Разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и его применение для молодняка сельскохозяйственных животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

03.01.06 - биотехнология

(в том числе бионанотехнологии)

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАН-МЕЛАНИНОВОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПОДМОРА ПЧЕЛ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Погарская Наталья Владимировна

Саратов - 2010 г

Диссертация выполнена в Государственном научном учреждении

«Ставропольский научно-исследовательский институт животноводства и кормопроизводства» Россельхозакадемии

Научный руководитель: доктор биологических наук

Селионова Марина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Птичкина Наталия Михайловна

доктор биологических наук, профессор

Маннапов Альфир Габдуллович

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

Всероссийский государственный научно-исследовательский институт

животноводства Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится 29 апреля 2010 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан _____ марта 2010 года и размещён на официальном сайте университета www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Уникальные свойства хитина и хитозана открывают большие перспективы для их применения в быту, медицине, ветеринарии, косметологии, фармацевтической промышленности.

Эти природные полимеры имеют ряд важных свойств, как, например, высокую биологическую активность, совместимость с тканями человека, животных и растений, оказывают иммуностимулирующее, противоопухолевое, бактериостатическое, ранозаживляющее действие. Они не загрязняют окружающую среду, так как полностью разлагаются ферментами микроорганизмов, а также снижают воздействие болезнетворных микроорганизмов, адсорбируясь на стенках желудочно-кишечного тракта человека и животных (Фомичев, 2004).

Повышенное внимание к свойствам хитина и его производного - хитозана, возникшее более трех десятилетий назад, является актуальным и в настоящее время. Несмотря на многочисленные исследования свойств (Варламов, 2002; Немцев, 2006; Muzzarelli, 1997), возможности применения хитозанов и их производных в различных отраслях деятельности человека далеко не исчерпаны. Их число и направленность действия непрерывно возрастают по мере дальнейшего изучения свойств этих биополимеров.

Актуальным является использование наиболее перспективного сырьевого источника, а именно - подмора пчел, для выделения хитина, хитозана и сопутствующего ему ценного биологически активного вещества - меланина, и разработка на его основе технологии получения препаратов с максимальным сохранением комплекса природных соединений (Комаров, 2003). За счет широкого распространения пчеловодства в нашей стране - по состоянию на 2005 г. в РФ во всех категориях хозяйств имелось 5,5 млн. пчелиных семей, существует возможность получать хитиновое сырьё (подмор пчел) в значительных масштабах (от 6 до 10 тысяч тонн в год). Весьма мало изученным является влияние комплексного воздействия хитозана и меланина на молодняк с.-х. животных в качестве биологически активной добавки, предотвращающей или смягчающей протекание желудочно-кишечных заболеваний.

Цель - разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из побочного продукта пчеловодства - подмора пчел с последующей разработкой на их основе нового биологически активного препарата для профилактики заболеваний и дисфункций желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных.

Задачи исследования:

1. Разработать рациональную технологию получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл, обеспечивающую более высокий выход хитозана и меланина.

2. Изучить физико-химические характеристики, токсичность хитозан-меланинового комплекса.

3. Разработать рецептуру экспериментального комплексного препарата с полифункциональными свойствами на основе хитозан-меланинового комплекса с включением сухих экстрактов фитосборов.

4. Провести исследования биологической эффективности хитозан-меланинового комплекса и комплексного экспериментального препарата на его основе при выпаивании их молодняку сельскохозяйственных животных.

5. Определить рациональные сроки и оптимальные дозы выпаивания хитозан-меланинового комплекса и комплексного препарата на его основе для молодняка различных видов сельскохозяйственных животных.

6. Определить экономическую эффективность, экологическую безопасность хитозан-меланинового комплекса и комплексного препарата на его основе при применении его в ветеринарии.

Научная новизна. Разработана малостадийная, экологически безопасная технология получения хитозан-меланинового комплекса (ХМК) из подмора пчёл, позволяющая с наименьшими энергетическими затратами при использовании 10% р-ра NаОН, 78-82 °С, экспозиции 1,5-2,0 ч в стадии депротеинирования и 30% р-ра NаОН, 90-95 °С, 1,5-2,0 ч - в стадии дезацетилирования выделить 22,4% ХМК и 6,4% меланина от исходного сырья. При этом хитозан имеет степень дезацетилирования 82-89%, меланин содержит 1•10¹⁷спин активных парамагнитных центров на 1 г сухого вещества, что подтверждает высокую биологическую активность полученных веществ. Новизна предложенных технологических решений подтверждена патентом на изобретение № 2382051, приоритет от 21.07.2010, опубл. 20.02.2010 г.

Впервые получены ИК-характеристики, изучен микроэлементный состав, определен класс токсичности ХМК.

Установлено, что использование ХМК снижает в кишечнике молодняка с.-х. животных количество бактерий рода Escherichia сoli, Proteus, Citrobacter, предупреждает возникновение желудочно-кишечных заболеваний, повышает неспецифическую резистентность организма животных, сохранность и живую массу в раннем возрасте. Предложена рецептура нового комплексного препарата на основе ХМК с включением экстрактов фитосборов.

