Люминесцентные показатели растений на ранних этапах онтогенеза при разных условиях питания

Размещено на http://www.allbest.ru/

МГУ имени М.В.Ломоносова

ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур

Люминесцентные показатели растений на ранних этапах онтогенеза при разных условиях питания

Вацадзе Н.С., Пахненко Е.П.,

Глазунова С.А., Караваев В.А.,

Байков А.А., Солнцев М.К.

Аннотация

флуоресценция минеральный удобрение люминесцентный

Исследована медленная индукция флуоресценции и термолюминесценция листьев бобов и ячменя на ранних этапах онтогенеза в условиях применения минеральных удобрений и стимуляторов роста. Показано соответствие между изменением люминесцентных показателей, характеризующих фотосинтетическую активность, и биомассой растений.

Ключевые слова: ФОТОСИНТЕЗ, ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ, МИНЕРАЛЬНЫЕ УДОБРЕНИЯ, СТИМУЛЯТОРЫ РОСТА

Введение

В последние годы для изучения функциональной активности фотосинтетического аппарата растений активно используются люминесцентные методы, основанные на регистрации медленной индукции флуоресценции (МИФ) и термолюминесценции (ТЛ) листьев растений. Эти методы позволяют обнаружить те изменения в фотосинтетическом аппарате, которые происходят на самых ранних стадиях внешнего воздействия [1, 2].

Люминесцентные методы применяются для изучения изменений, происходящих в фотосинтетическом аппарате растений при их обработке различными физиологически активными веществами: гербицидами, фунгицидами, антиоксидантами и, в том числе, растительными экстрактами. Однако влияние минерального питания на фотосинтетическую активность растений на ранних стадиях онтогенеза этими методами исследовано недостаточно.

Источником флуоресценции в растительной клетке являются светособирающие молекулы пигментов, причём подавляющая часть флуоресценции в нормальных условиях происходит от хлорофилла а фотосистемы 2.

При освещении зелёного листа после периода темновой адаптации интенсивность флуоресценции, как правило, претерпевает ряд немонотонных изменений, схематично изображённых на рис. 1. Изменения O-I-D-P называют первой волной, или быстрой индукцией флуоресценции (БИФ). Она протекает за 1-3 сек., в зависимости от интенсивности света и других факторов. Более медленные изменения P-S-M-T известны как вторая волна, или медленная индукция флуоресценции (МИФ) [3].

Рис. 1 Схема индукционных изменений флуоресценции фотосинтезирующих объектов

Высокие значения интенсивности флуоресценции в первые секунды освещения связаны с восстановлением первичных акцепторов электронов фотосистемы 2 (ФС2). В последующий период начинают работать регуляторные механизмы, обеспечивающие оптимальное функционирование системы фотосинтетических реакций, и флуоресценция уменьшается.

Тушение флуоресценции от максимального уровня Р до стационарного значения Т тесно связано с процессами фотосинтеза и регулируется внешними факторами.

В качестве параметра МИФ для оценки фотосинтетической активности используют безразмерную характеристику - отношение (F_M-F_T)/F_T, где F_М - интенсивность флуоресценции хлорофилла в момент достижения второго максимума (после включения освещения); F_T - стационарный уровень флуоресценции (достигаемый после нескольких минут освещения) (рис. 2).

Рис. 2 Характерная кривая медленной индукции флуоресценции листьев растений

Ранее было показано [4], что изменения показателя (F_М-F_Т)/F_Т при различных воздействиях на растения в процентном отношении соответствуют изменениям фотосинтетической активности листа, оцениваемой по скорости выделения О₂ в расчете на хлорофилл (коэффициент корреляции r=0,98; р = 0,99).

Метод индукции флуоресценции в настоящее время достаточно широко используется для решения фундаментальных и прикладных задач биофизики фотосинтеза и физиологии растений. Наиболее часто флуоресцентные показатели стали использоваться в последние 15-20 лет [2].

В основе термолюминесценции лежит явление свечения вещества, возникающее при его нагревании.

