Экзополисахариды молочнокислых бактерий и их функциональная значимость в организме животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

Специальность 03.00.07 - микробиология

ЭКЗОПОЛИСАХАРИДЫ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ

Полукаров Евгений Викторович

Саратов - 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном

учреждении высшего профессионального образования «Саратовский

государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Карпунина Лидия Владимировна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Швиденко Инна Григорьевна

доктор биологических наук, профессор

Коннова Светлана Анатольевна

Ведущая организация: ФГУЗ «Российский научно-исследовательский

противочумный институт «Микроб»»

Защита диссертации состоится «26» ноября 2009 г в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Среди многочисленных веществ - метаболитов бактерий особое место занимают углеводы и их производные, которые в виде разнообразных производных комплексов входят в состав живых клеток, выполняя роль источника энергии, регуляторов специфических биохимических процессов.

Источником получения экзополисахаридов (ЭПС) на сегодняшний день являются многие микроорганизмы. К наиболее известным микроорганизмам, которые способны продуцировать ЭПС, относятся бактерии разных родов. Среди них значительное место занимают молочнокислые бактерии.

Изучение ЭПС, продуцируемые молочнокислыми бактериями, началось c 80-х годов прошлого столетия и активно развивается в настоящее время, отражением чего служат постоянно публикуемые обзоры (Sandford, Cottrell, Pettitt, 1984; Degeest, Vaningelgem, Vuyst, 2001; Bergmaier, Champagne, Lacroix, 2003; Champagne, Gardner, Lacroix, 2007 и др.).

Среди молочнокислых бактерий особое внимание уделяется бактериям рода Lactobacillus, представители которого широко распространены в природе. Разными исследователями показано, что лактобациллы обладают большим потенциалом в отношении синтеза экзополисахаридов (van den Berg et al., 1995; Gassem, Schmidt, Frank, 1995; Macedo et al., 2002 и др.), однако функции этих биополимеров являются не до конца изученными. Для формирования представления о влиянии ЭПС молочнокислых бактерий на физиологические реакции в организме животных, необходимо накопление данных о химической структуре, физических и биологических свойствах ЭПС разных видов и штаммов.

В связи с этим исследования, посвященные изучению функций экзополисахаридов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus различных штаммов, являются актуальными и могут иметь значительный научный интерес и прикладное значение.

Цель работы состояла в выделении ЭПС из Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, изучении их основных физико-химических свойств и влиянии их на содержание цитокинов в организме животных в норме и при стафилококковой инфекции.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать оптимальные условия культивирования L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (состав питательной среды, температура, рН, время культивирования) для обеспечения максимального продуцирования ими экзополисахаридов в лабораторных условиях.

2. Выделить и очистить экзополисахариды L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 из культуральной жидкости.

3. Определить молекулярную массу, химическую природу, моносахаридный состав и вязкость полученных экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596.

4. Изучить влияние in vivo экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 на содержание цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных.

5. Оценить цитокиновый статус организма экспериментальных животных при моделировании стафилококковой инфекции на фоне действия ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596.

Научная новизна

Впервые выделены ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936, L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 и определены их молекулярные массы, химическая природа, моносахаридный состав и вязкость. Показано, что L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 максимально продуцируют экзополисахариды на среде A.Welman с соавт. (2003) в нашей модификации при 38°С, рН 5,5 на 44-46 ч культивирования.

Обнаружено, что введение ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 в организм лабораторных мышей оказывает неоднозначное влияние на содержание цитокинов: ИЛ-1, ФНО-, ИФ-г, ИЛ-4 в сыворотке крови. Показана возможность коррекции цитокинового статуса организма лабораторных мышей путем введения им ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 при стафилококковой инфекции.

Практическая значимость работы

Способность экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 регулировать содержание некоторых провоспалительных и регуляторных цитокинов в организме животных открывает перспективы использования их в качестве профилактических иммуномодулирующих препаратов и для коррекции цитокинового статуса при инфекционных заболеваниях.

По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации по выделению и очистке экзополисахаридов бактериального происхождения» (в соавторстве с Г.Е. Рысмухамбетовой, Е.Н. Бухаровой, Д.А. Жемеричкиным, Л.В. Карпуниной) для студентов старших курсов, аспирантов, специалистов микробиологических, биотехнологических лабораторий, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 58 от 23 июня 2009 г). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, проведении лабораторно-практических занятий и написании дипломных работ в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные из культуральной жидкости ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 представлены одной нейтральной фракцией с молекулярными массами 140 кДа, 220 кДа, 1700 кДа соответственно и характеризуются сходным моносахаридным составом, однако обладают разной относительной вязкостью.

