Диагностика Y-вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Диагностика Y-вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье

Специальность 06.01.07 - защита растений

На правах рукописи

Вологин Семен Германович

Москва - 2013

Работа выполнена в отделе сельскохозяйственной биотехнологии Татарского научно-исследовательского института сельского хозяйства Россельхозакадемии

Научный руководитель: Замалиева Фания Файзрахмановна доктор сельскохозяйственных наук

Официальные оппоненты: Упадышев Михаил Тарьевич доктор сельскохозяйственных наук, заведующий центром защиты и биотехнологии растений ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии

Усков Александр Иринархович кандидат биологических наук, заведующий отделом биотехнологии и иммунодиагностики ГНУ ВНИИКХ им. А.Г. Лорха Россельхозакадемии

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Казанский государственный аграрный университет

Защита состоится «17» декабря 2013 г. в 15-00 часов на заседании диссертационного совета Д220.043.04 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан «13» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Смирнов А.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Y-вирус картофеля (YВК) широко распространен во всем мире и относится к числу наиболее вредоносных агентов поражающих культуру картофеля. Инфицирование YВК приводит к снижению урожайности на 30-90% [Struik, Wiersema, 1999]. К причинам широкого распространения патогена относят нарушение агротехнических приемов возделывания, использование зараженного семенного материала, а также несовершенство методов обнаружения вируса [Иванюк и др., 2005].

Область диагностики и идентификации вирусов является важным элементом в сфере защиты растений от болезней. Современные системы ведения семеноводства картофеля на оздоровленной безвирусной основе предусматривают применение диагностического контроля вирусного поражения на различных этапах семеноводческого процесса с целью своевременного удаления инфицированных партий посадочного материала из агропромышленного производства [Замалиева, 2009]. Также методы лабораторной диагностики применяются в ходе селекционного процесса при создании сортов картофеля устойчивых к YВК [Салихова и др., 2012].

В последние годы в России разработаны тест-системы для обнаружения вирусов картофеля, основанные на иммунобиологических и молекулярно-генетических методах исследования [Бобкова и др., 2003; Drygin et al., 2007; Бызова и др., 2009; Рязанцев, Завриев, 2009; Комаров и др., 2013]. При этом остаются не достаточно изученными аспекты, связанные преаналитической подготовкой биоматериала, условиями его обработки и хранения. Также, практически не уделяется внимание вопросам, связанным с биометрической интерпретацией данных. Эти аспекты могут оказывать влияние на достоверность результатов фитосанитарного мониторинга.

В настоящее время большую значимость приобретает фитосанитарный мониторинг, предусматривающий оценку видового и штаммового состава вирусов растений. Известно, что YВК обладает сложной популяционной структурой, включающей несколько штаммов, приводящих к образованию различных симптомов на растениях картофеля [Smith, Dennis, 1940; De Bokx, Huttinga, 1981; Beczner et al., 1984; Chrzanowska, 1987; Le Romancer et al., 1994; Blanco-Urgoiti et al., 1998; Chikh Ali et al., 2008; Chikh Ali et al., 2010]. Наибольшую угрозу для агропромышленного производства представляют штаммы, индуцирующие некротическое поражение клубней картофеля, приводящие к значительному снижению их товарного вида и пищевой ценности [Вайдеманн и др., 1999; Иванюк и др., 2005]. Также серьезную опасность несут рекомбинантные формы YВК, характеризующиеся высокой эффективностью переноса с помощью насекомых [Verbeek et al., 2010]. В результате быстрого распространения рекомбинантных штаммов YВК, способных к индукции некрозообразования, многие сорта картофеля потеряли свою привлекательность для сельскохозяйственного производства [Basky, 2002].

В Средневолжском регионе России сосредоточены значительные площади посадок семенного и товарного картофеля. Кроме того, здесь функционирует ряд крупных селекционных и семеноводческих учреждений. В связи с этим, исследование аспектов связанных с лабораторной диагностикой и фитосанитарным мониторингом популяционного состава YВК на территории данного региона является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление особенностей диагностического выявления YВК и штаммового состава патогена в Среднем Поволжье.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Усовершенствовать процесс подготовки растительного материала для диагностического обнаружения YВК.

2. Изучить уровень распространения YВК и других вирусных патогенов в растениях картофеля открытого грунта, а также в меристемных линиях in vitro.

3. Осуществить биометрический анализ данных ИФА, полученных при диагностике YВК.

4. Исследовать штаммовый состав вируса на территории Среднего Поволжья.