При предварительном освещении вещества в нем образуются свободные носители зарядов: электроны и дырки. Эти носители стабилизируются на центрах захвата (ловушках). Для высвобождения носителя зарядов из ловушки ему необходима дополнительная энергия. Эту энергию носитель заряда может получить либо при нагревании объекта, либо при освещении вещества инфракрасным светом. Но если образец выдерживать при низкой температуре и в темноте, то носители зарядов могут жить довольно продолжительное время. Нагревание вещества дает носителям зарядов энергию для высвобождения из ловушек. Электрон и дырка, высвобожденные из ловушек, могут рекомбинировать с излучением кванта света.

Если объект, предварительно освещенный при более низкой температуре, подвергнуть нагреву в темноте, то, достигнув температуры, при которой тепловая энергия становится сравнимой с энергией активации (энергией, необходимой для высвобождения носителя заряда из ловушки), вещество начнет светиться. С течением времени все электрон-дырочные пары рекомбинируют и свечение прекратится. Построив график зависимости интенсивности свечения от температуры регистрации излучения, мы получим кривую ТЛ (рис. 3).

Рис. 3 Одиночный пик термолюминесценции

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4 Характерная кривая термолюминесценции фотосинтезирующих объектов

Часть излучения, которая возникает в случае предварительного освещения листьев растений при более низкой температуре, имеет фотосинтетическую природу и связана с рекомбинацией зарядов, стабилизированных на акцепторной и донорной сторонах фотосистемы 2 (ФС2). На рис. 4 это полосы A, В₁ и В₂ [5]. В диапазоне температур от 40 до 60 °С может наблюдаться ТЛ, имеющая фотосинтетическую природу, а также связанная с термолизом продуктов деструкции мембранных липидов с последующей передачей энергии возбуждения на хлорофилл. При температуре выше 60 °C фотосинтетический аппарат растений инактивируется [6], поэтому высокотемпературная ТЛ имеет исключительно хемилюминесцентную природу. В работе [7] высказано предположение, что основной вклад в высокотемпературную полосу С вносят реакции продуктов, образующихся в результате деструкции мембран хлоропластов при замораживании, протекающие только при наличии кислорода. В этих экспериментах интенсивность высокотемпературной ТЛ увеличивалась по мере понижения температуры предварительного охлаждения образцов, а удаление кислорода во время регистрации ТЛ из окружающей образец среды приводило к исчезновению полосы С [7]. Вместе с тем интенсивность полосы С зависела не только от условий эксперимента, но и от условий выращивания образцов. Было отмечено, что при прочих равных условиях интенсивность высокотемпературной ТЛ увеличивается при воздействии на растение различных неблагоприятных факторов. Таким образом, был сделан вывод, что величина пика С характеризует устойчивость тканей растений (мембран хлоропластов) к стрессорам [8].

Метод термолюминесценции позволяет определить характер воздействия различных препаратов на первичные процессы фотосинтеза, связанные с функционированием фотосистемы 2, наиболее чувствительной к факторам внешней среды. Систематическое изучение МИФ и ТЛ необходимо с точки зрения разработки экспресс-методов оценки физиологического состояния растений в изменяющихся условиях окружающей природной среды [9].

Цель данной работы заключалась в изучении функциональной активности фотосинтетического аппарата растений на ранних стадиях онтогенеза методами МИФ и ТЛ при внесении минеральных удобрений и обработке стимуляторами роста.

Объекты и методы исследования

Вегетационный опыт с почвенной культурой проводили в июне-августе 2010 г. на бобах Vicia faba L. сорта «Русские черные» и ячмене Hordeum vulgare L. сорта «Раушан». В опытах использовали дерново-подзолистую легкосуглинистую почву залежи, слой почвы 0-10 см. Место отбора почвы Щелковский район Московской области. Агрохимические характеристики почвы: рH_KCl 5,1; Р₂О₅ 111 мг/кг; К₂О 149 мг/кг; NО₃^? 21,5 мг/кг, NH₄⁺ 47,1 мг/кг. Рентгеновский бесстандартный количественный анализ элементов и оксидов показал, что в почве преобладают Si, Al, Ca (табл. 1).

