Взаимодействие возбудителей острых гнойных инфекций in vitro и in vivo с факторами естественной резистентности организма животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСТРЫХ ГНОЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ in vitro и in vivo С ФАКТОРАМИ ЕСТЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНЫХ

Шибаева Мария Александровна

Саратов - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

высшего профессионального образования «Саратовский государственный технический университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Тихомирова Елена Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич

доктор медицинских наук

Плотников Олег Петрович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Оренбургский государственный университет»

Защита состоится «25» февраля 2010 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный агарный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан « » 2010 г. и размещен на сайте университета www.sgau.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 4100012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Карпунина Л.В.

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение биологических особенностей возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных остается важнейшим аспектом современной прикладной микробиологии (Пюхлер, Хаккер, 2005; Vogt, Mahan, 1998). Принципиально важными представляются сведения о некоторых видах стафилококков и энтеробактерий, потенциально опасных или условных патогенов, вызывающих острые гнойные процессы в организме человека и животных, что определяет непреходящий интерес к этим микроорганизмам со стороны широкого круга микробиологов (Ляшенко, 1995; Бондаренко, 1997; Дерябин, 2000; Roth, James, 1998). Актуальность этой проблемы обусловлена также формированием устойчивости этих бактерий к широкому спектру антибиотиков и совершенствованием способности к существованию и развитию во внутренней среде макроорганизма (Обгольц, 1992; Бухарин, Дерябин, 1997; Тихомирова, 2005; McManus, 1997).

Известно, что в иммунном ответе на ряд инфекционных агентов огромную роль играют начальные этапы инфекционного процесса, связанные с фагоцитарной активностью и формированием острой фазы воспалительной реакции, опосредованной синтезом провоспалительных цитокинов (Маянский, Пикуза, 1993; Сепиашвили, 2003; Фрейдлин, 2006; Agace, 1993). Традиционно неблагоприятное течение гнойно-воспалительного заболевания связывается со снижением уровня факторов естественной резистентности, нередко зависящих от способности возбудителя к их инактивации (Бухарин, Дерябин, 1996; Ефименко, 1999).

Развитие инфекционного процесса, особенно на начальных его этапах, во многом определяется активацией цитокиновой сети, для управления которой необходимо знание особенностей изменения цитокинового баланса при разных способах внедрения патогена в организм. Однако, сравнительные данные по индукции цитокинов при разных путях проникновения стафилококков и энтеробактерий в макроорганизм, а также воздействие провоспалительных цитокинов ex tempore in vivo на микроциркуляцию крови практически не описаны.

Вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования.

Цель работы: изучить активность механизмов фагоцитоза и индукцию цитокинов in vitro и in vivo при разных способах введения стафилококков и энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями.

Задачи исследования:

1. Определить основные свойства стафилококков, выделенных в монокультуре и в ассоциациях от животных с острыми гнойными инфекциями.

2. Изучить в условиях in vitro особенности фагоцитоза выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями стафилококков: Staphylococcus aureus 18, S. hyicus 12, S. epidermidis 6, S. saprophyticus 5, перитонеальными макрофагами белых мышей, активность механизмов кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга и индукцию основных провоспалительных цитокинов; продукцию оксида азота спленоцитами белых мышей.

3. Провести подкожное, внутримышечное и внутрибрюшинное заражение белых мышей стафилококками, выделенными от животных с острыми гнойными инфекциями: S. aureus 18, S. hyicus 12, S. epidermidis 6, S. saprophyticus 5, и определить содержание основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови; оценить активность некоторых ферментов белкового, углеводного и липидного обменов при моделировании стафилококковой инфекции.

4. Изучить в условиях in vitro особенности фагоцитоза энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями: Escherichia coli 34, Serratia sp. 3, Citrobacter sp. 1А, Enterobacter agglomerans 6, перитонеальными макрофагами белых мышей и индукцию основных провоспалительных цитокинов.

5. Провести подкожное и внутрибрюшинное заражение белых мышей энтеробактериями, выделенными от животных с острыми гнойными инфекциями: E. coli 34, Serratia sp. 3, Citrobacter sp. 1А, E. agglomerans 6, и определить содержание основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови.

6. Оценить действие ex tempore in vivo супернатанта среды культивирования перитонеальных макрофагов, фагоцитирующих S. aureus 18, и стандартных препаратов ИЛ-1б и ФНО-б на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс методом спекл-микроскопии.

Научная новизна. Установлено, что среди стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, в монокультуре чаще всего встречались S. aureus и S. hyicus, реже - S. epidermidis и S. saprophyticus; ассоциации были представлены преимущественно S. aureus и S. saprophyticus.

Выявлено, что процесс фагоцитоза S. saprophyticus 5 и E. сoli 34 в перитонеальных макрофагах белых мышей in vitro завершался к 24 часам; фагоцитоз других исследуемых бактерий носил частичный или незавершенный характер. Показано достоверное увеличение активности ферментов кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга, активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах и синтеза оксида азота спленоцитами мышей в процессе фагоцитоза S. aureus 18 в системе in vitro.