Практическая значимость работы. Получены экспериментальные данные по оптимизации стадий технологии получения хитозан-меланинового комплекса, открывающие перспективы его использования в животноводстве. Разработана рецептура препарата на его основе с использованием экстрактов фитосборов. Для производства хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел разработаны ТУ на ХМК, утвержденные Министерством сельского хозяйства и центром стандартизации и метрологии Ставропольского края.

Разработаны Методические указания и временная инструкция по применению хитозан-меланинового комплекса на молодняке сельскохозяйственных животных, утвержденные на ученом совете ГНУ Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства (протокол № 4 от 4 мая 2009 года) и секции кормления Отделения зоотехнии Россельхозакадемии (протокол № 3 от 3 ноября 2009 года). Результаты диссертационной работы используются в производственной деятельности хозяйств Ставропольского края: ЗАО «им. Кирова» Труновского района, СПК колхозе «Новомарьевский» Шпаковского района, опытной станции ГНУ Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства (СНИИЖК) и подтверждены актами о внедрении.

Работа выполнена согласно Государственному тематическому плану научных исследований ГНУ СНИИЖК в лаборатории биологически активных веществ отдела биотехнологии по заданию 06.03.02.02: «Разработать новые препараты биологически активных веществ, пробиотиков и способы регуляции биосинтеза основных компонентов животноводческой продукции, обеспечивающие повышение продуктивности и резистентности сельскохозяйственных животных и улучшения биологической полноценности продукции» - № Госрегистрации 15070.4003005276, 06.8.002.6.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработаная малостадийная, экологически безопасная технология получения биологически активных веществ из подмора пчёл, обеспечивает выход хитозан-меланинового комплекса - 22,4% и меланина - 6,4%;

- ХМК стабилен, однороден по составу, не токсичен, не содержит патогенной микрофлоры; хитозан имеет степень дезацетилирования - 82-89%, меланин - 1•10¹⁷спин активных парамагнитных центров на 1 г сухого вещества;

- применение хитозан-меланинового комплекса на молодняке с.-х. животных в дозе 15 мг/кг живой массы 2 раза в день снижает содержание в кишечнике бактерий рода E. сoli, Proteus, Citrobacter на 37,9-68,9%, предупреждает возникновение желудочно-кишечных заболеваний в 6,7-20,0% случаев, повышает естественную резистентность, сохранность животных на 9,4-50% и их живую массу в раннем возрасте на 5,1-41,7%;

- использование ХМК и экспериментального препарата на его основе в животноводстве экономически выгодно, и позволяет получить дополнительную продукцию за счет лучшей сохранности и развития молодняка с.-х. животных.

Апробация работы. Результаты работы представлены на: V Международной конференции «Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных» (23-24 ноября, Ставрополь, 2007 г.); IХ Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (13-17 октября, Ставрополь, 2008 г.); Международной научно-практической конференции «Инновация в аграрном секторе Казахстана, посвящённая 75-летию академика К.С. Сабденова» (15-16 ноября, Казахстан, Алматы, 2008 г.); Юбилейной Международной 2-ой научно-практической конференции, посвященной 40-летию образования Северо-Кавказского НИИ животноводства «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных» (23-24 марта, Краснодар, 2009 г.). Результаты работы представлены на 3 международных выставках: Международной выставке-конгрессе Высокие технологии. Инновации. Инвестиции (22-25 сентября, Санкт- Петербург, 2008 г.); 2-й Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2008» (5-7 ноября, Москва, 2008 г.); Международном салоне инноваций и инвестиций (26-28 августа, ВВЦ Москва, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, включая 1 патент на изобретение и 1 статью в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2 глав собственных исследований, выводов, предложений производству, списка использованных литературных источников, приложений. Работа изложена на 164 страницах, содержит 21 рисунок, 29 таблиц. Библиографический список состоит из 139 наименований, в том числе 16 зарубежных.

2. Объект и методы исследований

Объектом исследований явился хитозан-меланиновый комплекс, полученный из подмора пчёл. В качестве сырьевого поставщика хитина и хитозана рассматривали медоносную пчелу, которая может обеспечить большую биомассу хитинсодержащего сырья. В качестве сырья сравнивались образцы пчелиного подмора, взятого после весенней ревизии ульев 2006 г (I), 2007 г. (II) и летней профилактической чистки 2007 г. (III).

Научно-производственные опыты по изучению эффективности полученного ХМК, а также ХМК в составе разработанного экспериментального препарата (ЭП) для профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка с.-х. животных проводилось в хозяйствах и организациях Ставропольского края. Общая схема проведения исследований представлена на рисунке 1.

Для разработки технологии получения ХМК, подмор пчел исследовали с помощью общепринятых методик: определение влажности, определение содержания общего азота, белка, липидов, макро- и микроэлементного состава.