В первом опыте изучали люминесцентные показатели растений в условиях различного минерального питания. Применяли удобрения: аммиачную селитру, двойной суперфосфат, хлористый калий в дозе 0,1 г д.в./кг почвы. Под бобы азот вносился в дозе 0,05 г д.в./кг почвы. Контроль почва без внесения удобрений. Схема опыта: контроль, NP, NK, PK, NPK. Масса почвы в сосудах составляла 2 кг, повторность опыта - трехкратная. Измерения люминесцентных показателей листьев бобов проводили на 14-е сутки после посадки семян в фазе трех пар листьев, ячменя на 20-е сутки в фазе второго настоящего листа. Для установления закономерностей в изменении формы кривых МИФ проводили 9 параллельных измерений, использовали по 3 растения из каждого сосуда. Для выяснения достоверности влияния минерального питания на показатель МИФ данные измерений были подвергнуты однофакторному (фактор минеральное питание) дисперсионному анализу.

Таблица 1

Элементный состав почвы методом рентгеновского бесстандартного количественного анализа (JEOL JED-2300, Япония)

* keV - килоэлектрон-вольт

Во втором опыте использовали стимуляторы роста растений: препарат на основе горца сахалинского Reynoutria sachalinensis (F. Schmitt) Nakai сверхкритический флюидный экстракт (СКФ) горца и микробиологический препарат Восток ЭМ-1. Бобы опрыскивали препаратом горца сахалинского в фазе трех пар листьев. Перед обработкой растений препарат разводили в 100 мл воды для получения 2%-й суспензии. Опрыскивание растений производили за два дня до первого измерения люминесцентных показателей. Обработку бобов раствором Восток ЭМ-1 проводили по соответствующим рекомендациям к данному препарату. Для измерения люминесцентных показателей использовали листья второго яруса бобов.

Срок вегетации бобов в опытах 15 дней от момента появления всходов, ячменя 21 день.

Люминесцентные показатели растений измеряли на кафедрах общей физики и биофизики физического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Для измерения МИФ сегмент из средней части листовой пластинки растений размером 15 х 25 мм² помещали в держатель, расположенный в цилиндрическом корпусе с двумя окнами, через которые производили облучение образца и регистрацию флуоресценции. Флуоресценцию возбуждали широкополосным синим светом интенсивностью около 100 Вт/м², а регистрировали на длине волны 686 нм в максимуме спектра флуоресценции зеленого листа. Измерения проводили по следующей схеме: помещение листа в держатель; 30 сек. освещения (для стандартизации начальных условий); 5 мин. адаптации к темноте; освещение и регистрация МИФ. Описание установки и методика измерения МИФ приведены в работе [9].

Для измерения термолюминесценции использовали фрагменты из средней части листьев растений. Для стандартизации начальных условий образцы предварительно освещали через интерференционный фильтр с максимальным пропусканием при 735 нм (=5 нм). Затем их адаптировали к темноте в течение 6 мин при комнатной температуре, охлаждали до температуры 30 ^oС и освещали полным спектром лампы накаливания в течение 3 мин. Этого времени было достаточно для «насыщения» интенсивности всех пиков ТЛ. После охлаждения образца до 100 ^oС его нагревали со скоростью около 30 град/мин. Термолюминесценцию регистрировали в интервале температур от -40 до +100 ^oС.

Результаты и обсуждение

В условиях полевых и вегетационных опытов установлено, что бобы формируют биомассу в соответствии с уровнем минерального питания. В условиях слабоокультуренных дерново-подзолистых почв вносят «стартовые дозы азота», так как в начале вегетации слабо реализуется способность проростков к азотфиксации. Основными удобрениями под бобовые культуры являются фосфорные и калийные [10]. Фосфор обеспечивает циклическое и нециклическое фосфорилирование, калий повышает механическую прочность тканей, способствует передвижению в них питательных веществ, повышает устойчивость к температурному стрессу и соответствующим патогенам [11].

В первой части работы с минеральными удобрениями анализ данных по биомассе показал, что наилучшие условия вегетации бобов на ранних стадиях онтогенеза складывались при внесении трех элементов минерального питания (прибавка к контролю - 17%). Из парных комбинаций элементов наибольшая прибавка биомассы была достоверно зафиксирована в варианте РК (11%) (табл. 2).