Научная новизна. Впервые установлен эффект повышения достоверности результатов лабораторной диагностики при использовании комплекса преаналитических факторов: однократного цикла замораживания-оттаивания разрушенной листовой ткани растений, а также внесения в состав листовых и клубневых проб картофеля мертиолята натрия и тиосалициловой кислоты. С помощью биометрического анализа выявлено существование взаимосвязи между результатами ИФА и процессом распространения патогена в вегетативных поколениях картофеля. Впервые на территории Среднего Поволжья обнаружена циркуляция штаммов YВКNTN и YВКN-Wi, индуцирующих развитие симптомов кольцевого некроза клубней картофеля. На территории европейской части России показано распространение изолятов YВК, обладающих рекомбинантной формой генома.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть применены в испытательных лабораториях системы Россельхознадзора и Россельхозцентра, а также в учреждениях, связанных с семеноводством и селекцией картофеля. Разработанный алгоритм преаналитической подготовки исследуемого материала используется в ГНУ ТатНИИСХ при диагностическом выявлении вирусов в системе семеноводства картофеля на оздоровленной основе. Охарактеризованные изоляты YВК могут быть использованы в селекционных исследованиях при создании форм растений устойчивых к патогену, а также могут быть применены при создании диагностикумов и контрольной панели образцов, предназначенной для оценки качества работы диагностических тест-систем.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа проводилась в соответствие с темами 04.15.01 и 04.15.02 Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению агропромышленного комплекса Российской Федерации на период 2006-2010 и 2011-2015 гг. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора (2005-2013 гг).

Положения выносимые на защиту.

1. Алгоритм пробоподготовки растительного материала, повышающий эффективность диагностических исследований методом ИФА.

2. Зависимость данных ИФА от продолжительности распространения YВК в ряду вегетативных поколений картофеля.

3. Структура патогена на территории Среднего Поволжья, представленная изолятами, проявляющими свойства штаммов YВКО, YВКN, YВКNTN, YВКN-Wi и обладающими рекомбинантной формой генома.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на XI Международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007), IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro» (Зеленоград, 2008), научно-практической конференции «Картофелеводство: результаты, инновации, практический опыт» (Москва, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» (Казань, 2009), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные разработки молодых ученых - АПК России» (Казань, 2010), Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы научных исследований по картофелеводству, овощеводству и бахчеводству» (Алматы, 2011), III международного симпозиума «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011), Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России» (Екатеринбург, 2012), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы и перспективы аграрной науки в России» (Саратов, 2012), Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного комплекса России» (Казань, 2012), VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012), I международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013), научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии» (Ростов-на-Дону, 2013), Всероссийской научной конференции с международным участием «Биотехнологии: наука и практика, инновации и бизнес» (Астрахань, 2013)

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 20 научных работ, из них 2 статьи в ведущих рецензируемых изданиях, 9 - в материалах всероссийских и международных конференций.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждений, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация содержит 21 таблицу, 23 рисунка и 1 приложение. Список литературы включает 189 литературных источников, в том числе 122 на иностранном языке.

картофель вирусный штаммовый меристемный

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил биоматериал различных сортов и гибридов картофеля (Solanum tuberosum L.).

Листовые образцы отбирали со среднего яруса растений, находившихся в фазе цветения. Образцы клубней выдерживали при комнатной температуре в защищенном от света месте до выхода этиолированных ростков.

Культивирование растений в асептической культуре in vitro осуществляли в стеклянных пробирках на среде Мурасига-Скуга при комнатной температуре и 16 часовом световом периоде. Для диагностических исследований использовали побеги растений достигших размера 10-15 см.

Инфицирование растений картофеля вирусом проводили в марлевом изоляторе, расположенном на территории ГНУ ТатНИИСХ (г. Казань). Для этого нарушали пространственную изоляцию и в течении 14 суток с помощью естественного лёта насекомых, происходил перенос YВК с инфицированных растений обсадки на здоровые экспериментальные растения. В дальнейшем пространственную изоляцию восстанавливали, жизнедеятельность насекомых-переносчиков прерывалась применением инсектицидного препарата.

Идентификация штаммовой принадлежности YВК проводилась согласно алгоритму, описанному в работе [Шуберт и др., 2004]. Искусственное заражение растений табака (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) проводили в марлевом изоляторе с помощью механической инокуляции инфицированным биоматериалом картофеля.