Аминокислотный состав полученного хитозан-меланинового комплекса исследовали методом ионообменной колоночной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-339М (Чехия) по ГОСТ 13496 21-87. ИК-спектры полученных образцов ХМК и меланина снимали на комплексе ИК-Фурье спектрометра Scimitar 800 с ИК приставкой Miracle в диапазоне волновых чисел 4000 - 500 см^-1. Интерпретацию ИК-спектров проводили с помощью автоматизированных библиотек ИК-cпектров Omnic, Varian, IR-Search Master. Степень дезацетилирования хитозана определяли с помощью полученного ИК-спектра по методу Бакстера. ЭПР-спектр ХМК, хитозана и меланина снимали на радиоспектрометре 3-см диапазона Е-3 фирмы «Varian» с частотой В4 - модуляции 100 кГц. Определение числа радикалов в образце проводили при зарегистрированном спектре ЭПР монокристалла двуводного хлорида меди с известным количеством парамагнитных центров, согласно с инструкцией для эксплуатации прибора.

Определение g-фактора наблюдаемого сигнала проводили при использовании в качестве стандарта порошка оксида магния, содержащего примесь ионов марганца.

Рис. 1. Общая схема исследований по получению ХМК и меланина, разработке препарата на основе ХМК и испытанию эффективности их воздействия на животных

Стерильность ХМК на контаминацию бактериальной и грибковой микрофлорой проверяли при нанесении препарата на питательные среды: мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ) по ГОСТ 28085-89 с последующим термостатированием. Определение острой токсичности полученного ХМК проводили по ГОСТ 12.1.007-76 на лабораторных белых мышах. По результатам опыта определяли LD₅₀ по формуле Кербера. Безвредность полученного биологически активного вещества определяли путём однократного введения максимально допустимой дозы раствора этого вещества внутрибрюшинно лабораторным животным (кроликам) согласно Методическим указаниям (МУ 2.1.5.720-98).

Для приготовления экспериментального препарата на основе ХМК использовали следующие готовые формы: глюкозу кристаллическую, лактозу моногидратную, бифидумбактерин из Bifidobacterium bifidum, штаммы № 1, 791 или ЛВА-3, содержащий не менее 5Ч10⁸ живых бифидобактерий и 0,85 г лактозы, сухой, витамин С, сухой экстракт красавки, сухой экстракт коры дуба, сухой экстракт цветков ромашки аптечной, сухой экстракт корневища лапчатки прямостоячей.

Изучение эффективности ХМК в чистом виде, а также в составе разработанного экспериментального препарата для профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка с.-х. животных проводили по схемам, представленным в таблице 1.

С целью изучения эффективности исследуемых препаратов на организм животных и выявления их влияния на общие процессы, протекающие в организме под их влиянием, проводили биохимические и иммунологические исследования крови опытных животных, определяли интенсивность их роста и развития.

Уровень гемоглобина и количество эритроцитов животных определяли с помощью фотоэлектрического эритрогемометра (МРТУ-24-1443161) по методу И.И. Сипко (1968). Подсчёт количества лейкоцитов проводили в камере Горяева по общепринятой методике. Уровень общего белка в сыворотке крови животных проводили рефрактометрическим методом на рефрактометре RL 140 (POLAND). Содержание белковых фракций в сыворотке крови определяли турбодиметрическим (нефелометрическим) способом по И.П. Кондрахину (2004). Фагоцитарную активность нейтрофилов, бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови (БАСК, ЛАСК) исследовали в соответствии с Методическими рекомендациями по определению естественной резистентности животных (1987) с использованием соответственно тест-культур Staphylococcus aureus, Escherichia сoli (серотип О₂), Micrococcus lisodecticus. Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли методом Дижона с помощью фотоэлектроколориметра "ФЭК-56М". Бактериологические исследования микрофлоры кишечника животных на присутствие и количество E. сoli, Proteus, Citrobacter проводили согласно Методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза (1991).

Таблица 1 - Схемы выпаивания ХМК и ЭП новорожденным телятам, поросятам, козлятам и поросятам в период отъема

Группа, препарат	Количество, голов	Схема применения препарата
новорожденные телята
Опытная I, ХМК	15	10 мг ХМК на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней
Опытная II, ХМК	15	15 мг ХМК на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней
Опытная III, ЭП	15	ЭП (по 15 мг ХМК) на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней
Контрольная	15	-
новорожденные поросята
Опытная I, ХМК	15	10 мг ХМК на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней
Опытная II, ХМК	15	15 мг ХМК на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней
Опытная III, ЭП	15	ЭП (по 15 мг ХМК) на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней
Контрольная	15	-
поросята в период отъема
Опытная I, ХМК	16	10 мг на кг живой массы 2 раза в день в течение 7 суток
Опытная II, ХМК	16	15 мг на кг живой массы 2 раза в день в течение 7 суток
Контрольная	16	-
новорожденные козлята
Опытная I, ХМК	10	10 мг на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней
Опытная II, ХМК	10	15 мг на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней
Опытная III, ЭП	10	ЭП (по 15 мг ХМК) на 1 кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней
Контрольная	10	-

Интенсивность роста и развития и живую массу молодняка опытных групп определяли путем индивидуального взвешивания через каждые 30 дней. Среднесуточный прирост определяли расчетным путем. Термометрию опытных животных проводили с помощью электронного термометра «Microlife» (Швеция) ректально. Полученные результаты обрабатывали на компьютере "Pentium-4" методами биометрической статистики с использованием пакета прикладных программ "Biostat" и "Exel".

Разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса и меланина

В результате проведенных исследований установлено, что количество белка и минеральных веществ в исследованных образцах пчелиного подмора стабильно и не зависит от места происхождения, времени и года сбора, что позволило разработать общую технологию получения из него биологически активных веществ. Отсутствие липидов в исходном сырье дало возможность не проводить процесс обезжиривания.

Интенсифицирован процесс экстракции хитин-меланинового комплекса из пчелиного подмора увеличением степени его дисперсности. Установлено, что при влажности 4-6% происходит его наиболее эффективное измельчение до размера частиц 0,1-0,3 мм.

Для оптимизации параметров и количества промежуточных стадий технологического процесса были проведены многофакторные эксперименты с варьированием концентрации гидролизата, изменением пропорций реагентов, температуры и времени проведения реакций депротеинирования и дезацетилирования. В качестве изучаемых факторов оптимизации были исследованы жидкостные модули (ЖМ) подмор: гидролизат - р-р NaOH (1:10, 1:25) и концентрации NaOH (3, 10 и 15%) для проведения реакции депротеинирования. При проведении дезацетилирования исследованы жидкостные модули 1:15 и 1:25, концентрации NaOH (30 и 50%), проведение реакции в жестких условиях при нагревании до температуры 94-98 °С - «горячий способ» и в мягких условиях при комнатной температуре не ниже 20-22 °С - «холодный способ» дезацетилирования (табл. 2). Впервые проведено получение ХМК из пчелиного подмора без разделения стадий депротеинирования и дезацетилирования при «горячем» и «холодном» способах дезацетилирования.

Таблица 2 - Характеристика ХМК из пчелиного подмора при его получении без разделения стадий депротеинирования и дезацетилирования и использовании «горячего» и «холодного» способов дезацетилирования

Способ дезацетилирования (ЖМ=1:25)	Выход ХМК, % от mподм.	Содержание общего азота в ХМК	Меланин в ХМК, % от mХМК	Выход меланинов, % от mподм.
горячий	22,4±0,1	3,9±0,2	7,1*±1,2	6,4*±0,3
холодный	20,7±0,1	5,1±0,3	10,4±1,6	3,9±0,3

В результате разработки технологического процесса получения ХМК было выделено еще одно биологически активное вещество - меланин, в качестве сопутствующего продукта. Меланин осаждали из гидролизатов, сохраненных после проведения «горячего» и «холодного» способа дезацетилирования, используя 33% соляную кислоту.

При получении меланина из отходов щелочного гидролиза пчелиного подмора использовали реакцию нейтрализации гидроксида натрия соляной кислотой, в результате которой образуется соль NaCl и вода. Таким образом, помимо получения ещё одного важного биологически активного вещества, в разработанной технологии отработана подготовка отходов производства к их экологически безвредному сливу.

В соответствии с поставленной целью и задачами, разработана технология получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из подмора пчел, которая включает 6 стадий получения ХМК и 4 стадии получения меланина (рис. 2).

Рис. 2. Схема проведения технологического процесса получения ХМК и меланина из подмора пчел

Наиболее оптимальным и экономически эффективным (табл. 3) представляется получение ХМК при использовании 30% NaOH для проведения дезацетилирования при температуре 90-95 °С и ЖМ=1:25. Выход хитозан-меланино-вого комплекса при этом составляет 22-24% от исходного сырья (по сравнению с существующими 12% хитозана из других видов хитинсодержащего сырья). Общий выход меланина - 6,4% от его содержания в пчелином подморе.

Таблица 3 - Характеристика хитозан-меланинового комплекса при его получении «горячим» способом и различных начальных условиях

ЖМ	Выход ХМК, %	Содержание азота, %	Выход меланина, %
концентрация NaOH 30% при дезацетилировании
1:15	18,6±0,9	3,7±0,2	6,2±0,2
1:25	22,4±1,1	3,9±0,2	6,4*±0,2
концентрация NaOH 50% при дезацетилировании
1:15	20,2±1,0	3,6±0,2	6,3±0,2
1:25	19,0±0,9	3,7±0,2	6,1±0,2

Исследования полученных хитозан-меланинового комплекса и меланина

При проведении идентификации ИК-спектров экспериментальных образцов хитозан-меланинового комплекса регистрировались полосы поглощения сопряженных углеродных связей при 1650 см^-1, карбоксильных - 1736 см^-1 и 1712 см^-1, гидроксильных - 3288 см^-1 и 1170 см^-1, валентных колебаний метильных и метиленовых групп в области 2900-2800 см^-1, амидных групп в области 3460 см^-1 и деформационных колебаний аминогруппы - 1600см^-1, что подтвердило их групповую принадлежность к хитозану и меланинам животного происхождения (рис. 3).