Ячмень - культура короткого вегетационного сезона, имеет слаборазвитую корневую систему, основные элементы минерального питания потребляет в ранние сроки вегетации, на его развитие позитивно влияет применение стимуляторов роста [12]. Для ячменя внесение полного минерального удобрения (вариант NPK) обеспечивало увеличение биомассы на 73% по отношению к контролю. Из парных комбинаций элементов достоверное увеличение биомассы наблюдалось в варианте NP (38% к контролю) (табл. 2).

Внесение в почву минеральных удобрений во всех использовавшихся комбинациях приводило к увеличению значений (F_MF_T)/F_T в случае бобов, но в разном процентном отношении по сравнению с контролем. При этом для парных комбинаций PK и NP наблюдалось увеличение данного люминесцентного показателя на 3338 %, а при внесении полного минерального удобрения на 91%. Увеличение значений (F_M-F_T)/F_T по сравнению с контролем свидетельствует об увеличении фотосинтетической активности (скорости выделения О₂) у растений, выращенных в почве с внесением минеральных удобрений. Следует отметить, что наиболее высокие значения показателя (F_M-F_T)/F_T были зарегистрированы в вариантах, включающих фосфор (NP, PK и NPK).

Таблица 2

Значения (F_M-F_T)/F_T медленной индукции флуоресценции листьев бобов и ячменя и сухая биомасса растений (г/cосуд) в условиях различного минерального питания

В опыте с ячменем на ранней стадии онтогенеза также было зафиксировано существенное увеличение люминесцентного показателя (F_M-F_T)/F_T во всех вариантах минерального питания (табл. 2). Судя по этому показателю, лучшим следует признать внесение под ячмень азотно-фосфорных удобрений (увеличение на 40% по отношению к контролю) и полного минерального удобрения (на 48% по отношению к контролю), что соответствует данным по биомассе растений.

Характерные кривые термолюминесценции листьев бобов, выращенных в условиях различного минерального питания, представлены на рис. 5. ТЛ с максимумом в области 0 С следует рассматривать как полосу А, сдвинутую в область более высоких температур вследствие индивидуальных особенностей растений, выращенных на почве данного типа.

Рис. 5 Характерные кривые термолюминесценции листьев бобов при внесении минеральных удобрений (полосы А - от -20є до +0єС; В - от 0є до +40єС; С - от +40є до +60є-70єС)

Обращают на себя внимание следующие закономерности.

1. Интенсивность ТЛ в области полосы А для вариантов NP, NK и PK оказывается существенно выше, чем в контроле (в контроле пик А выражен в виде плеча). Ранее было показано [8], что увеличение интенсивности пика А свидетельствует об увеличении фотосинтетической активности растений. Эти данные согласуются с данными, полученными

методом МИФ. Для варианта NPK максимум ТЛ полосы А (выражена в виде плеча) смещен в область положительных температур, к 10 °С. Это указывает на увеличение энергии активации, необходимой для освобождения электронов из «ловушек» на акцепторной стороне ФС2. Отсюда следует, что в условиях сбалансированного минерального питания, очевидно, можно говорить о снижении эффективности обратных реакций переноса электронов на акцепторной стороне ФС2. Это, в свою очередь, приводит к ускорению электронного транспорта между фотосистемами и, в конечном итоге, - увеличению фотосинтетической активности.

2. Интенсивность высокотемпературной полосы С для вариантов NP и NPK ниже, чем в контроле, для варианта NK - такая же, как в контроле, а для варианта РК - даже несколько выше. Снижение интенсивности ТЛ в области полосы С сопровождается уменьшением общей светосуммы (площади под кривой) ТЛ во всем диапазоне температур. Это наглядно видно на примере вариантов NP и NPK. Очевидно, это связано с тем, что в условиях высокой устойчивости мембран хлоропластов к пониженной температуре (об этом свидетельствует менее интенсивная полоса С) накопление зарядов в более глубоких «ловушках» на донорной и акцепторной сторонах фотосистемы 2 при предварительном освещении образцов оказывается менее эффективным, и интенсивность ТЛ в области полос В₁ и В₂ уменьшается. Следует отметить, что «разгорание» полосы С наблюдалось в вариантах опыта, где применяли калийное удобрение. Можно предположить, что в нашем опыте присутствие аниона хлора снижает физиологичекую значимость калия и негативно влияет на устойчивость мембран хлоропластов к пониженным температурам.