Впервые проведена оценка влияния стафилококков и энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, на содержание основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови лабораторных белых мышей при разных способах их заражения. Выявлено, что при внутрибрюшинном введении бактерий резко возрастает содержание основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови мышей через 6-24 часа, особенно при введении S. aureus 18 и E. coli 34. При подкожном и внутримышечном введении этих бактерий изменения концентрации цитокинов были достоверными, но менее выраженными.

При моделировании стафилококковой инфекции выявлены изменения метаболической активности организма экспериментальных животных, свидетельствующие о большей эффективности защитных реакций в случае введения S. saprophyticus 5 и менее скомпенсированном характере патологических изменений в случае заражения S. aureus 18.

Впервые методом спекл-микроскопии показано ex tempore in vivo усиление скорости кровотока в сосудах брыжейки белых крыс при нанесении супернатанта среды культивирования перитонеальных макрофагов, фагоцитирующих бактерии S. aureus 18, и стандартных препаратов ИЛ-1б и ФНО-б.

Практическая значимость работы. Полученные результаты имеют значение для расширения представлений о начальных этапах воспалительной реакции, вызванной возбудителями гнойных инфекций животных при разных путях их внедрения в макроорганизм. Содержащиеся в диссертационной работе данные могут быть использованы для дальнейших разработок в области изучения взаимодействия макро- и микроорганизмов. Показана возможность применения метода спекл-микроскопии для оценки действия различных цитокинов ex tempore in vivo на микроциркуляцию крови в исследовательской и диагностической медико-биологической практике.

Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций общих и специальных курсов студентам кафедры микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского и кафедры экологии Саратовского государственного технического университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Из выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями стафилококков и энтеробактерий наиболее активно фагоцитируются в условиях in vitro перитонеальными макрофагами белых мышей S. saprophyticus 5 и E. coli 34. В процессе фагоцитоза S. aureus 18 происходит достоверное увеличение активности ферментов кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга, образования активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах и синтеза оксида азота спленоцитами мышей.

2. При моделировании инфекции изменения цитокинового статуса организма экспериментальных животных зависят от способа заражения: внутрибрюшинное введение бактерий вызывает резкое увеличение содержания основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови мышей через 6-24 часа, особенно при заражении S. aureus 18 и E. coli 34. При подкожном и внутримышечном введении изменения концентрации цитокинов достоверные, но менее выраженные.

3. Метод спекл-микроскопии позволяет оценить действие цитокинов и цитокинсодержащего материала ex tempore in vivo на микроциркуляцию крови в сосудах брыжейки белых крыс.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на: Восьмой Общероссийской научной конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Москва, 2007); Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2007); Заочной конференции Российской Академии Естествознания «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (Москва 2007); Международной школе для студентов и молодых учёных по оптике, лазерной физике и биофизике Saratov Fall Meeting (Саратов, СГУ им. Чернышевского, 2007); Четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008); X-XII Всероссийских Форумах с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006-2009).

Работа выполнена в рамках НИР Государственного научного учреждения Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Россельхозакадемии «Изучение влияния ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов на возникновение заболеваний животных»; частично поддержана грантом № 45434 в рамках ведомственной научной программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (2006); а также в рамках НИР Федерального агентства по образованию № 1.4.09. «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и разработка когерентно-оптических и спектральных методов медицинской диагностики и фототерапии» (2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 5 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, восьми глав, включающих обзор литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 142 страницах, иллюстрирована 16 рисунками и содержит 16 таблиц. Список использованных литературных источников включает 248 наименований, в том числе 136 зарубежных.

2. Собственные исследования и их обсуждение

Материалы и методы

В работе проанализировано 274 штамма бактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями в ГНУ Саратовская НИВС Россельхозакадемии.

Для экспериментальных исследований были отобраны следующие бактерии: S. aureus 18, S. hyicus 12, S. epidermidis 6, S. saprophyticus 5, E. coli 34, Serratia sp. 3, Citrobacter sp. 1А и E. agglomerans 6. Изучение основных морфологических, культуральных, биохимических и тинкториальных свойств выделенных микроорганизмов, определение их чувствительности к антибиотикам проводили по общепринятым в микробиологии методам (Методические указания по…, 2004; Колычев, Госманов, 2006).

В работе использовали 340 лабораторных мышей и крыс, содержащихся на стандартном рационе вивария.

