции образуются темно-коричневые пятна диаметром до 10 мм, вокруг пятна может наблюдаться ободок салатного или желтого цвета, остальная площадь отрезка листа зеленая
3	Толерантный (2)	I S	До 30% площади темно-ко-ричневая, пластинка салатная
4	Восприимчивый (1)		30-50% площади темно-коричневая, остальная желтая
5	Сильно восприимчивый (0)	S (susceptible)	Свыше 50% площади отрезка листа темно-коричневая, на поверхности в местах инокуляции спороношение

Данная методика наиболее приемлема для определения расоспецифической устойчивости к церкоспорозу МС-форм, О-типов и пробных гибридов при изучении общей комбинационной способности (ОКС), гетерозисных гибридов F1, а также трансгенных растений сахарной свеклы (вследствие генетической однородности данного материала). Она позволяет в вышеперечисленных группах выделять формы с высокой вертикальной устойчивостью к патогену.

Дифференциация устойчивости на расовом уровне

Проведенный анализ дифференциальной устойчивости сортов и гибридов сахарной свеклы к биотипам C. beticola вышеописанным методом свидетельствует о различной качественной и количественной устойчивости (рис. 8). Устойчивость ко всем штаммам патогена определяет и высокую полевую устойчивость к церкоспорозу. Низкая устойчивость к одному штамму патогена или ее полное отсутствие будет снижать и полевую устойчивость.

Рис. 8. Расоспецифическая и полевая устойчивость сортов и гетерозисных гибридов F1 селекции ВНИИСС и ЛОСС

Зная дифференциальную устойчивость, можно прогнозировать: микроэволюционные изменения в популяции патогена при насыщении определенными сортами, течение патологического процесса, потерю устойчивости сортов, связанную с отсутствием или низкой устойчивостью к одному или нескольким биотипам патогена.

Нами установлено, что толчком к микроэволюции патогена C. beticola и прогрессированию церкоспороза сахарной свеклы в условиях ЦЧР послужили сортообновление и смена сортов популяций с горизонтальной устойчивостью к аборигенным расам патогена гетерозисными гибридами, зачастую с вертикальной устойчивостью к одной или нескольким расам.

Схема создания исходного селекционного материала и получение устойчивых к церкоспорозу гетерозисных гибридов сахарной свеклы в соответствии с жизненной стратегией патогена C. beticola

Отбор исходного материала многосемянных опылителей с признаками устойчивости к церкоспорозу. В 2006 г. в полевых условиях при сильном развитии церкоспороза на восприимчивых сортах была проведена оценка устойчивости потомства индивидуального отбора 2005 г. В сравнительном испытании нами отобраны семьи односемянной и многосемянной сахарной свеклы (лаб. селекции сахарной свеклы на фертильной основе), проявляющие устойчивость к церкоспорозу. По комплексу признаков продуктивности и устойчивости к церкоспорозу выделены следующие линии (табл. 6).

Среди изученного нами селекционного материала сахарной свеклы (линии, формы, гибриды) по комплексу признаков продуктивности и устойчивости к церкоспорозу выделено 4,4% образцов, по устойчивости к церкоспорозу -11,9%, что позволяет предположить, что селекционный генофонд сахарной свеклы рамонского происхождения содержит гены устойчивости к церкоспорозу. По всей вероятности, это горизонтальная устойчивость, обусловленная взаимодействием комплекса генов.

Таблица 6 - Продуктивность устойчивых к церкоспорозу селекционных номеров (ВНИИСС, 2006 г.)

