Способность пыльников и завязей Brassica oleracea L. к морфогенному развитию in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Способность пыльников и завязей Brassica oleracea L. к морфогенному развитию in vitro

УДК 635.33:581.4

Киракосян Р.Н., Калашникова Е.А.

Аннотация

Одним из путей повышения способности клеток репродуктивных органов к морфогенезу является применение метода «няньки», который приводит к стимулированию клеточных делений и кондиционированию среды. Исследования показали, что максимальное образование морфогенных структур у Brassica oleracea L. было отмечено при совместном культивировании завязи и пыльника в соотношении 1:5. При таком способе у гибридов и инбредных линий капусты белокочанной повысилась жизнеспособность и отзывчивость репродуктивных органов к органогенезу (до 2,36%) и каллусогенезу (4,8%) по сравнению с культивированием пыльников и завязей в отдельности.

Ключевые слова: капуста белокочанная, изолированные пыльники, изолированные завязи, in vitro

Введение

Капуста белокочанная (Brassica oleracea L.) является важным источником биологически активных соединений и питательных веществ, таких как витамины С и Е, растворимые волокна, ферменты с антиоксидантной активностью (каталаза, супероксид дисмутаза, пероксидаза и др.), каротиноиды, обладающие противовирусной, антибактериальной и противораковой активностью. Данная овощная культура также богата ценными метаболитами, которые включают антоцианы, терпены, сульфорафан, кумарины и глюкозинолаты, действующие в качестве модуляторов в защите ДНК от повреждения. Таким образом, мы можем сказать, что потребление капусты белокочанной и других овощей Brassica связано с предотвращением угроз развития хронических заболеваний, таких как болезни Альцгеймера, сахарный диабет, рак, сердечно-сосудистые заболевания и др. [1].

В связи со сложившейся обстановкой на мировой арене, вызванной сокращением импорта ряда продовольственных товаров в Россию, приоритетной задачей отечественной селекции является разработка новых, перспективных и усовершенствование имеющихся методов при создании сортов и гетерозисных гибридов сельскохозяйственных культур. Для выведения нового сорта капусты с комплексом хозяйственно-ценных признаков важно иметь разнообразный исходный материал с богатой генетической основой. Сочетание традиционных и биотехнологических методов селекции является эффективным в создании новых сортов с одновременным повышением продуктивности и устойчивости растений к абиотическим и биотическим стрессам.

Р.Г. Бутенко впервые в нашей стране подробно описала биотехнологические методы, включение которых в селекционный процесс позволит повысить его эффективность. К таким методам относятся: соматическая гибридизация, получение гаплоидных растений in vitro, клеточная селекция и др. [2].

Таким образом, для эффективного использования генетических ресурсов и реализации морфогенетического потенциала овощных культур необходимо проведение исследований, направленных на оптимизацию или усовершенствование технологий in vitro и их интеграцию в селекционные схемы создания конкурентоспособных гибридов и сортов овощных культур.

Изучение морфогенеза является одним из важных направлений клеточной и генной инженерии растений как для фундаментальных, так и прикладных исследований. Особое значение оно приобретает при культивировании репродуктивных органов растений in vitro. Реализация морфогенетического потенциала обусловливается комплексом взаимосвязанных факторов, которые необходимо учитывать при разработке технологий получения растений-регенерантов в зависимости от их генетических и физиологических особенностей.

Целью настоящей работы было изучить способность пыльников и завязей капусты белокочанной к морфогенезу от способа их культивирования in vitro.

Материалы и методы

Работа выполнена на кафедре генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева в период с 2012 по 2016 год. Исследования проводили на сортах капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) селекции ВНИИССОК: Зимовка 1474, Слава грибовская 231, а также на селекционном материале (инбредные линии и селекционные формы капусты белокочанной разных групп спелости), полученном в лаборатории селекции и семеноводства капустных культур ВНИИССОК. Растения-доноры выращивали в камерах искусственного климата лаборатории ВНИИССОК.

Объектом исследования служили изолированные пыльники и завязи капусты белокочанной.

Работу проводили на бутонах, которые изолировали как с главного, так и боковых побегов. В исследованиях был применен следующий вариант обработки соцветий: низкой положительной температурой (+4-6⁰ С) в течение 1 суток без помещения их в раствор БАВ и дальнейшее использование раствора Дропп (10 мг/л) в течение 2-х суток при температуре +4°С с последующим культивированием изолированных репродуктивных органов при температуре +32⁰ С в течение 1 суток.

Стерилизацию растительного материала проводили в 0,1% растворе сулемы в течение 3-4 минут, после чего их трижды промывали стерильной дистиллированной водой.

Пыльники и завязи асептически извлекали из бутонов в условиях ламинар-бокса и помещали на питательные среды, содержащие минеральный состав по прописи среды Мурасиге и Скуга (МС) [3]. Культивирование изолированных эксплантов проводили в чашках Петри при контролируемых условиях выращивания.

Культивирование пыльников и завязей проводили как при индивидуальном, так и при их совместном выращивании на следующих вариантах питательных сред:

1. среда по прописи МС без добавления фитогормонов, содержащих сахарозу 90 г/л и агар в концентрации 0,7 %;

2. безгормональная питательная среда по прописи МС с добавлением растворителя DMSO и содержащая сахарозу 30 г/л и агар в концентрации 0,7%;

3. безгормональная питательная среда по прописи МС с добавлением растительных экстрактов (1 мл/100 мл пит. среды), полученных из репродуктивных органов, и содержащая сахарозу 30 г/л и агар в концентрации 0,7%.