В качестве фагоцитирующих клеток при моделировании процесса фагоцитоза in vitro были использованы перитонеальные макрофаги (ПМФ) и спленоциты белых мышей - самцов, возрастом 2 - 3 месяца, весом 18 - 20 г. ПМФ выделяли из перитонеального экссудата, а спленоциты - из селезенок по общепринятым методикам (Кондратьева, Воробьева, Буракова, 2001). ПМФ культивировали в среде 199 с 0,5 % гидролизата лактальбумина. При моделировании процесса фагоцитоза in vitro использовали суточные культуры микроорганизмов, выращенные на оптимальных питательных средах, из которых готовили взвеси в физиологическом растворе по стандартам мутности № 5 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Бактерии вносили в среду с ПМФ в соотношении 1:50 и инкубировали при 37°С в течение 1, 3, 6, 12, 24 и 48 часов, после чего готовили фиксированные и окрашенные препараты монослоя фагоцитирующих макрофагов (Рудик, Тихомирова, 2006). Фагоцитарную активность определяли путем оценки фагоцитарных индексов (ФИ) и индекса завершенности фагоцитоза (ИЗФ) (Васильева, Пустовалов, Дорошенко, 1987).

Кислороднезависимые механизмы киллинга бактерий изучали постановкой цитохимических анализов на определение в перитонеальных макрофагах: кислой фосфатазы методом азосочетания Бернстона (Бернстон, 1965); щелочной фосфатазы по методу Каплоу (1955); катионных белков по методу Шубича (1974). Кислородзависимые механизмы киллинга изучали определением миелопероксидазы методом Грэхема-Кнолля (Саидов, Пинегин, 1991); образование активных форм кислорода регистрировали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) (Долгушин, Бухарин, 2001). На основе результатов исследования рассчитывали средний цитохимический коэффициент с использованием полуколичественного метода оценки по Астальди-Верга (Astaldi, Verga, 1957). Продукцию оксида азота спленоцитами в процессе фагоцитоза бактерий определяли методом Грисса по накоплению в инкубационной среде ионов NO₂- (Grees, Wagner, Glogowsky, 1982).

Содержание основных провоспалительных цитокинов определяли в супернатанте среды культивирования фагоцитов с бактериями через 1, 3, 6, 12, 24 и 48 часов процесса фагоцитоза методом иммуноферментного анализа с тест-системами на основе моноклональных антител к ИЛ-1, ФНО-б, ИЛ-6, ИФ- б и ИЛ-8 (наборы реактивов “цитокиновый тест“ АО ”Иммунодиагностика” г. Санкт-Петербург и тест-системы «ИФА-БЕСТ», производства ЗАО «Вектор-БЕСТ», г. Новосибирск).

Заражение беспородных белых мышей-самцов массой 18 - 20 г проводили введением по 0,2 мл взвеси с концентрацией 5х10⁷ м.к./мл подкожно, внутрибрюшинно или внутримышечно суточных культур выделенных стафилококков; подкожно и внутрибрюшинно - энтеробактерий. Контрольным мышам аналогично вводили по 0,2 мл физиологического раствора. Содержание основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови определяли через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после заражения.

Для биохимических исследований лабораторных мышей заражали подкожно суточными культурами S. aureus 18 и S. saprophyticus 5 (по 0,2 мл взвеси с концентрацией 5х10⁷ м.к./мл). Сыворотку крови забирали по стандартной методике через двое суток после заражения (Кондратьева, Воробьева, Буракова, 2001). Показатели белкового, углеводного, липидного обменов, активность некоторых ферментов, а также содержание кальция и железа в сыворотке определяли на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BS 3000 P.

Исследования микроциркуляции крови в брыжейке белых крыс проводили в Научной бактериологической лаборатории научно-исследовательской части Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского. В опытах использовали беспородных белых крыс двух-, трёхмесячного возраста массой 180-200 г, которых усыпляли введением нембутала (из расчёта 0,5 мг на 1 г массы тела), проводили лапаротомию по средней линии (1-1,5 см) и извлекали петлю тонкого кишечника с брыжейкой. Наблюдения изменений кровотока проводили при помощи установки для спекл-микроскопирования, представляющей собой микроскоп «Биолам» с дополнительным источником когерентного излучения (длина волны 633 нм, мощность ~1 мВт). Луч He-Ne лазера (л = 633 нм) фокусировался в пятно небольшого радиуса (=1,5 мм) на исследуемом сосуде брыжейки, образующиеся при этом спекл-поля, регистрировались фотодетектором. Цитокины (или цитокинсодержащий материал) наносили на петлю брыжейки и немедленно регистрировали исходящий сигнал спекл-микроскопа, который затем переводился в цифровой формат, записывался в wav-файл и обрабатывался при помощи оригинального алгоритма для прикладного пакета программ MathCAD 2001 (Ульянова, Ганилова, Ульянов, 2007).

Для статистической обработки экспериментальных данных использовали непараметрические критерии Уилкоксона-Манна-Уитни и параметрический t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при вероятности ошибки p<0,05 (Ашмарин, Васильев, Амбросов, 1974). Расчёт результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Microsoft Еxcel 2003 (for Windows XP).