Селекционный номер	Формы	R, %	Р, %	Урожай	Сахарис-тость	Сбор сахара
				% от группового стандарта
Групповой стандарт		23,9	100	100	100	100
16007	много- семенные	5,0	100	96,4	102,3	97,9
16012		2,8	55	123,2	101,6	124,8
16014		12,5	100	105,2	99,2	103,9
16019		2,5	50	96,0	105,9	101,3
16023		0	0	102,8	105,9	121,3
205002	одно-семян-ные	1,0	20	97,6	103,8	101,2
205004		0,8	17	138,3	100,8	138,9
205027		30	100	103,6	100,0	104,1
205603	4х	2,5	50	181,1	102,3	184,3
НСР 05		2,7		0,6	0,4	0,5

Примечание: групповой стандарт - средние показатели по сортам и гибридам: Рамонская односемянная 47, РМС-73, ЛМС-94

Оценка МС-форм на устойчивость к церкоспорозу. Отборы и оценку устойчивости к церкоспорозу МС-форм и О-типов необходимо проводить на первых этапах селекции, когда речь идет о единичных растениях. Так как в патогенезе выделение токсинов C. beticola в ткани листьев является одним из важнейших факторов патогенности, то устойчивость к токсинам, соответственно, по нашему мнению, является одним из главных факторов устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу, поэтому следует проводить отбор единичных растений на устойчивость к токсинам патогена. Нами в результате селекции выделено 10 раздельноплодных растений, проявляющих признаки стерильности пыльцы первого типа (табл. 7).

Таблица 7 - Устойчивость МС-форм к действию токсинов C. beticola, балл

Название	Контроль (Н2О)	Штаммы C. beticola
		CCR-1	CCR-2	CCR-3	CCR-4	CCR-5
РМС 2АЦ/т06	5	5	4	5	5	4
РМС 4-1АЦ/т06	5	1	2	2	2	5
РМС 4-2АЦ/т06	5	2	1	1	2	1
РМС 11-1АЦ/т06	5	2	1	2	2	5
РМС 12-1АЦ/т06	5	3	1	4	5	5
РМС 14-1АЦ/т06	5	2	1	5	3	5
РМС 16-1АЦ/т06	5	4	1	5	5	5
РМС 16-2АЦ/т06	5	5	4	5	5	5
РМС 17-1АЦ/т06	5	4	5	5	5	5
РМС 17-2АЦ/т06	5	4	5	5	5	5

В результате скрининга установлено, что МС-формы РМС2АЦ/т06, РМС16-2АЦ/т06, РМС 17-1АЦ/т06, РМС17-2АЦ/т06 обладают устойчивостью к действию токсинов всех штаммов патогена. Эти МС-формы можно в дальнейшем использовать в селекционном процессе в качестве источников устойчивости к церкоспорозу при создании гибридов сахарной свеклы.

Схема проведения отборов на устойчивость к церкоспорозу в соответствии со схемой гетерозисной селекции сахарной свеклы

В соответствии со стратегией гриба C. beticola как R-стратега Ю.Т. Дьяков (2002) рекомендует в производстве использовать сорта с горизонтальной устойчивостью к патогену, а также мультилинейные сорта. При селекции МС-линий и линий О-типа необходимо проводить выделение устойчивых к церкоспорозу растений, где должен осуществляться отбор растений с высокой вертикальной устойчивостью к доминирующим расам C. beticola (рис. 9).

Рис. 9. Схема проведения отборов на устойчивость к церкоспорозу в соответствии со схемой гетерозисной селекции сахарной свеклы (дополнена нами)

Далее, при скрещивании МС с закрепителем стерильности О-типом, в полученном МС-компоненте сочетается относительная устойчивость к большинству рас патогена (вследствие промежуточного типа наследования устойчивости к церкоспорозу (Манько, 1987). При селекции МС-форм с помощью биохимического анализа следует отбирать растения с повышенной пероксидазной активностью, контролировать отбор с помощью лабораторного экспресс-скрининга и выделять устойчивые формы сахарной свеклы к церкоспорозу на расоспецифическом уровне. При селекции и поддержании линий многосемянных опылителей целесообразно выделять линии с горизонтальной устойчивостью к заболеванию, при этом необходимо учитывать устойчивость, обусловленную особенностями анатомо-морфологического строения розетки и листа сахарной свеклы. Если далее следовать постулатам Ван дер Планка (1972) и Дьякова (2002), то наиболее адаптированными будут мультилинейные сорта. При гетерозисной селекции сахарной свеклы это можно осуществить при использовании не одного многосемянного опылителя, а двух или нескольких фенотипически идентичных, но проявляющих различную устойчивость к разному набору рас патогена, при этом можно использовать опылители, происходящие из разных эколого-географических мест. В итоге гетерозисный гибрид может состоять фактически из двух или нескольких линий, что повышает его шансы быть устойчивым в разных эколого-географических зонах с различным набором рас патогена. что будет обуславливать экологическую пластичность и адаптивность коммерческого гетерозисного гибрида. В качестве варианта, если многосемянные опылители фенотипически различаются, можно провести гибридизацию между ОП-1 и ОП-2.