Анализ кривых термолюминесценции листьев ячменя показал их устойчивую однородность по всем вариантам опыта, включая контроль. Небольшое увеличение полосы А наблюдалось только при внесении NK, полоса С у всех вариантов не наблюдалась, что, по-видимому, отражает видовые особенности ячменя. Зерновка ячменя характеризуется высоким содержанием фосфора и калия, что обеспечивает устойчивость фотосинтетического аппарата на ранних этапах онтогенеза в широком интервале температур. Периодом максимальной эффективности в питании ячменя является стадия «конец кущения - начало трубкования». Измерение люминесцентных показателей злаковых культур на этой стадии онтогенеза оказывается более информативным [1].

Во второй части работы было проведено сравнительное изучение влияния на фотосинтетическую активность двух стимуляторов роста: коммерческого микробиологического препарата Восток ЭМ-1 и препарата на основе горца сахалинского, полученного методом сверхкритической флюидной экстракции с использованием диоксида углерода в сверхкритическом состоянии. Впервые СКФ-технологии были применены в 1974 г. для извлечения кофеина из кофейных зерен. В настоящее время в РФ производится более 150 препаратов на основе СКФ-экстрактов из различных видов растений [13]. Преимущество этого метода заключается в сохранении большого количества физиологически активных веществ, зачастую теряемых при других способах экстракции [14].

Листья горца сахалинского Reynoutria sachalinensis богаты различными фенольными соединениями [15, 16, 17]. Стимулирующее действие препаратов на основе горца на фотосинтетический аппарат растений, как предполагается, связано с поступлением в клетки листа физиологически активных соединений хиноновой природы, которые увеличивают пул акцепторов электрона фотосистемы 2 [15]. Ранее было установлено, что препарат на основе горца сахалинского, полученный с использованием 2%-ного этанола в качестве сорастворителя методом сверхкритической флюидной экстракции, является более эффективным в плане стимуляции фотосинтетической активности по сравнению с экстрактами горца, полученными другими методами [9]. В полевых опытах, проведенных на посевах ячменя Hordeum vulgare L. сорта «Михайловский», было показано, что повышение фотосинтетической активности в первые дни после обработки растений препаратами на основе горца сахалинского в фазу «конец кущения - начало выхода в трубку», приводит к увеличению основных показателей структуры урожая: общей и продуктивной кустистости, массы зерна с колоса и делянки [1, 9].

Измерения медленной индукции флуоресценции листьев бобов проводили на 2-й, 5-й и 8-й день после обработки растений. Наибольшее стимулирующее действие на фотосинтетический аппарат (увеличение показателя (F_M-F_T)/F_T) было зарегистрировано при использовании СКФ-экстракта горца сахалинского на 2-й день после обработки растений (табл. 3). При обработке растений микробиологическим препаратом Восток ЭМ-1 достоверных изменений показателя (F_M-F_T)/F_T) обнаружено не было (табл. 3). По визуальной диагностике и биомассе растения, обработанные микробиологическим препаратом, практически не отличались от контрольных. Биомасса бобов при использовании препарата на основе горца превышала контроль на 23%.

Таблица 3

Значения (F_M-F_T)/F_T) медленной индукции флуоресценции листьев бобов после их обработки препаратом Восток ЭМ-1 и СКФ-экстрактом горца сахалинского

Таким образом, можно констатировать, что полное минеральное удобрение бобов и ячменя (вариант NPK) на ранних стадиях онтогенеза приводит к существенной стимуляции функциональной активности фотосинтетического аппарата растений, что отражается на приросте биомассы. В случае бобов существенный стимулирующий эффект был зарегистрирован для всех вариантов минерального питания, включающих фосфорное удобрение. При обработке растений бобов сверхкритическим флюидным экстрактом горца сахалинского Reynoutria sachalinensis наблюдалось увеличение фотосинтетической активности в течение одной недели после обработки. Достоверных изменений фотосинтетической активности листьев бобов после обработки препаратом Восток ЭМ-1 в условиях данного эксперимента зафиксировано не было.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант № 11-03-12129-офи-м-2011.