2. Оптимальными условиями культивирования для наибольшей продукции экзополисахаридов для L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 являются: 38 °С, рН 5,5, время культивирования 44-46 ч на модифицированной питательной среде A.Welman с соавт. (2003).

3. ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 оказывают влияние на цитокиновый статус организма экспериментальных животных в норме и при стафилококковой инфекции.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на: II-Открытой Всероссийской конференции «Молодежь и наука XXI века» (Россия, Ульяновск, 2007); региональной конференции молодых ученых «Вавиловские чтения - 2007» (Россия, Саратов, 2007); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию факультета (института) ветеринарной медицины (Россия, Саратов 2009); XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Россия, Санкт-Петербург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и собственных исследований, включающей объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка используемых литературных источников. Работа изложена на 106 страницах, содержит 2 таблицы, 25 рисунков. Список использованных литературных источников включает 148 наименований, в том числе 128 зарубежных.

2. Собственные исследования

Объект и методы исследований

В работе использовали культуру L. delbrueckii ssp. bulgaricus, полученную из сухого порошка лиофилизированной бактериальной закваски болгарских палочек, используемую в России для производства йогуртов (Государственное унитарное предприятие производственно-экспериментальный завод РАСХН, г. Москва); L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, полученные из Российской коллекции микроорганизмов (г. Пущино-на-Оке); культуру Staphylococcus aureus 209-P, полученную из коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

Для культивирования бактерий рода Lactobacillus использовали следующие питательные среды: лактобакагар, среда A. Welman с соавт. (2003) и S. Petry с соавт. (2000). S. aureus 209-P выращивали на мясо-пептоном агаре.

Выделение и очистку экзополисахаридов лактобацилл проводили по методу J. Cerning с соавт. (1986) в нашей модификации.

Молекулярные массы экзополисахаридов лактобацилл определяли с помощью аналитической гель - хроматографии, используя гелиевый носитель TSK 6000G PWXL (Япония). ЭПС детектировали на автоматическом анализаторе 2690 Alliance Waters. Аналитическую колонку калибровали декстранами («Fluka» Швейцария, «Merck» Германия) с известными молекулярными массами (2000, 110, 15-20 кДа).

Определение белка проводили по методу M. Bradford (1976).

Определение общего количества углеводов в экзополисахаридах лактобацилл проводили по фенол-серному методу (Dubois et al., 1956).

Химическую природу экзополисахаридов лактобацилл определяли методом ионообменной хроматографии, используя анионнообменный носитель DEAE-C Toyopearl 650 М (Остерман, 1985).

Моносахаридный состав экзополисахаридов лактобацилл определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с целлюлозным носителем «Fluka» (Остерман, 1985; Варбанец, 2006) и с помощью хроматографического метода Выражаем глубокую благодарность с.н.с., к.б.н. ИФРМ РАН (г. Саратов) Селиванову Николаю Юльевичу за практическую помощь при определении углеводного состава в ЭПС лактобацилл., используя колонку Carbopac PA (Dionex, США), хроматограф SMART LINE 5000 (KNAUER, Германия) и детектор DECADE II Anthec Leyden (Нидерланды). Анализ проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя колонки (Dionex, США).

Динамическую вязкость определяли на ротационном вискозиметре Termo Haake Viskotester - 7R (Нидерланды), относительную вязкость - с помощью капиллярного вискозиметра ВПЖ-2 (Россия) (Рабек, 1983).

Моделирование инфекционного процесса у белых беспородных мышей (самцы, с массой тела 18-22 г) проводили введением суточной культуры S. aures 209-P по 0,2 мл внутрибрюшинно в дозе 5 млн кл/мл. ЭПС в концентрации 0,0012 г/мл вводили белым мышам по 0,2 мл внутрибрюшинно через 1 час после заражения. Через 1 и 6 часов мышей умерщвляли транслокацией шейных позвонков, брали кровь из сердца и получали сыворотку по общепринятой методике (Кондратьева и др., 2001). Содержание цитокинов: ИЛ-1, ФНО-, ИФ-г и ИЛ-4 определяли в сыворотке крови постановкой иммуноферментного анализа (ИФА) с тест-системами на основе моноклональных антител (наборы реактивов “цитокиновый тест“ АО ”Иммунодиагностика” г. Санкт-Петербург и тест-системы «ИФА-БЕСТ», производства ЗАО «Вектор-БЕСТ», г. Новосибирск). Определение каждого цитокина осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя тест-систем, результаты учитывали на Multiskan Plus version 2.01. По значениям оптической плотности стандартных образцов строили калибровочные кривые и с учетом оптической плотности образцов определяли концентрации цитокинов.

Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам (Воробьев, 1989), а также с использованием программы StatPlus 2007 Professional 4.9.4.1.

Подбор питательных сред и условий культивирования лактобацилл

В процессе работы было показано, что при выращивании L.delbrueckii ssp. bulgaricus при 38°С и рН 5,5 на среде A. Welman с соавт. (2003), выход экзополисахаридов составил 350 мг/л, в то время как при культивировании бактерий при температуре 35°С и 43°С при этом же значении рН выход ЭПС был 180 мг/л и 156 мг/л соответственно (рис. 1).

При культивировании лактобацилл на среде со значением рН 5,0 и значениях температур 35 єС, 38 єС, 43 єС выход ЭПС составил 147, 180, 128 мл/л соответственно. Изменение значения рН с 5,0 до рН 6,0 при тех же температурах привели к тому, что выход экзогликанов составил 150, 218, 139 мг/л соответственно (рис. 1). Выбор значений рН проводили исходя из литературных данных (Petry et al., 2000; Welman, Maddox, Archer., 2003; Champagne et al., 2007 и др.).

При выращивании лактобацилл при температуре 38 єС и разных значениях рН было отмечено, что при рН 5,0 и 6,0 происходило торможение роста и размножения клеток в лаг-фазе в отличие от значения рН 5,5, что сказывалось на дальнейшей продукции экзополисахаридов (рис. 2).

Культивирование L. delbrueckii ssp. bulgaricus проводили на термостатируемой качалке для выращивания бактерий при 185 об/мин.

Выбор источника углерода также оказывает большое влияние на биосинтез экзополисахаридов молочнокислыми бактериями. Основными источниками углерода для молочнокислых бактерий являются глюкоза, галактоза, лактоза, манноза, фруктоза и сахароза, а также комбинации из этих сахаров (Gamar-Nourani, Blondeau, Simonet, 1997; Yuksekdag, Aslim, 2008). Для выращивания L. delbrueckii ssp. bulgaricus в среде культивирования помимо лактозы были использованы глюкоза и сахароза (рис. 3). При введении в среду выращивания в качестве источника углерода сахарозы наблюдали отсутствие роста лактобацилл. При выращивании их на лактозе выход ЭПС составил 350 мг/л. В случае замены лактозы на глюкозу в тех же концентрациях (20 г/л), выход экзополисахаридов увеличивался до 495 мг/л.

По литературным данным известно, что внесение в питательную среду полисахаридной затравки способствует увеличению биосинтеза экзополисахаридов (Волова, 1999). Использование в качестве такой затравки полисахарида - декстрана (м. м. 5 кДа) в количестве 0,1 г/л, которую добавляли в среду совместно с глюкозой, способствовало увеличению синтеза экзополисахаридов, выход которого достигал 750 мг/л (рис. 3).

При культивировании лактобацилл в течение 64 ч на синтетической среде S. Petry с соавт. (2000) (в качестве источника углерода использовали глюкозу) при температурах 35 °С, 38 °С и 42 °С и значении рН 6,0 было показано, что наибольший выход ЭПС - 220 мг/л, происходил при 38 °С. В то время как при выращивании лактобацилл при температурах 35 °С и 42 °С выход ЭПС составил не более 150 и 180 мг/л соответственно (рис. 4).

Использование декстрана на данной среде выращивания лактобацилл также способствовало увеличению синтеза экзополисахаридов - до 410 мг/л.

Таким образом, как показали результаты наших исследований, лучшей средой для получения максимальной продукции ЭПС при культивировании лактобацилл являлась среда A. Welman с соавт. (2003) в нашей модификации. В связи с этим выращивание L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 для получения ЭПС также проводили на этой среде при подобранных условиях культивирования.