В 2006 г. определена устойчивость на расоспецифичном уровне методом отрезков листьев в опыте по изучению общей комбинационной способности: МС-компонента, многосемянных опылителей и гибридов между ними (материалы селекции лаборатории ЦМС ВНИИСС) (табл. 8).

Таблица 8- Степень устойчивости родительских компонентов и гибридов F1 к штаммам C. beticola при искусственном инфицировании листьев

Формы	Штаммы C. beticola
	CCR-1	CCR-3	CCR-4	CCR-5
МС 1291	4	5	4	5
ОП 1102	3	4	3	3
ОП 1112	5	1	0	1
ОП 1131	5	5	5	4
ОП 1132	0	0	0	0
ОП 1150	5	5	4	3
ОП 1193	5	3,5	0	0
1101 (МС 1291хОП1102)	5	5	3	3
1111 (МС 1291хОП1112)	5	4	4	4
1130 (МС 1291хОП1131)	5	5	2	5
1138 (МС 1291хОП1132)	5	5	5	4
1159 (МС 1291хОП1150)	5	3	3	5
1089 (МС 1291хОП1193)	3	5	0	4

Следует отметить, что МС форма 1291 проявляет достаточно высокую устойчивость к штаммам С-3 и С-5 в условиях искусственного инфицирования, несколько ниже показатели устойчивости отмечены к штаммам С-1 и С-4. В полевых условиях распространенность болезни составила 100%, а развитие - около 7%.

При анализе опылителей по устойчивости при искусственном инфицировании штаммами C. beticola отмечаются некоторые различия в отношении данного признака. Так, формы 1121, 1131, и 1150 имеют высокую устойчивость в отношении практически всех выделенных штаммов патогена, в то время как значения P и R в полевых условиях следующие: 17% и 6% (1121), 82% и 5% (1131), 95% и 9% (1150). Полученные данные свидетельствуют о том, что в природных условиях существуют более вирулентные патотипы патогена. Для формы 1132, наоборот, все выделенные штаммы оказались весьма агрессивными, однако значение в природных условиях составило P=100% и R=5,5% .

Влияние опылителей на получение гибридов F1 имеет тенденцию к поддержанию устойчивости - восприимчивости к природным биотипам, а также при искусственном заражении выделенными нами штаммами C. beticola.

Проявление признака устойчивости к церкоспорозу

В результате изучения устойчивости сахарной свеклы к церкоспорозу выявлены разные типы расщепления, которые требуют дальнейшего тщательного изучения на генетической основе.

В случае прямого скрещивания многосемянных форм устойчивой материнской формы РФ 13 и восприимчивой отцовской РФ 14 гибридное потомство ОП 1131 отличается более высокой устойчивостью к церкоспорозу, чем материнская форма. В дальнейшем при скрещивании между МС 1291 и ОП 1131 были получены пробные гибриды (1130), отличающиеся горизонтальной устойчивостью ко всем штаммам патогена.

При реципрокном скрещивании (РФ14хРФ13) получено потомство ОП 1132, гомозиготное по генам восприимчивости. При скрещивании устойчивой МС-формы 1291 с гибридным многосемянным опылителем ОП 1132, восприимчивым ко всем штаммам, в потомстве (пробный гибрид 1138) наблюдалось расщепление 1:1, т.е. около 50% растений было устойчиво ко всем штаммам, и около 30% - восприимчиво Иммунитет в данном случае отмечен в отношении штамма CCR-1. МС-форма 1291 проявляет признаки неполного доминирования.

Приведенные данные свидетельст...