Исследованные ИК-спектры полученных хитозан-меланинового комплекса и меланина и взятые из разных образцов, полученных в разное время, полностью совпадают, несмотря на применяемый в ИК-Фурье - спектроскопии метод микропроб, что свидетельствует об однородности получаемых веществ. Данные ИК-спектроскопии могут быть использованы для подтверждения подлинности препарата. Рассчитанная по соотношению величин полос поглощения аминогруппы и амидной группы степень дезацетилирования полученного хитозан-меланинового комплекса равна 82-89%.

Рис. 3. ИК-спектр а) хитозан-меланинового комплекса; б) меланина, полученных из подмора пчел

Присутствие в структуре меланина неспаренных электронов было показано с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса.

Снятый спектр ЭПР меланина, полученного из подмора пчёл (рис. 4), совпадает со спектрами меланинов другого природного происхождения, представленных в литературных источниках. Для определения g-фактора наблюдаемого сигнала в качестве стандарта использовали порошок оксида магния, содержащий примесь ионов марганца. Найденный g-фактор сигналов меланина составляет 2,0037. Рассчитанное количество парамагнитных центров составляет 1•10¹⁷ на 1 г меланина.



Спектр ЭПР хитозан-меланинового комплекса зафиксировать не удалось, что может свидетельствовать о том, что при образовании комплекса с хитозаном, меланин расходует свои неподелённые электроны на образование связи. Снятый спектр ЭПР хитозана, освобождённого от меланина воздействием на него перекиси водорода, выглядит как большой бесструктурный синглет.

Полученный хитозан-меланиновый комплекс был исследован на острую токсичность, как препарат, который предполагается использовать в ветеринарных целях при пероральном способе введения. Действие его, по существующим данным, основано на способности обволакивать стенки желудка и кишечника, препятствуя тем самым воздействию болезнетворных микроорганизмов. В соответствии с результатами исследований и по принятым классификациям, хитозан-меланиновый комплекс из подмора пчел является малотоксичным веществом и по ГОСТ 12.1.007-76 относится к 4 классу веществ по степени опасности и токсичности.

Методами бактериологического анализа не выявлено присутствие в комплексе и меланине микроорганизмов рода сальмонелл, протея, золотистого стафилококка, кишечной и синегнойной палочки, а также токсинообразующих анаэробов и дрожжей рода Candida. Поэтому хитозан-меланиновый комплекс, являясь биологически активным веществом, может быть использован в ветеринарии, как основа препаратов для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний различной этиологии, а также при изготовлении ранозаживляющих мазей.

Разработка рецептуры экспериментального препарата на основе хитозан-меланинового комплекса

Полученные данные позволили без ограничений использовать полученный ХМК в качестве биологически активного вещества и основы экспериментального препарата (ЭП), поддерживающего необходимый положительный бактериальный баланс кишечника молодняка с.-х. животных, способствующего снижению количества его условно-патогенной микрофлоры и повышающего общую резистентность организма на молодняке: поросятах, телятах и козлятах, что было подтверждено при проведении производственных экспериментов на животных.

Разработанная рецептура ЭП на основе ХМК с включением биологически активных веществ и культур микроорганизмов для профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных, представлена в таблице 4.

Рассчитано количественное содержание ингредиентов препарата по всем компонентам сухого препарата и разбавителя на 1 день профилактического курса для одного животного, по разным видам животных. Разработаны методические указания и временная инструкция по применению хитозан-меланинового комплекса на молодняке с.-х. животных в качестве биологически активной кормовой добавки.

Производственные испытания эффективности хитозан-меланинового комплекса и экспериментального препарата на его основе

Установлено, что использование ХМК и экспериментального комплексного препарата на его основе способствовало снижению заболеваемости желудочно-кишечного тракта молодняка животных в ранний период жизни (табл. 5).

Учитывая, что основным путем микробного заражения является алиментарный, было проведено изучение влияния применения хитозан-меланинового комплекса на микробный состав кала с целью установления содержания условно-патогенной микрофлоры в кишечнике телят.

Таблица 4 - Рецептура экспериментального комплексного препарата на основе хитозан-меланинового комплекса

№ п/п	Наименование компонента, производитель	Количество на 1 кг живой массы, г	Соотношение компонентов, %
1	Хитозан-меланиновый комплекс, опытные образцы лаборатории БАВ ГНУ СНИИЖК	0,015	1
2	Глюкоза кристаллическая («Профифарм», Москва)	0,25	20
3	Лактоза моногидратная («Профифарм», Москва)	0,12	9
4	Бифидумбактерин из Bifidobacterium bifidum, штаммы №1, 791 или ЛВА-3, содержащий не менее 5Ч108 живых бифидобактерий и 0,85 г лактозы, сухой (НПО «Аллерген», Ставрополь)	0,2	16
5	Витамин С («МСД», Москва)	0,02	2
6	Сухой экстракт красавки («Фитоника», Краснодар)	0,02	1
7	Сухой экстракт коры дуба («Фитоника», Краснодар)	0,15	12
8	Сухой экстракт цветков ромашки аптечной (ООО «КиТ», Алтайский край, Бийск)	0,25	19
9	Сухой экстракт корневища лапчатки прямостоячей (ООО «КиТ», Алтайский край, Бийск)	0,255	20
Всего	1,28	100,0

Выявлено, что в кишечнике телят I, II опытных групп после выпойки препарата произошло снижение количества микроорганизмов E.сoli соответственно на 68,9% и 43,2%, бактерий рода Proteus - 40,0 и 43,8% и Citrobacter - 37,9% (I группа), в то время как в контрольной группе данные показатели снизились лиш ь на 20,4; 26,9 и 29,6% (табл. 6).