При культивировании L. delbrueckii ssp. bulgaricus в лабораторном ферментере Выражаем глубокую благодарность с.н.с., к.б.н. ЗАО «Биоамид» (г. Саратов) Сингирцеву Игорю Николаевичу за практическую помощь при культивировании L. delbrueckii ssp. bulgaricus в лабораторном ферментере. (марка КФ-104, версия программы управления ферментером Kek. Lab. 1.0.0.69) при 38 °С, рН 5,5, V_{мешалки} 110±5 об/мин, продувка воздухом 0,5 мин^-1 на среде A.Welman с соавт. (2003), продукция ЭПС составила 980 мг/л, что в 1,3 раза было больше по сравнению с культивированием на той же питательной среде на термостатируемой качалке (рис. 3).

Выделение и очистка экзополисахаридов лактобацилл

Выделение ЭПС проводили по методу J. Cerning с соавт. (1986) в нашей модификации. Для выделения ЭПС продуцируемых L.delbrueckii ssp. bulgaricus, L.delbrueckii B-1936 и L.delbrueckii subsp delbrueckii B-1596 культуры выращивали на среде A.Welman с соавт. (2003) в течение 44-46 часов. Далее культуральную жидкость центрифугировали при 16660g и температуре 4 єС в течение 30 мин. Осадок биомассы удаляли. Освобожденную от биомассы культуральную жидкость упаривали на роторном испарителе при пониженном давлении. Отсутствие бактерий на данном этапе контролировали путем микроскопирования, с использованием метода Грама. Затем ЭПС осаждали двойным объемом охлажденного 96 % этилового спирта (3-5) єС. Осаждение ЭПС проводили в течение 1,5 часов при температуре (3-5)єС. Полученные ЭПС очищали от низкомолекулярных соединений путем проведения диализа. Использовали диализные мембраны фирмы «Serva» с пределом исключения 12-14 кДа. Выделенные фракции высушивали. Все они имели желто-коричневый цвет за счет имеющихся в них пигмента. Полученные образцы подвергали дальнейшей очистки методом гель-фильтрации (рис. 5). Выделенные ЭПС молочнокислых бактерий содержали белка менее 0,1 % и не имели пигмента, что говорило об их высокой чистоте. В то время как ЭПС, полученные по методу J. Cerning с соавт. (1986) содержали белка до 5 % и желто-коричневый пигмент. Выделенные ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 были условно нами названы лаксаран Z, лаксаран 1936 и лаксаран 1596 соответственно.

Определение молекулярных масс лаксаранов

Молекулярные массы экзополисахаридов определяли методом аналитической гель - хроматографии. Экзополисахариды лактобацилл детектировали на автоматическом анализаторе 2690 Alliance Waters (рис. 6). Аналитическую колонку калибровали декстранами («Fluka» Швейцария, «Merck» Германия) с известными молекулярными массами (2000, 110, 15-20 кДа). Для калибровки графически отображали зависимость элюционных объемов от молекулярных масс декстранов. Имея данные элюционных объемов выделенных ЭПС и калибровочный график, находили молекулярные массы лаксаранов (табл. 1).

Таблица 1 - Определение молекулярных масс лаксаранов

Определение химической природы лаксаранов Z, 1936, 1596 проводили методом ионообменной хроматографии. Для этого на колонку DEAE-C Toyopearl 650 М наносили 0,5 мл образцов ЭПС лактобацилл. Фракции с колонки собирали с помощью коллектора и затем исследовали на содержание углеводов фенол-серным методом. Было установлено, что все образцы выходили одной фракцией соответствующей нейтральным веществам (рис. 7).

Используя метод тонкослойной хроматографии было показано, что все лаксараны: Z, 1936, 1596 не отличаются по моносахаридному составу и включали в себя только глюкозу (рис. 8). Для уточнения моносахаридного состава ЭПС использовали хроматографический метод фирмы Dionex (США) (рис. 9, 10). Данный метод подтвердил результаты метода ТСХ о том, что ЭПС лактобацилл состоят только из глюкозы.

Определение относительной вязкости лаксаранов

В связи с тем, что данные экзополисахариды обладают низкой вязкостью и определить динамическую вязкость не представлялось возможным, была определена относительная вязкость с помощью капиллярного вискозиметра.

Данные об относительной вязкости экзополисахаридов представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Определение относительной вязкости лаксаранов

Примечание: * - достоверность при р<0,05.