Чашки Петри с растительным материалом помещали в климатическую камеру (Binder, Германия) и инкубировали в темноте при температуре 35⁰ С в течение 5 суток, после чего температурный режим уменьшали до 25⁰ С. В этих условиях экспланты выращивали в течение 25 суток и затем переносили в световую комнату, где был установлен 16-часовой фотопериод и освещение белыми люминесцентными лампами с интенсивностью света 5 тыс. лк.

Результаты и обсуждение

Способность репродуктивных органов к морфогенезу in vitro обусловливается частотой индукции многоклеточных структур, что, в свою очередь, определяется комплексом экзогенных физических и биохимических факторов [4-7]. Эффективность образования морфогенных структур в культуре изолированных пыльников и завязей зависит от генотипа донорных растений, влияния состава питательных сред и условий культивирования [6]. Одним из путей повышения способности клеток репродуктивных органов к морфогенезу является применение метода «няньки», который приводит к стимулированию клеточных делений и кондиционированию среды [8]. В наших исследованиях было изучено взаимное влияние пыльников и завязи при их совместном культивировании in vitro.

Исследования показали, что максимальное образование морфогенных структур у Brassica oleracea L. было отмечено при совместном культивировании завязи и пыльника в соотношении 1:5, соответственно. При таком способе у гибридов и инбредных линий капусты белокочанной жизнеспособность и отзывчивость репродуктивных органов к органогенезу повысилась до 2,36% и каллусогенезу - 4,8% по сравнению с культивированием пыльников и завязей в отдельности (рис. 1).

В дальнейшем в этих вариантах наблюдали увеличение размеров пыльников и завязей, а также формирование каллусной ткани, частота которого составила в культуре пыльников 0,51%, а в культуре завязей - 0,43%. Однако на 20-е сутки с момента начала их культивирования отмечалось образование некротических участков, что приводило к гибели эксплантов и первичной каллусной ткани (рис. 2).

А

Б

В

Рис. 1. Отзывчивость репродуктивных органов к морфогенезу: А - при культивировании на питательной среде МС с добавлением DMSO; Б - при культивировании на питательной среде с добавлением растительного экстракта на основе DMSO; В - при культивировании на безгормональной питательной среде МС культивирование пыльник завязь

А - Совместное культивирование пыльников и завязей in vitro

Б - Культивирование пыльников in vitro

В - Культивирование завязей in vitro

Рис. 2. Варианты культивирования пыльников и завязей Brassica oleracea L. in vitro

В случае совместного культивирования репродуктивных органов в одной чашке Петри получены растения-регенеранты, которые были перенесены в нестерильные условия выращивания.

Следует отметить, что растительные экстракты, полученные из репродуктивных органов капусты белокочанной на основе DMSO, оказывают положительное влияние на процессы морфогенеза in vitro, и частота данного процесса была в 1,3-1,48 раза выше по сравнению с вариантом, где в состав питательной среды включали чистый растворитель DMSO и в 2,7-3 раза, чем в контрольном варианте (безгормональная среда МС). Это связано с тем, что именно в пыльце и незрелых семенах присутствуют важнейшие представители природных брассиностероидов: гомобрассинолид, норбрассинолид, эпибрассинолид и др., которые контролируют процессы роста, дифференцировки и размножения растений. С недостатком их в растениях связаны такие эффекты, как частичная, так и полная мужская стерильность. Исходя из результатов, полученных в данном эксперименте, установлено, что добавление в состав питательной среды растительных экстрактов на основе DMSO является одним из путей повышения морфогенетического потенциала культивируемых репродуктивных органов.

Выводы

Таким образом, мы экспериментально подтвердили, что одиночные клетки не способны производить все необходимые метаболиты для индукции деления, и их развитие зависит от активности окружающих клеток. Поэтому целесообразно проводить кондиционирование сред с совместным культивированием пыльников и завязей для создания условий их нормального роста и размножения.

Cписок использованных источников

1. Петрушко Ю.Н., Потемкина В.И., Федяй В.П. Белокочанная капуста. Современная ресурсосберегающая технология выращивания в условиях Приморского края. - Уссурийск. - 2003. - 76 с.

2. Бутенко Р.Г. Биотехнология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. - М.: ФБК Пресс. - 1999. - 159 с.

3. Murashige T. A, Skoog F. Revised medium for rapid growth and bioassays with to-bacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. - 1962. - V.15. - PP. 473-497.

4. Jauhar P.P. Haploid and doubled haploid production in durum wheat by anther culture. In: Maluszynski M et al (eds) Doubled haploid production in crop plants. - 2003. - Kluwer. PP. 167-172.

5. Last D.J, Brettell R.I.S. Embryo yield in wheat anther culture is influenced by the choice of sugar in the culture medium. - 1990. - Plant Cell Report 9: - PP. 14-16.

6. Sunderland N. The concept of morphogenetic competence with referrence to anther and pollen culture // Plant cell culture in crop improvement. - New York, London: Plenum press. - 1983. - PP. 125-139.

7. Torp A., Andersen S. Albinism in microspore culture. In: Touraev A, Forster BP, Jain SM, editors. Advances in haploid production in higher plants. - Dordrecht: Springer. - 2009. - PP. 155-160.

8. Калашникова E.A. Клеточная инженерия растений. - М.: Издат-во МСХА. - 2012. - 317 с.

Цитирование:

Киракосян Р.Н., Калашникова Е.А. Компетенция пыльников и завязей Brassica oleracea L. к морфогенному развитию in vitro // АгроЭкоИнфо. - 2016, №1. http://agroecoinfo.narod.ru/journal/STATYI/2016/1/st_54.doc.

Размещено на Allbest.ru