Анализ гематологических и биохимических показателей крови телят (рис. 5) выявил проявление стимулирующего эффекта хитозан-меланинового комплекса на факторы неспецифической резистентности уже на 14 сутки после его использования. В крови животных опытных групп на 33,5% и 38,1% (Р<0,05) соответственно было меньше содержание лейкоцитов, чем у телят контрольной группы.

Таблица 5 - Эффективность применения хитозан-меланинового комплекса и препарата на его основе для профилактики заболеваний ЖКТ у телят, поросят и козлят

Показатели	Группы
	контрольная	I опытная 10 мг ХМК	II опытная 15 мг ХМК	III опытная ЭП (12 мг ХМК)
новорожденные поросята (по 15 гол.)
Заболело, всего гол./	5	4	3	1
%	33,3	26,6	20,0	6,7
из них пало, гол.	4	2	2	1
Сохранность, %	73,3	86,6	86,6	93,3
Профилактическая эффективность, %.	_	6,7	13,3	26,6
новорожденные козлята (по 10 гол.)
Заболело всего, гол.	6	3	3	1
%	60,0	27,2	30,0	10,0
в т.ч. от заболеваний ЖКТ, гол.	4	2	2	1
%	40,0	18,2	20,0	10,0
из них пало, гол. в т.ч. от заболеваний ЖКТ	5 3	2 1	3 2	0 0
Сохранность, %	50,0	80,0	70,0	100,0
Профилактическая эффективность, %.	_	21,8	20,0	30,0
новорожденные телята (по 15 голов)
Заболело, гол. %	4 57,1	2 28,5	2 28,5	-
в т. ч. легкой формой тяжелой формой	3 1	2 -	2 -	-
Период заболевания после рождения, сут.	2,5	4,5	4,0	-
Продолжительность болезни, сут.	4,5	3,7	4,0	-
Профилактическая эффективность, %.	-	28,6	28,6	-
поросята в период отъема (по16 голов)
Заболело, гол.	6	5	4	-
%	37,5	31,2	25,0	-
из них пало, гол.	3	2	1	-
Сохранность в 3-х мес., %	81,2	87,5	93,7	-
Профилактическая эффективность, %.	-	6,3	12,5	-

В то же время телята опытных групп выделялись по увеличению в крови концентрации гемоглобина, общего белка, г-глобулинов. Разница в их пользу по сравнению с контролем соответственно составляла по группам 4,0; 12,1%; 9,7; 10,5%; 27,7 (Р<0,05) и 34,9% (Р<0,05).

Таблица 6 - Влияние применения хитозан-меланинового комплекса на микрофлору кишечника телят

Микроорга-низмы рода, 105 КОЕ*/г	Контрольная	Опытные
	начало опыта	через 29 дней	I	II
			начало опыта	через 29 дней	начало опыта	через 29 дней
E.сoli	9,8±0,89	7,8±0,61	8,7±0,57	2,7±0,36	10,4±1,12	5,9±0,63
Proteus	5,2±0,52	3,8±0,59	5,9±0,49	3,6±0,44	4,8±0,43	2,7±0,29
Citrobacter	2,7±0,19	1,9±0,36	2,9±0,34	1,8±0,27	2,1±0,22	1,6±0,17

Примечание:* - КОЕ - колониеобразующие единицы.

Рис. 5. Разница по биохимическим показателям крови новорожденных телят при применении ХМК и ЭП

Одновременно гуморальное звено иммунной системы отреагировало увеличением показателей лизоцимной и бактерицидной активности сыворотки крови, уровень которых повысился по сравнению с контролем на 4,4; 6,7%; и 29,8 (Р<0,05); 1,0%. Следует отметить десенсибилизирующее свойство хитозана, проявившееся существенным снижением в крови животных первой и второй опытных групп по сравнению с контролем циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) на 6,1% и 35,8% (Р<0,01).

Анализ биохимических показателей крови новорождённых поросят (рис. 6) выявил, что поросята опытных групп (I, II, III) превосходили животных контрольной группы по содержанию гемоглобина соответственно на 7,9, 14,6 и 15,8% (Р<0,05). По уровню общего белка, бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови разница была также в пользу опытных групп и составила соответственно 14,2, 25,1 (Р<0,01) и 21,5% (Р<0,01); 11,7, 16,3 (Р<0,05) и 9,6%; 6,8, 11,1 и 8,1% (Р<0,05). Кроме того установлено, что у особей II и III опытных групп выявлено меньшее содержание лейкоцитов на 10,2, 16,8 и 14,0 % (Р<0,05). Достоверной разницы в концентрации белковых фракций сыворотки крови между группами не отмечено.