Список использованных источников

1. Гунар Л.Э. Современные методы комплексной оценки действия пестицидов и рострегуляторов на растения. Автореферат дисс. … докт. биол. наук. М.: РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2009, 38 с.

2. Полякова И.Б. Медленная индукция флуоресценции листьев растений при разной фотосинтетической активности. Дисс. … канд. физ.-мат. наук. М.: МГУ, 2002, 147 с.

3. Lazar D. Chlorophyll a fluorescence induction. Biochim. Biophys. Acta, 1999, v. 1412, p. 1-28.

4. Караваев В.А. Нелинейные регуляторные процессы в фотосинтезе высших растений. Дисс. … докт. физ.-мат. наук. М.: МГУ, 1990, 416 с.

5. Иноу Й., Сибата К. Термолюминесценция фотосинтетического аппарата. Фотосинтез. Под ред. Говинджи, т. 1. М.: Мир, 1987, 728 с.

6. Allakhverdiev S.I., Feyziev Y.M., Ahmed A., Hayashi H., Aliev J.A., Klimov V.V., Murata N., Carpentier R. Stabilization of oxygen evolution and primary electron transport reactions in photosystem II against heat stress with glycinebetaine and sucrose. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 1996, v. 34, p. 149-157.

7. Солнцев М.К. О природе полосы термолюминесценции фотосинтетических объектов при 40-80 °С. Журнал физической химии, 1989, т. 63, с. 1959-1960.

8. Solntsev M.K., Ekobena H.P.F., Karavaev V.A., Yurina T.P. Dynamics of the action of various physical and chemical factors on the themoluminecence of photosynthetic systems. Journal of Luminescence, 1998, v. 76-77, p. 349-353.

9. Глазунова С.А. Люминесцентные характеристики растений, обработанных рострегулирующими препаратами. Дисс. … канд. физ.-мат. наук. М.: МГУ, 2009, 113 с.

10. Плешков Б.П. Биохимия сельскохозяйственных растений. М.: Агропромиздат, 1984, 494 с.

11. Пахненко Е.П. Роль почвы и удобрений в устойчивости растений к патогенным грибам в агроценозах. Автореферат дисс. … докт. биол. наук. М.: МГУ, 2001.

12. Пахненко Е.П. Влияние биопрепарата Альбит на продуктивность ячменя и содержание биофильных элементов в урожае. Агрохимия, 2002, №1, с. 49-54.

13. Водяник Р., Шадрин А.Ю., Синев М.Ю. Сверхкритическая флюидная экстракция природного сырья: мировой опыт и ситуация в России. Сверхкритические флюиды. Теория и практика, 2008, т. 3, №2, с. 58-69.

14. Ревельский И.А., Глазков И.Н. О применении СФЭ для получения экстрактов из лекарственных, сельскохозяйственных растений и фармпрепаратов. Сверхкритические флюиды. Теория и практика, 2008, т. 3, №2, с. 66-77.

15. Daayf F., Schmitt A., Belanger R.R. Evidence of phytoalexins in cucumber leaves infected with powdery mildew following treatment with leaf extracts of Reynoutria sachalinensis. Plant Physiol., 1997, v. 113, p. 719.

16. Schmitt A., Gansbauer K.H., Vostrowski O.J., Huber J., Bestmann
H.J. Characterization of active compounds in resistance-inducing plant extracts of Reynoutria sachalinensis. Abstracts of the 7th International Congress of Plant Pathology, Edinburgh, Scotland, 1998, p. 159.

17. Vrchotova N., Sera В., Tfiska J. Dadakova E., Kuzel S. Biologically active compounds as a possible cause of invasibility of knotweeds (Reynoutria spp.) from eastern Asia. In: D.V. Alford and G.F. Backhaus (Eds) Plant Protection and Plant Health in Europe: Introduction and Spread of Invasive Species, Page Bros, Norwich, 2005, p. 289-290.

Размещено на Allbest.ru