Выделение ДНК методом полимеразной цепной реакции из изолятов и вакцинных штаммов бруцелл

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Выделение ДНК методом полимеразной цепной реакции из изолятов и вакцинных штаммов бруцелл

Кушалиев К.Ж.

доктор ветеринарных наук, профессор

В статье приводятся данные по сбору изолятов бруцелл циркулирующих в регионе Западного Казахстана. Создана база данных о штаммах бруцелл патогенных для человека и животных, которая содержит подробную информацию о каждом конкретном штамме, история штамма, каким образом получен штамм бруцелла бовис, дата получения, источник выделения, местонахождение, когда выделен, кем выделен, обозначение штамма при выделении, идентификация, наличие данного штамма в других коллекциях, паспортные данные. Проведено выделение ДНК из изолятов и вакцинных штаммов бруцелл 82 и 82-ПЧ. Проведен подбор праймеров их синтез и оптимизация условий ПЦР.

Ма?алада Батыс ?аза?стан облысында бруцелді? жекеленген жина?ы бойынша м?лімет к?рсетілген. Адамзат ж?не жануарлар ?шін патогенді бруцелл штамдары бар м?лімет базасы пайда болды, я?ни штам тарихы, бруцелла бовис штамыны? ?андай жолмен алын?анын, алын?ан к?ні, орны, ?ашан б?лінгендігі туралы, идентификациясы, бас?а коллекцияда?ы берілген штамны? бар болуы, паспортты? м?ліметтері болады. Изолят ж?не 82, 82-ПЧ штамдарынан ДН? б?ліп алынды. Праймерлерді та?дау ж?не оларды? синтезі ?ткізілді, ПТР жа?дайы жа?сартылды.

In article are resulted the data to gathering of isolated brucell circulating in region of the West Kazakhstan area. The database about shtam brucell pathogenic for the person and animals is created, which contains the detailed information on everyone concrete shtam, history of shtam, reception date, allocation source, site, when it is allocated, by whom it is allocated, designation of shtam at allocation, identification and passport data. Allocation of DNA from isolate and vacsinal shtam of brucell 82 and 82 PCH, selection of primer and their synthesis, optimization of conditions PCR are spent.

При научно-исследовательском институте при ЗКАТУ имени Жангир хана проведена определенная работа по сбору образцов изолятов и создана коллекция изолятов бруцелл, циркулирующих в регионе Западного Казахстана, где имеется развернутая база данных о поддерживаемом фонде bruccella bovis, которая позволяет получать информацию о поддерживающихся культурах в необходимом для пользователя виде. Совместно с ветеринарными специалистами Западно-Казахстанского НИВС и Западно-Казахстанской ветеринарной бактериологической станции, из хозяйствующих субъектов Западно-Казахстанской области: Жангалинской, Бокей-Ординской, Акжаикской, Зеленовской и Таскалинской районах.

Проведена определенная работа по созданию базы данных о штаммах бруцелл патогенных для человека и животных. База данных содержит подробную информацию о каждом конкретном штамме. История штамма содержат сведения, каким образом получен штамм бруцелла бовис, дата получения, источник выделения, местонахождение, когда выделен, кем выделен, обозначение штамма при выделении, идентификация, наличие данного штамма в других коллекциях, паспортные данные. Cистематизированы сведения об источниках выделения и получения коллекционных штаммов bruccell [1, 2].

Выяснена географическое местоположение выделения штамма, история их движения и изучения, что позволяет дополнять базу данных новыми сведениями из опубликованных материалов различных исследователей по конкретным штаммам.

Выделение ДНК из коллекции изолятов бруцелл.

Коллекция препаратов ДНК из Brucella spp была создана на основе материала полученного из крови больных животных и коллекции изолятов предоставленных Западно-Казахстанской НИВС и Западно-Казахстанской ветеринарной бактериологической станцией.

Выделение ДНК проводили при помощи коммерческого набора Амплисенс «ДНК-сорб-Б», с предварительной подготовкой образцов. Кровь полученная от больных животных предварительно подвергалась серологическому анализу проведенному Западно-Казахстанской ветеринарной бактериологической станцией. Для выделения ДНК использовалась плазма крови больных животных. Образцы подвергались лизису при 65 °С в течении 5 минут. В каждую пробирку вносили 25 мкл суспензии сорбента, перемешивали и оставляли на 2 мин для осаждения сорбента. Затем повторно проводили перемешивание на вортексе и оставляли на 5 мин для осаждения сорбента. Сорбент осаждали на микроцентрифуге при 5 тыс об/мин в течение 30 сек и отбирали супернатант используя вакуумный отсасыватель из каждой пробирки отдельным наконечником. Вносили по 300 мкл раствора для отмывки 1, тщательно перемешивали смесь на вортексе и вновь осадали на прежнем режиме. Вносили по 500 мкл раствора для отмывки 2 ресуспендировали на вортексе, осаждали на микроцентрифугированием 10 000 об/мин в течение 30 сек и удаляли супертанант. Повторяли процедуру отмывки раствором для отмывки 2. Элюцию проводили при помощи 50 мкл ТЕ-буфера. Качество выделения ДНК определяли при помощи метода электрофореза в агарозном геле.

Рисунок 1 - Электрофорез в агарозном геле полученных препаратов ДНК

Выделение ДНК из вакцин штаммов бруцелл 82 и 82-ПЧ.