Изучение биологических свойств стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями

На первом этапе был проанализирован видовой состав стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями (маститами, пиодермиями, раневыми инфекциями) в монокультуре и в ассоциации, а также изучены их морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства, определена чувствительность к антибиотикам. Показано, что чаще всего из патологического материала в монокультуре выделялись S. aureus и S. hyicus (28,4% и 27,1% случаев соответственно), реже - S. epidermidis (9,8%) и S. saprophyticus (2,2%) (табл. 1).

Таблица 1 - Видовой состав стафилококков - возбудителей острых гнойных инфекций животных

Виды стафилококков	Выделено в монокультуре	Выделено в ассоциации
	Абс.	%	Абс.	%
S. aureus	78	28,4	21	7,6
S. epidermidis	27	9,8	9	3,3
S. hyicus	67	27,1	18	6,5
S. saprophyticus	6	2,2	36	13,1
S. lentus	-	-	12	4,4
Всего:	178	65	96	35
Итого:	274

В 17,4% случаев возбудитель (S. aureus, S. hyicus или S. epidermidis) выделялся в ассоциации с другими видами стафилококков. Чаще всего (6,2%) ассоциации были представлены S. aureus и S. saprophyticus.

По морфологическим свойствам все выделенные стафилококки были типичными грамположительными аспорогенными неподвижными кокками с характерным для каждого вида расположением клеток в мазках. При изучении культуральных свойств установлено, что бактерии S. aureus, S. hyicus и S. saprophyticus образовывали более крупные колонии, в отличие от S. epidermidis и S. lentus, которые характеризовались малыми размерами колоний. Визуально определяемый каротиноидный пигмент образовывали более 90% штаммов S. aureus, большинство (30 из 36) штаммов S. sapro-phyticus, выделенных в ассоциации с другими бактериями, и 2 из 6 штаммов S. sapro-phyticus, выделенных в монокультуре.

Показано, что выделенные штаммы стафилококков обладали характерными видовыми биохимическими свойствами (табл. 2).

Таблица 2 - Культуральные и биохимические свойства стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями

Характеристики	Вид
	S. aureus	S. epidermidis	S. hyicus	S. saprophyticus	S. lentus
Образование каротиноидного пигмента	+	-	-	-	d
Рост в анаэробных условиях	+	+	+	(+)	(±)
Рост в аэробных условиях	+	+	+	+	(+)
Плазмокоагулаза	+	-	d	-	-
Оксидаза	-	-	-	-	+
Уреаза	d	+	d	+	-
Восстановление нитратов	+	+	+	-	+
Устойчивость к новобиоцину	-	-	-	+	+
Устойчивость к полимиксину	+	+	+	-	-
Продукция кислот в аэробных условиях из	Трегалозы	+	-	+	+	+
	Маннитола	+	-	-	d	+
	Маннозы	+	(+)	+	-	(+)
	Ксилозы	-	-	-	-	(±)
	Арабинозы	-	-	-	-	d
	Мальтозы	+	+	-	+	d
	Лактозы	+	d	+	d	d
	Сахарозы	+	+	+	+	+
	Рафинозы	-	-	-	-	+

Примечание: + - 90% и более штаммов положительны; - - 90% и более штаммов отрицательны; d - 11-89% штаммов положительны, скобки указывают на замедленную реакцию.

Гемолитической активностью обладали 94,9% штаммов S. aureus и 19,4% штаммов S. epidermidis. Штаммы S. lentus, выделенные в ассоциации с другими стафилококками - возбудителями острых гнойных инфекций у животных, отличались наличием оксидазной активности и способностью к утилизации рафинозы.

Показана чувствительность выделенных штаммов стафилококков к антибиотикам из перечня рекомендуемых к использованию в медицинской и ветеринарной практике (Методические указания по…, 2004). Отмечено, что штаммы S. sapro-phyticus, выделенные в ассоциации, и большинство штаммов S. aureus, обладали устойчивостью к бензилпенициллину и тетрациклину.

В дальнейших экспериментальных исследованиях использовали штаммы стафилококков: S. aureus 18, S. hyicus 12, S. epidermidis 6 и S. saprophyticus 5, обладающих типичными свойствами и ферментативной активностью.

Особенности фагоцитоза in vitro стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, и индукции основных провоспалительных цитокинов

В условиях in vitro была изучена активность процесса фагоцитоза перитонеальными макрофагами белых мышей выделенных штаммов стафилококков - возбудителей острых гнойных инфекций животных. Сравнительный анализ полученных результатов показал, что наиболее активными были макрофаги через 6, 12, 24 часа процесса фагоцитоза бактериальных клеток S. saprophyticus 5. В процессе фагоцитоза S. epidermidis 6 и S. aureus 18 наибольшая фагоцитарная активность ПМФ отмечена к 12 часам инкубации. При фагоцитозе всех изучаемых стафилококков через 48 часов происходило достоверное снижение числа активных макрофагов (табл. 3).