Аналогичные результаты получены при анализе эффективности применения ХМК поросятам в период их отъёма, являющегося стрессовым для молодняка.

Рис. 6. Разница по биохимическим показателям крови новорожденных поросят при применении ХМК и ЭП

Выпаивание поросятам комплекса имело положительную тенденцию по изменению уровня общего белка, гамма-глобулинов, бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови. Разница была в пользу опытных животных соответственно на 22,7 и 27,9% (Р<0,05); 31,9 (Р<0,01) и 21,2% (Р<0,05); 29,8 (Р<0,01) и 6,9%; 13,8 и 11,9% (Р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 7).

Рис. 7. Разница по биохимическим показателям крови поросят в период отъема при применении ХМК

Анализ экспериментальных данных (рис. 8) показал, что у новорожденных козлят опытных групп достоверно повышалось содержание гемоглобина, лизоцимная, бактерицидная активность сыворотки крови и фагоцитарная активность нейтрофилов в среднем соответственно на 11,4, 10,3, 35,4 и 56,3%.

Помимо положительного влияния на факторы неспецифической защиты организма выпойка ХМК и ЭП молодняку животных стимулировала увеличение живой массы и среднесуточных привесов в ранний период онтогенеза.

Так, у телят разница в пользу молодняка опытных групп по отношению к животным контрольной группы после использования препарата составила соответственно: через 30 дней 15,7 (Р<0,05); 8,6 (Р<0,05) %; и 7,0; 7,3 % и через 60 дней 6,05; 8,75 (Р<0,05); и 3,27; 8,09%.



Рис. 8. Разница по биохимическим показателям крови новорожденных козлят при применении ХМК и ЭП

Молодняк опытных групп у новорожденных поросят на 30 день после выпаивания, по сравнению с аналогами из контрольной группы, имел больше живую массу на 3,3, 6,4 и 8,4% (Р<0,05). Тенденция сохранилась и в последующие периоды онтогенеза: разница в их пользу в 2-х и 3-х месячном возрасте в среднем составляла 2,7 и 4,7% (Р<0,05), что обусловлено большими среднесуточными привесами в среднем на 5,3%.

Использование ХМК, по-видимому, положительно повлияло на адаптацию поросят в стрессовый период отъёма, что о чём свидетельствует динамика их живой массы и среднесуточных привесов. Так, молодняк опытных групп уже на 30 день после стимуляции по сравнению с поросятами из контрольной группы имел больше живую массу на 1,9 и 2,4% (Р<0,05). Более заметная разница в пользу опытных групп отмечена в 3-х месячном возрасте соответственно на 4,8 и 3,6% (Р<0,01) за счет большей энергии роста поросят в среднем на 7,7% (Р<0,05).

Анализ динамики живой массы козлят до 2-х месячного возраста выявил, что применение хитозан-меланинового комплекса и экспериментального препарата на его основе оказывало стимулирующее влияние на рост козлят. В самый ранний период онтогенеза (до 20 дней) наибольшая разница отмечена между контрольными животными и козлятами II и III групп: на 25,6 и 18,1% (Р<0,01). В дальнейшем - в 40 дней и два месяца, животные опытных групп практически не отличались по живой массе между собой, достоверно (Р<0,01) превосходя козлят из контрольной группы в среднем на 30,2% и 32,1%. При этом, во все учтенные периоды животные опытных групп отличались от контрольных значительно большими среднесуточными приростами, в среднем на 47,9, 98,2 и 35,6% (Р<0,01).

Расчет экономической эффективности

Расчеты затрат на получение ХМК и меланина, учитывая применение лабораторного оборудования, которое было использовано при разработке способа получения ХМК, показали, что себестоимость 1г ХМК составляет 0,81 руб., а меланина - 0,93 руб.

Расчет экономической эффективности применения ХМК и ЭП, рекомендуемых для профилактики расстройств желудочно-кишечного тракта различной этиологии у молодняка с.-х. животных, возникающих в процессе их выращивания, показывает их применение экономически обоснованным и составляет дополнительную прибыль:

365,60 и 518,04 руб. на одного поросёнка при выпаивании ХМК и ЭП соответственно в новорождённом возрасте;

432,63 руб. на одного поросёнка при выпаивании ХМК при отъёме;

124,0 и 224,4 руб. на одного козлёнка при выпаивании ХМК и ЭП соответственно;

261,58 рубля на 1 телёнка.

При этом важно учитывать отсутствие расходов на лечение животных синтетическими препаратами (антибиотики, сульфаниламиды и т.д.) и, в связи с этим, повышение биогенной полноценности и биологической безопасности животноводческой продукции.

1. Разработана рациональная, экологически безопасная технология получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из подмора пчел, обеспечивающая выход хитозана 20,0-22,4% от исходного сырья, имеющего степень дезацетилирования 82-89%; выход меланина - 6,4% с количеством активных парамагнитных центров 1•10¹⁷спин на 1 г сухого вещества.

2. На основании исследований ИК- и ЭПР-спектров определены характеристики хитозан-меланинового комплекса и меланина для их стандартизации и подтверждения подлинности.