Выделение ДНК проводили при помощи коммерческого набора Амплисенс «ДНК-сорб-Б». Вначале лизирующий раствор прогрели при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов.

К вакцинным штаммам бруцелл 82 и 82-ПЧ добавили 300 мкл лизирующего раствора, тщательно перемешивали смесь на вортексе и прогревали 5 мин при температуре 65 °С, затем еще раз перемешивали на вортексе. В каждую пробирку вносили 25 мкл суспензии сорбента, перемешивали и оставляли на 2 мин для осаждения сорбента. Затем повторно проводили перемешивание на вортексе и оставляли на 5 мин для осаждения сорбента. Сорбент осаждали на микроцентрифуге при 5 тыс об/мин в течение 30 сек и отбирали супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником. Вносили по 300 мкл раствора для отмывки №1, тщательно перемешивали смесь на вортексе и вновь осадали на прежнем режиме. Вносили по 500 мкл раствора для отмывки №2, ресуспендировали на вортексе, осаждали на микроцентрифугированием 10 000 об/мин в течение 30 сек и удаляли супертанант. Повторяли процедуру отмывки раствором №2. Элюцию проводили при помощи 50 мкл ТЕ-буфера. Качество выделения ДНК определяли при помощи метода электрофореза в агарозном геле [3, 4, 5].

изолят вакцинный штамм бруцелла

Рисунок 2 - Электрофорез в агарозном геле полученных препаратов ДНК из вакцин штаммов бруцелл 82 и 82-ПЧ.

Подбор праймеров и их синтез.

Подбор праймеров осуществляли на основе имеющихся литературных данных по изучению Brucella spp. В результате обработки литературных материалов были подобраны две пары праймеров для видового определения возбудителей заболевания бруцеллеза. На основе компьютерного анализа при помощи пакета программ Vector NTI были проанализированы подобранные две пары праймеров. В результате анализа первая подобранная пара праймеров 24-1 (TGCAGCTCACGGATAATTTG) и 24-2 (ACACCTTGTCCACGCTCAC) строго специфична для B. аbortus. Вторая подобранная пара 25-1(ATCTGGTTCTTTCGGGTGTG) и 25-2 (CATCACCAAGAACCGTGTTG) является маркерной для определения видов B. аbortus, B. melitensis и B. suis. Праймеры были заказаны и синтезированы в компании ЗАО Евроген, Российская Федерация, город Москва.

Рисунок 3 Компьютерная обработка первой пары праймеров для определения B. аbortus.

Оптимизация условий ПЦР.

Таким образом, оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции проведена с учетом имеющихся литературных данных по изучению Brucella spp и проведению ПЦР. Оптимизация велась по трем направлениям:

1) Температурный профиль;

2) Временной профиль реакции;

3) Состав реакционной смеси;

Была разработана программа амплификации коллекции ДНК микроорганизмов рода Brucella, состоящая из 42-х циклов включающая в себя 1 этап «денатурация» при 95 °С в течении 3-х минут, 2 этап «отжиг» при 63 °С в течении 1-ой минуты и 3 этапа «элонгации» или «синтеза» при 72 °С в течении 1-ой минуты.

Состав реакционной смеси включал в себя следующие компоненты: праймеры по 0,1 мкл, буфер для проведения ПЦР реакции по 2,0 мкл, MgCl 1.5 M по 1,2 мкл, смесь дизоксинуклеотидтрифосфатов dNTP в количестве 0,4 мкл и Taq-полимераза по 0,4 мкл на реакцию.

Проведена определенная работа по выяснению географического местоположения выделения штаммов, история их движения и изучения, что позволяет дополнять базу данных новыми сведениями из опубликованных материалов различных исследователей по конкретным штаммам. Также собраны данные по изолятам бруцелл циркулирующих в регионе Западно-Казахстанской области и выделение ДНК из изолятов и вакцинных штаммов бруцелл 82 и 82-ПЧ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Абуталипов, А.А. Методические указания по проведению анализа ДНК методом полимеразной цепной реакции ПЦР / А.А. Абуталипрва, В.Е. Тен // ДГП «Научно-Исследовательский Ветеринарный Институт» РГП «НПЦ ЖиВ» МСХ РК. - Алматы: 2007. - 38 с.

2 Бадашкеева, А.Г. Меченные биотином олигонулклеотиды как зонды в методе молекулярной гибридизации [ Текст ] / А.Г. Бадашкеева; // Молекулярная биология, 1989.-Т.23.-Вып.5.- 1221-1226 с.

3 Деренко, М.В. Однопраймерный вариант ПЦР-амплификации участков главной некодирующей области [Текст] / Г.И. Деренко., Б.А. Малярчук.

4 Урбан, В.П. Иммунопрофилактика инфекционных болезней животных // Проблемы ветеринарной иммунологии./ В.П. Урбан - М.: Агропромиздат, 1998. из штамма 82 // Хронические инфекции животных: Сб. науч. тр. - Новосибирск, 1987.

5 Мозесюк, Е.О. Сравнительная антигенная характеристика некоторых штаммов бруцелл, отнесенных к стабильным и нестабильным L-формам // Актуальные вопросы профилактики и ликвидации заразных болезней с.-х. животных: Сб. науч. тр. / Е.О. Мозесюк, Н.М. Чувилькин, И.И. Колодий - Л., 1983. - вып. 73. - 66-70 с.

Размещено на Allbest.ru