Таблица 3 - Активность перитонеальных макрофагов при фагоцитозе стафилококков

Штаммы стафилококков	Число активных ПМФ (M±m) в %
	1 час	3 часа	6 часов	12 часов	24 часа	48 часов
S. saprophyticus 5	32,3±0,8	54,2±0,5	66,2±0,9	74,3±1,2	72,8±0,7	60,4±0,9
S. hyicus 12	33,7±0,9	57,5±0,5	60,0±0,8	66,4±1,1	63,7±0,6	52,3±0,5
S. epidermidis 6	32,6±0,6	46,5±0,5	52,4±0,6	56,7±0,75	51,0±0,9	42,4±0,5
S. aureus 18	28,3±0,4	40,7±0,6	50,6±0,9	54,0±0,8	48,1±0,6	40,5±0,6

На основе полученных фагоцитарных индексов были рассчитаны индексы завершенности фагоцитоза бактериальных клеток макрофагами мышей. Завершенный фагоцитоз отмечен только в отношении S. saprophyticus 5 (ИЗФ>1), фагоцитоз других стафилококков был частичным или незавершенным.

При определении активности кислороднезависимых механизмов киллинга S. au-reus 18, показано увеличение через 1-3 часа фагоцитоза в макрофагах активности кислой фосфатазы и содержания катионных белков в 1,5 раза; к 6 часам - двукратное увеличение активности щелочной фосфатазы (рис. 1).

При изучении кислородзависимых механизмов киллинга S. aureus 18 установлено достоверное увеличение активности миелопероксидазы уже через 1 час инкубирования макрофагов с бактериями. Наибольшая активность фермента отмечена к 6 часам фагоцитоза.

Образование активных форм кислорода (АФК) регистрировали в НСТ-тесте при моделировании фагоцитоза перитонеальными макрофагами микробных клеток S. aureus 18 и S. saprophyticus 5.

Установлено, что содержание АФК в ПМФ было в 1,4 раза выше при индуцированном бактериями S. aureus 18 варианте НСТ-теста, чем при спонтанном. Незначительное увеличение содержания АФК отмечено при индуцированном бактериями S. saprophyticus 5 варианте НСТ-теста.

Показано также достоверное увеличение содержания оксида азота в среде культивирования мышиных спленоцитов, фагоцитирующих бактерии S. aureus 18, и недостоверное - при фагоцитозе S. saprophyticus 5, по сравнению с контрольными значениями (спленоциты без бактерий).



Рис. 1. Активность ферментов кислороднезависимого киллинга: кислой и щелочной фосфатаз и содержание катионных белков в процессе фагоцитоза перитонеальными макрофагами мышей микробных клеток S. aureus 18

При оценке динамики содержания провоспалительных цитокинов в супернатанте среды культивирования перитонеальных макрофагов мышей с бактериями S. au-reus 18 было отмечено резкое увеличение в 5-6 раз концентраций ИЛ-1 и ФНО-б соответственно через 6 часов. При фагоцитозе бактерий S. hyicus 12 и S. epidermidis 6 происходило достоверное увеличение в динамике ИЛ-6; а при фагоцитозе S. sapro-phyticus 5 и S. epidermidis 6 - ИЛ-1 в 2-3 раза соответственно.

Оценка цитокинового статуса организма экспериментальных животных при разных способах заражения стафилококками и метаболического статуса при стафилококковой инфекции

На следующем этапе работы нами было проведено изучение цитокинового статуса белых мышей при подкожном, внутримышечном и внутрибрюшинном введении стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями. Показано, что подкожное введение бактерий S. aureus 18, S. hyicus 12 и S. epidermidis 6 сопровождалось повышением в 3 раза через 6 часов содержания в сыворотке крови ИЛ-1б и фно-б. Через 24 часа изменения цитокинового баланса были неоднотипными: отмечено превышение в 5 раз содержания ИЛ-1б и фно-б по сравнению с контролем при заражении S. aureus 18 и снижение концентрации этих цитокинов по сравнению с показателями через 6 часов после заражения S. hyicus 12 и S. epidermidis 6. При введении S. saprophyticus 5 концентрации ИЛ-6 и фно-б увеличивались незначительно через 1 и 6 ч после заражения и снижались до исходного уровня к 24 часам; содержание ИЛ-1б было достоверно ниже по сравнению с данными индукции другими стафилококками, при этом все же превышая контрольные значения (рис. 2). Выявлена однотипная динамика увеличения в сыворотке крови содержания провоспалительных цитокинов к 6 часам после внутримышечного введения исследуемых стафилококков, наиболее достоверные отличия установлены через 24 часа после введения S. aureus 18. Внутрибрюшинное введение белым мышам бактерий этого штамма сопровождалось одновременным увеличением содержания ИЛ-1б и ФНО-б, превышающим контрольные значения в 6 и 12 раз соответственно к 6 часам; в 10 и 18 раз - к 24 часам. Такая гиперпродукция основных провоспалительных цитокинов приводила к развитию у этих животных к 24 ч клинической картины эндотоксического шока. При введении S. hyicus 12 содержание этих цитокинов было достоверно выше контрольных значений через 1, 6, и 24 ч. Введение S. epidermidis 6 и S. saprophyticus 5 сопровождалось незначительным увеличением содержания цитокинов.