Исследование влияния лаксаранов на содержание цитокинов в сыворотке крови животных в норме

При изучении влияния лаксаранов на цитокиновый статус лабораторных мышей представляло интерес определить изменение содержания основных провоспалительных цитокинов ИЛ-1б и ФНО-б, отвечающих за инициацию факторов естественной резистентности организма животных и развитие воспалительной реакции защитного характера, а также ИФ-г, ответственного за развитие клеточных иммунных реакций, и ИЛ-4, регулирующего преимущественно реакции гуморального звена иммунитета. Было установлено, что при внутрибрюшинном введении лаксарана Z в концентрации 0,0012 г/мл через 1 час концентрация ИЛ-1б в сыворотке крови достоверно увеличивалась по сравнению с исходным значением в 3 раза (с 35,9 пкг/мл до 93,4 пкг/мл), а через 6 часов содержание ИЛ-1б было на уровне контроля (рис. 11). Действие лаксарана 1936, напротив, сопровождалось увеличением уровня ИЛ-1б в сыворотке крови спустя 1 и 6 часов в 1,5 и 3 раза соответственно по сравнению с контрольной группой животных. Введение лаксарана 1596 сопровождалось аналогичными изменениями содержания ИЛ-1б, как и при воздействии лаксарана Z на организм экспериментальных животных (рис. 11).

При исследовании лаксарана Z на содержание ФНО б в сыворотке крови животных в норме через 1 час после введения в организм животных концентрация ФНО б понижалась в 1,8 раза по отношению к исходному значению, после 6 часов эксперимента содержание ФНО б в сыворотке крови мышей было на уровне контроля. При введении животным лаксарана 1936 наблюдали уменьшение содержания ФНО-б через 1 час и через 6 часов по отношению с контролем в 1,3 и в 1,7 раз соответственно. При введении лаксарана 1596 мышам содержание ФНО б в сыворотке крови через 1 час увеличивалось в 1,5 раза, а через 6 часов уменьшалось в 1,7 раза по сравнению с контролем (41,4 пкг/мл и 24,6 пкг/мл, соответственно) (рис. 12).

Содержание ИФ-г в сыворотке крови у мышей, которым вводили лаксаран Z достоверно не отличался от уровня данного цитокина у контроля, а в случае с лаксараном 1936 наблюдалось уменьшение содержания ИФ-г в сыворотке крови через 1 и 6 часов. При введении лаксарана 1596 через 1 час наблюдалось достоверное увеличение этого цитокина в 1,5 раза, однако через 6 часов показатель содержания ИФ-г после введения лаксарана 1596 был на уровне контроля (рис. 13).

При изучении влияния лаксаранов на ИЛ-4 было показано, что при введении лаксарана Z уровень ИЛ-4 через 1 час достоверно увеличивался в 3 раза по отношению к контролю, а спустя 6 часов приближался к уровню контроля. При введении лаксаранов 1596 и 1936 на всем временном промежутке исследований уровень ИЛ-4 в крови исследуемых животных не отличался от контроля (рис.14).

В дальнейших экспериментах представляло интерес оценить действие лаксаранов in vivo на цитокиновый статус в сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой инфекции.

Было показано, что введение лаксарана Z через 1 час после заражения мышей не изменяет достоверно содержание ИЛ-1б в сыворотке крови по сравнению с контролем 2 (содержанием цитокина в сыворотке крови зараженных мышей), а через 6 часов повышается до значений концентрации этого цитокина в сыворотке крови здоровых животных (контроль 1), тогда как у зараженных мышей его содержание достоверно увеличивалось в 2,7 раза по отношению к контролю 1 (рис. 15). Отмечено аналогичное действие лаксарана 1936 на изменения содержания ИЛ-1б в сыворотке крови мышей при стафилококковой инфекции (рис. 15).

Исследование влияния лаксаранов на синтез цитокинов при моделировании стафилококковой инфекции

При введении лаксарана 1596 мышам через 1 час после инфицирования стафилококком достоверных изменений концентрации ИЛ-1б на всем периоде наблюдения не происходило по сравнению с содержанием этого цитокина в сыворотке крови зараженных мышей (контроль 2) (рис. 15).

Содержание ФНО-б в сыворотке крови зараженных мышей через 1 и 6 часов после воздействия лаксарана Z достоверно не отличалось от контрольных значений (для интактных животных и инфицированных стафилококком) (рис. 16).