3. Токсикологические исследования позволили отнести хитозан-меланиновый комплекс к малотоксичным веществам и по ГОСТ 12.1.007-76 к 4 классу веществ по степени опасности и токсичности, соответствующему требованиям безопасности к кормовым добавкам. Микробиологические исследования не выявили присутствия в ХМК и меланине патогенной микрофлоры.

4. Обнаружено, что применение ХМК при выпойке их телятам приводит к значительному снижению количества бактерий рода E. сoli, Proteus, Citrobacter соответственно на 68,9; 40,0 и 37,9%, что обосновывает целесообразность его использования для профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота.

5. Экспериментально установлено, что оптимальной схемой применения ХМК является: доза 15 мг на 1 кг живой массы животного; кратность применения - 2 раза в сутки; продолжительность выпаивания - 10 дней, что позволяет снизить возникновение желудочно-кишечных расстройств у телят, поросят и козлят в раннем возрасте и повысить их сохранность соответственно на 28,6, 13,3 и 20,0%%.

6. Выявлено, что применение ХМК оказывает положительное влияние на гематологические показатели крови и уровень естественной резистентности молодняка с.-х. животных. Выявлено достоверное повышение на 10,5-27,9 % общего белка сыворотки крови, 11,4-12,1% гемоглобина, 6,7-13,8% лизоцимной, 16,3-35,4% бактерицидной и 56,3% фагоцитарной активности.

7. Обнаружено, что использование ХМК и препарата на его основе способствует увеличению среднесуточных привесов у телят, поросят и козлят на 8,7; 5,3 и 34,1% и увеличению их живой массы в раннем возрасте на 8,1; 3,6 и 30,2% соответственно.

8. Применение ХМК и ЭП для выпойки молодняка с.-х. животных является экономически обоснованным. Дополнительная прибыль составляет:365,60 и 518,04 руб. на одного поросёнка при выпаивании ХМК и ЭП соответственно в новорождённом возрасте; 432,63 руб. - при отъёме; 197,12 руб.;124,0 и 222,4 руб. на одного козлёнка при выпаивании ХМК и ЭП и 261,58 руб. на одного телёнка в новорожденном возрасте соответственно.

Предложения производству

1. Научно-производственным лабораториям, малым предприятиям биологической промышленности использовать разработанную технологию получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из подмора пчел и научно-техническую документацию.

2. Для профилактики желудочно-кишечных заболеваний, повышения естественной резистентности, сохранности и живой массы молодняка с.-х. животных проводить выпойку новорождённым животным и в период отъема хитозан-меланиновым комплексом дозе 15 мг на 1 кг живой массы 2 раза в сутки в течение 10 дней.

хитозан меланиновый ветеринария животное

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Погарская, Н.В. Получение хитозан - меланинового комплекса из подмора пчел и определение его физико-химических и биологических характеристик / Н.В. Погарская, М.И. Селионова, В.В. Бинатова // Ветеринария и кормление. - 2008. - № 12. - С. 28-29.

2. Погарская, Н.В. Хитозан-меланиновый комплекс из подмора пчёл / Н.В. Погарская, М.И. Селионова // Пчеловодство. - 2008. - № 9. - С.46-47.

3. Селионова, М.И. Влияние хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел на резистентность и развитие поросят / М.И. Селионова, Н.В. Погарская, М.И. Коваленко // Свиноводство. - 2009. - № 3. - С. 28-32.

4. Патент № 2382051 РФ Способ получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл / М.И. Селионова, Н.В. Погарская. - Приоритет от 21.07.2008; опубл. 20.02.2010. - Бюл. № 5.

5. Погарская, Н.В. Получение хитозан-меланиновоо комплекса из подмора пчёл и его использование для профилактики дисбактериоза молодняка животных / Н.В. Погарская, М.И. Селионова // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы IХ Междунар. конф. 13-17 окт. Ставрополь, 2008 г. Москва: Изд-во ВНИРО. - 2008. - С. 188-191.

6. Погарская, Н.В. Инновационные технологии получения хитозан - меланинового комплекса и изучение его свойств на молодняке с.-х. животных / Н.В. Погарская, М.И. Селионова // Матер. междунар. научно-практич. конф.: Инновация в аграрном секторе Казахстана, посвящённая 75-летию академика К.С. Сабденова. Казахстан. Алматы. КазГАУ. - 2008. - Т.1. - С. 373-379.

7. Селионова, М.И. О технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл и его использование для профилактики дисбактериоза телят / М.И. Селионова, Н.В. Погарская // Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных: Сб. науч. трудов по материалам V Междунар. конф. (Ставрополь 23-24 ноября 2007 г.). - 2007. - Ставрополь: Изд-во Аргус. - С. 398-402.

8. Селионова, М.И. Использование хитозан-меланинового комплекса на поросятах разного возраста / М.И. Селионова, Н.В. Погарская, М.И. Коваленко // Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных: Сб. науч. трудов юбилейной междунар. (2-ой) научно-практич. конф., посвященной 40-летию образования СКНИИЖ. Краснодар. - 2009. - Ч. 2. - С. 225-228.

Размещено на Allbest.ru

...