Исследование биохимических показателей сыворотки крови мышей (табл. 4), зараженных S. aureus 18 или S. saprophyticus 5, показало, что концентрация общего белка повышалась в обоих случаях, причем за счет глобулиновой фракции. Можно предположить, что повышение концентрации глобулинов произошло не столько за счет г-глобулинов, сколько благодаря образованию белков острой фазы.



Рис. 2. Содержание цитокинов в сыворотке крови мышей при подкожном введении S. aureus 18 (А), S. hyicus 12 (Б), S. epidermidis 6 (В) и S. saprophyticus 5 (Г)

Таблица 4 - Биохимические показатели сыворотки крови мышей при подкожном введении S. aureus 18 и S. saprophyticus 5

Показатель	Контроль	При введении S. saprophyticus 5	При введении S. aureus 18
АЛТ, мкмоль/мин·л	104,4±7,3	57,8±4,2	76,8±5,3
АСТ, мкмоль/мин·л	240,4±17	206,0±11	219,4±13
КК, мкмоль/мин·л	1284,3±96	3517,8±107	3959,4±207
ЛДГ, мкмоль/мин·л	1910,8±80	2449,4±145	3401,6±195
ЩФ, мкмоль/мин·л	410,5±15	372,8±13	428,4±21
КФ, мкмоль/мин·л	21,2±1,1	24,6±1,3	40,5±2,6
Общий белок, г/л	52,8±2,3	60,5±3,8	57,5±3,1
Альбумин, г/л	39,2±1,4	40,5±2,8	39,8±3,2
Глобулин, г/л	13,6±0,5	20,0±0,7	17,7±0,9
Мочевина, ммоль/л	6,2±0,1	7,1±0,15	5,9±0,09
Глюкоза, ммоль/л	9,4±0,2	9,7±0,24	8,1±0,17
Мочевая кислота, мкмоль/л	178,5±5,4	143,4±4,2	215,4±1,2
Коэффициент де Ритиса	2,3	3,6	2,9

Сравнение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансфе-разы (АСТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и креатинкиназы (КК), а также коэффициента де Ритиса в сыворотке крови мышей, зараженных S. saprophyticus 5 и S. aureus 18, указывает на то, что соотношение центральной и периферической зон метаболизма в энергетическом обмене смещается в сторону катаболических процессов. У мышей, зараженных S. saprophyticus 5, это смещение более выраженное, что свидетельствует о большей эффективности защитных реакций организма в данном случае. Соотношение в сыворотке крови подопытных групп мышей белка и мочевины (см. табл. 4), а также концентрация глюкозы и мочевой кислоты отражали менее скомпенсированный характер патологических изменений в случае заражения S. aureus 18.

Особенности фагоцитоза in vitro энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, и индукции основных провоспалительных цитокинов

При изучении индукции цитокинов и характера фагоцитоза перитонеальными макрофагами мышей энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, выявлены следующие различия: наиболее активным оказался фагоцитоз бактерий E. coli 34 к 24 часам процесса по сравнению с фагоцитозом других энтеробактерий. Интенсивность фагоцитоза E. agglomerans 6, Serratia sp. 3, Citrobacter sp. 1А имела сходную динамику во времени: увеличение числа активных ПМФ в 2,5 - 3 раза к 24 часам и снижение к 48 часам на фоне активной индукции ИЛ-1б и ФНО-б уже к 6 часам процесса (табл. 5). Завершенный фагоцитоз отмечен только в отношении E. coli (ИЗФ>1) и сопровождался достоверным увеличением содержания ИЛ-1б и ФНО-б к 24 часам, фагоцитоз других культур был незавершенным.

Таблица 5 - Активность перитонеальных макрофагов при фагоцитозе энтеробактерий

Штаммы энтеробактерий	Число активных ПМФ (M ± m) в %
	1 час	3 часа	6 часов	12 часов	24 часа	48 часов
Serratia sp. 3	22,0 ± 0,4	28,2 ± 0,5	38,4 ± 0,4	42,7 ± 0,5	51,1 ± 0,5	48,3 ± 0,4
Citrobacter sp. 1А	25,5 ± 0,5	32,4 ± 0,4	38,2 ± 0,5	46,1 ± 0,5	48,6 ± 0,6	42,4 ± 0,5
E. agglomerans 6	18,1 ± 0,3	28,2 ± 0,5	36,3 ± 0,3	39,5 ± 0,2	42,0 ± 0,2	34,2 ± 0,5
E. coli 34	24,4 ± 0,5	42,3 ± 0,8	58,5 ± 0,9	64,3 ± 1,2	68,5 ± 0,6	48,7 ± 0,6

Оценка цитокинового статуса организма экспериментальных животных при разных способах заражения энтеробактериями

На следующем этапе оценивали цитокиновый статус экспериментальных животных при внутрибрюшинном и подкожном введении энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями. При внутрибрюшинном введении мышам бактерий E. сoli 34 отмечено увеличение в 6 - 8 раз содержания в сыворотке крови ИЛ-1б через 6-12 часов (табл. 6). В эти же часы зарегистрирована гиперпродукция ФНО-б, содержание которого в 18 раз превышало исходный уровень.