На фоне действия лаксарана 1936 через 6 часов отмечено достоверное снижение уровня ФНО-б в сыворотке крови зараженных мышей в 1,2 раза по сравнению со значениями в контроле 2. Более значительным это снижение было также через 6 часов при введении лаксарана 1596 после моделирования стафилококковой инфекции: содержание ФНО-б уменьшалось в 2,6 раза по сравнению с контрольными значениями (рис. 16).

При оценке действия ЭПС лактобацилл на изменение содержания ИФ-г в сыворотке крови лабораторных мышей при моделировании стафилококковой инфекции (рис. 17) была отмечена сходная ответная реакция на введение лаксарана Z и 1936: достоверное снижение уровня этого цитокина через 1 час по сравнению к контролю 2 в 1,6 и 2,7 раз соответственно. Через 6 часов концентрация данного цитокина достоверно не отличалась от контроля 2 (рис. 17).

При введении лаксарана 1596 содержание ИФ-г в сыворотке крови зараженных мышей незначительно увеличивалось через 1 час по сравнению со значениями для инфицированных животных, через 6 часов после введения зараженным мышам содержание данного цитокина достоверно не отличалось от значений 1 часа при введении ЭПС зараженным мышам (рис. 17).

Установлено, что все исследованные ЭПС лактобацилл не вызывали достоверных изменений в содержании ИЛ-4 в сыворотке крови экспериментальных животных, инфицированных стафилококком, через 1 и 6 часов по отношению к контролю 1 и контролю 2 (рис 18).

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о возможности использования ЭПС лактобацилл в качестве профилактических иммуномодулирующих препаратов и для коррекции цитокинового статуса при некоторых инфекционных заболеваниях.

Выводы

1. Подобраны оптимальные условия культивирования для L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (среда A.Welman с соавт. (2003) в нашей модификации, 38°С, рН 5,5 время культивирования 44-46 ч культивирования) для обеспечения максимального продуцирования ими экзополисахаридов в лабораторных условиях.

2. Впервые выделены экзополисахариды L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 из культуральной жидкости. Усовершенствован метод получения ЭПС, который позволяет получать хроматографически чистые препараты.

3. Установлено, что ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 представляют собой нейтральные вещества с молекулярными массами 140, 220, 1700 кДа соответственно, обладают сходным моносахаридным составом, но различаются относительной вязкостью.

4. Показано, что ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 оказывают влияние на цитокиновый статус организма экспериментальных животных (мышей) в норме и при стафилококковой инфекции.

экзополисахарид кровь животное инфекционный

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Полукаров, Е.В. Выделение и очистка экзополисахаридов из молочнокислых бактерий / Е.В. Полукаров, Д.А. Жемеричкин, Л.В. Карпунина // Молодежь и наука XXI века: Материалы II-Открытой Всероссийской конференции, 24-26 апреля 2007. - Ульяновск, 2007. - С. 64.

2. Полукаров, Е.В. Оптимизация процесса получения экзополисахаридов лактобацилл / Е.В. Полукаров, Л.В. Карпунина, Е.Н. Бухарова // Вавиловские чтения - 2007: Материалы конференции, посвященной 120-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, 26 - 30 ноября, 2007. - Саратов, 2007. - С. 334.

3. Полукаров, Е.В. Оптимизация условий культивирования Lactobacillus bulgaricus для продуцирования экзополисахаридов / Л.В. Карпунина, Е.В. Полукаров, А.В. Нурмухамедов // Материалы конференции по итогам научно - исследовательской и производственной работы студентов за 2007 г., 7-11 апреля, 2008. - Саратов, 2008. - С. 8-9.

4. Полукаров, Е.В. Выделение экзополисахаридов Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus при различных условиях культивирования / Е.В. Полукаров, Л.В. Карпунина, Д.А. Жемеричкин // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2009. - №. 4. - С. 20-23.

5. Полукаров Е.В. Влияние лаксарана Z на цитокиновый статус мышей при моделировании стафилококковой инфекции / Е.А. Горельникова, Е.В. Полукаров, Л.В. Карпунина // Сборник материалов всероссийской научно-практической конференции 2-6 февраля 2009 года, посвященной 90-летию факультета (института) ветеринарной медицины. - Саратов, 2009. - С. 41-43.

6. Полукаров Е.В. Влияние экзополисахаридов Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus на цитокиновый статус лабораторных мышей / Е.А. Горельникова, Е.В. Полукаров, Л.В. Карпунина, Е.И. Тихомирова // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4-5. - С. 309-310.

Размещено на Allbest.ru