Таблица 6 - Содержание цитокинов в сыворотке крови мышей после внутрибрюшинного введения энтеробактерий

Штаммы бактерий	Цитокины	Содержание цитокинов в пг/мл (M±m)
		к	1	3	6	12	24
E. coli 34	ИЛ-1б	54±2	62±6	140±12	360±26	380±24	420±28
	ФНО-б	10±1	22±3	34±3	160±10	180±12	120±10
	ИЛ-6	12±1	18±2	46±4	80±8	110±10	90±6
Citrobacter sp. 1А	ИЛ-1б	54±4	70±6	160±11	280±16	320±20	300±24
	ФНО-б	10±1	26±3	48±5	56±4	42±4	60±5
	ИЛ-6	12±2	20±2	52±4	80±7	78±6	58±5
E. agglo-meraпs 6	ИЛ-1б	54±2	58±4	98±6	220±12	290±18	180±14
	ФНО-б	10±1	25±3	28±3	62±4	70±6	48±3
	ИЛ-6	12±1	24±2	36±3	76±6	60±4	58±4
Serratia sp. 3	ИЛ-1б	52±2	64±6	98±8	128±10	260±14	190±18
	ФНО-б	10±1	18±2	28±2	44±3	80±2	58±4
	ИЛ-6	12±1	18±3	32±3	76±6	92±8	68±5

Введение Serratia sp. 3 и Citrobacter sp. 1А сопровождалось однотипным увеличением концентраций ИЛ-1б, ФНО-б и ИЛ-6, содержание которых в сыворотке крови в 3-5 раз превышало контрольные значения через 12 и 24 часа. При заражении мышей бактериями E. agglomerans 6 отмечено динамичное возрастание к 24 часам содержания ИЛ-1б, ИЛ-6 и ИФ-б; концентрация ФНО-б увеличивалась к 6 часам и снижалась к 24, оставаясь при этом выше исходных значений. Отмечено также появление ИЛ-8 в небольших концентрациях через 12 и 24 ч после заражения.

При подкожном введении E. coli 34, Serratia sp. 3, Citrobacter sp. 1А и E. agglo-merans 6 отмечена однотипная динамика увеличения в сыворотке крови мышей содержания ИЛ-1б и ФНО-б к 12 часам; содержание ИЛ-6 и ИФ-б достоверно превышало контроль через 12 и 24 часа после заражения животных.

Оценка действия цитокинов и цитокинсодержащего материала ex tempore in vivo на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс методом спекл-микроскопии

Было проведено сравнение влияния ИЛ-1б, ФНО-б и цитокинсодержащего материала (супернатант среды культивирования ПМФ через 6 часов процесса фагоцитоза бактерий S. aureus 18) на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс методом спекл-микроскопии. Установлено, что в целом действие ИЛ-1б и ФНО-б на микроциркуляцию крови в брыжейке кишечника экспериментальных животных было однотипным: происходило немедленное усиление скорости кровотока в сосудах в 1,5 и 1,3 раза соответственно (рис. 3).



Рис. 3. Влияние ИЛ-1б на микроциркуляцию крови в сосудах брыжейки белых крыс

При нанесении цитокинсодержащего материала регистрировалось увеличение скорости кровотока в 2,3 раза, такое превышение влияния чистых препаратов ИЛ-1б и ФНО-б может быть объяснено кумулятивным эффектом действия всех находящихся в супернатанте провоспалительных цитокинов (рис. 4).

Рис. 4. Влияние цитокинсодержащего материала на микроциркуляцию крови в сосудах брыжейки белых крыс

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить особенности взаимодействия возбудителей острых гнойных инфекций - стафилококков и энтеробактерий - in vitro и in vivo с факторами естественной резистентности организма экспериментальных животных. Полученные данные могут быть использованы для дальнейших теоретических разработок в области изучения взаимодействия макро- и микроорганизмов. Показана возможность применения метода спекл-микроскопии для оценки микроциркуляции крови в исследовательской и диагностической медико-биологической практике.

Выводы

1. От животных с острыми гнойными инфекциями стафилокковой этиологии наиболее часто в монокультуре выделялись S. aureus и S. hyicus (28,4 и 27,1% случаев соответственно), реже - S. epidermidis (9,8%) и S. saprophyticus (2,2%). Ассоциации преимущественно были представлены S. aureus и S. saprophyticus.

2. Отмечено, что в условиях in vitro фагоцитоз бактерий S. saprophyticus 5 и E. сoli 34 в перитонеальных макрофагах белых мышей завершался к 24 часам; для других стафилококков и энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, он был частичным или незавершенным.

3. Фагоцитоз бактерий S. aureus 18 сопровождался увеличением в перитонеальных макрофагах мышей активности кислой фосфатазы и содержания катионных белков в 1,5 раза; активности щелочной фосфатазы и миелопероксидазы в 2 раза. Содержание активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах и продукция оксида азота спленоцитами мышей повышались в 1,4 раза. При фагоцитозе бактерий S. saprophyticus 5 изменение этих показателей было незначительным.

4. После подкожного или внутримышечного введения стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, отмечена однотипная динамика увеличения в сыворотке крови мышей содержания провоспалительных цитокинов ИЛ-1б, ФНО-б и ИЛ-6 к 24 часам; после внутрибрюшинного заражения - резкое увеличение в 10-18 раз концентрации ИЛ-1б и ФНО-б к 24 часам.

5. Выявлены изменения метаболической активности организма экспери-ментальных животных при моделировании стафилококковой инфекции, свиде-тельствующие о большей эффективности защитных реакций в случае введения S. saprophyticus 5 и менее скомпенсированном характере патологических изменений в случае заражения S. aureus 18.

6. Установлено, что при подкожном введении мышам энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, происходило незначительное увеличение содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и повышение их концентрации в 3-5 раз - при внутрибрюшинном заражении.

7. Методом спекл-микроскопии показано действие цитокинов и цитокинсодержащего материала ex tempore in vivo на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс: ИЛ-1б и ФНО-б вызывают немедленное усиление скорости кровотока в сосудах в 1,5 и 1,3 раза соответственно; нанесение супернатанта среды культивирования перитонеальных макрофагов, фагоцитирующих S. aureus 18, усиливает скорость кровотока в 2,3 раза.

стафилококк животное инфекция микроскопия

Список работ, опубликованных по теме диссертации (* - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ)

1. *Шибаева, М.А. Индукция провоспалительных цитокинов клиническими штаммами стафилококков при моделировании инфекционного процесса на лабораторных животных /М.А. Шибаева, Т.В. Водянова, Ю.Ю Елисеев, Е.И Тихомирова //Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 127-128.

2. Шибаева, М.А. Показатели цитокинового статуса лабораторных животных при моделировании инфекционного процесса возбудителями внутрибольничных инфекций /М.А. Шибаева, Т.В. Водянова, Ю.Ю Елисеев, Е.И Тихомирова //Успехи современного естествознания. - 2006. - № 6. - С. 69-70.

3. *Шибаева, М.А. Оценка цитокинового статуса организма экспериментальных животных при моделировании инфекционного процесса возбудителями внутрибольничных инфекций / М.А. Шибаева, Т.В. Водянова, Ю.Ю Елисеев, Н.В. Емельянова // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2/3. - С. 126-127.

4. Шибаева, М.А. Влияние токсина Escherichia coli на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс /М.А. Шибаева, Д.В. Подшибякин, С.С. Ульянов, О.В. Ульянова, Е.И. Тихомирова //Фундаментальные исследования. - 2007. - №12. - С. 266-267.

5. *Шибаева, М.А. Оценка действия цитокинов in vivo на микроциркуляцию крови методом спекл-микроскопии / М.А. Шибаева, Д.В. Подшибякин, С.С. Ульянов, О.В. Ульянова, Е.И. Тихомирова // Российский иммунологический журнал. - 2008. - № 2 (11). - С. 138.

6. Шибаева, М.А. Изменения цитокинового статуса организма экспериментальных животных при разных способах инфицирования клиническими штаммами бактерий /М.А. Шибаева, Е.И. Тихомирова, Н.В. Емельянова, М.Н. Чернова //Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: материалы IV междунар. конф., - СПб, 2008. - С. 171-172.

7. Шибаева, М.А. Использование метода спекл-микроскопии для оценки действия токсинпродуцирующих штаммов кишечной палочки на микроциркуляцию крови /М.А. Шибаева, Д.В. Подшибякин, Е.И. Тихомирова, С.С. Ульянов, О.В. Ульянова //Известия Саратовского университета. - 2008. - Т.8, №2. - С. 73-76.

8. Shibaeva, М.А. The affect of Escherichia coli toxins on blood microcirculation in ventral mesentery of white rats /M.A. Shibaeva, S.S. Ulyanov, O.V. Ulianova, E.I. Tikhomirova //European Journal of Natural History. - 2009. - № 1. - P. 62-65.

9. *Шибаева, М.А. Использование белых крыс для in vivo оценки влияния фотоинактивированных бактерий кишечной палочки на лабораторных животных /О.В. Ульянова, С.С. Ульянов, Д.В. Подшибякин, М.А. Шибаева, Е.И. Тихомирова //Естественные и технические науки. - 2009. - №6. - С. 212-214.

10. *Шибаева, М.А. Определение индукции цитокинов in vivo при разных способах введения стафилококков и энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями /М.А. Шибаева, В.Н. Ласкавый, Е.И. Тихомирова //Естественные и технические науки. - 2010. - №1. - С. 37-42.

Размещено на Allbest.ru

...