Иммуноферментный анализ проводили на полистироловых планшетах ОАО «Медполимер» (Россия) с использованием наборов поликлональных (Bioreba, Швейцария) и моноклональных (Neogen Europe, Великобритания) антител к вирусам картофеля. Детекцию осуществляли на многоканальном фотометре «Opsys MR» (Dinex Tech., США) при длине волны 405 нм против референсного светофильтра (620 нм). Рассчитывался коэффициент позитивности - отношение величины оптической плотности исследуемого образца (ОП405) к значению критического порога (Р).

Реакцию ОТ-ПЦР проводили с использованием реактивов НПФ «СибЭнзим» (Россия) на приборах «Терцик МС-2» (ДНК-технология, Россия) и «Mastercycler Gradient» (Eppendorf, Германия). Для ПЦР-диагностики вирусов картофеля, идентификации штаммового состава и секвенирования P1-гена YВК применяли олигонуклеотиды описанные в работах [Фолимонова и др., 1998; Nie, Singh, 2001; Зайнуллин, Зайнуллина, 2003; Volkov et al., 2009]. Определение сайтов рекомбинации в генах HC-Pro и VPg осуществляли в системе мультиплексной ОТ-ПЦР согласно работе [Lorenzen et al., 2006]. Для конструирования оригинальных праймеров использовали программу Oligo 6.0. Очистка ПЦР-продуктов и процедура секвенирования проводилась в лаборатории ЗАО «Синтол» (Россия) на приборе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США). Результаты секвенирования обрабатывали с помощью программ BioEdit 7.1.3.0, BLAST, Mega 5.1 и SimPlot.

Математическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения Excel 2003 и Statistica 6.0. Построение вариационных рядов выполняли согласно [Лакин, 1990]. Расчет достоверности различий при нормальном распределении признака осуществляли с помощью t-критерия Стьюдента, в случае не соответствия признака нормальному распределению - непараметрического T-критерия Уилкоксона [Реброва, 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Преаналитическая подготовка растительного материала

Первым элементом преаналитической подготовки служит стадия разрушения растительного материала, способствующая переходу фитопатогенов из биологических тканей в диагностически-доступную водосодержащую фракцию пробы. Исследование трех способов разрушения листовых и клубневых образцов показало, что во всех случаях разрушенный биоматериал оказался неоднородным и содержал в своем составе включения разрушенных растительных компонентов (РРК).

Было исследовано влияние на результаты ИФА состава биопроб и условий их температурного хранения. При исследовании листовых проб, содержащих включения РРК и хранившихся в условиях холодильной камеры (температура +2…+8 _С) на протяжении 16 часов, был выявлен более низкий уровень детектируемого сигнала (рис. 1а), по сравнению с пробами не содержащих этих включений (p<0,01). В тоже время, в пробах, хранившихся в условиях морозильной камеры (температура -18…-25 _С) и, таким образом, подвергнутых однократному циклу замораживания-оттаивания, обнаружено достоверное возрастание величины коэффициента позитивности (p<0,01). Анализ листовых проб, подвергнутых центрифугированию и, таким образом, не содержавших в своем составе РРК, не выявил значимого влияния процедуры замораживания-оттаивания на результаты диагностики (p>0,05).

Рис. 1. Влияние состава биоматериала и условий его температурного хранения на результаты ИФА: а - листовые пробы, б - клубневые пробы. 1 - пробы содержащие РРК, 2 - пробы не содержащие РРК

При изучении этиолированных клубневых ростков было установлено негативное действие РРК на результаты ИФА (рис. 1б). Различия, выявленные между пробами, содержащими и не содержащими РРК, оказались статистически достоверными (p<0,01). Данное воздействие не зависело от температуры хранения данного биоматериала.

В дальнейших экспериментах был зафиксирован выход из РРК дополнительного количества вируса при проведении цикла замораживания-оттаивания осадочной фракцией листовых проб (данные представлены в диссертации). Полученные данные позволили сделать заключение о том, что РРК, являются ценным диагностическим материалом, а процесс их замораживания с последующим удалением - обязательный элемент подготовки растительного материала для проведения диагностических исследований.

Эксперименты по введению в состав листовых и клубневых проб картофеля химических соединений обладающих высокой буферной емкостью показало, что при различных режимах пробоподготовки наиболее оптимальным является применение 0,1 М Tris-HCl буфера (данные представлены в диссертации).

Хранение биологического материала может быть осуществлено при введении в его состав химических соединений, обладающих антисептическими, бактерицидными и фунгицидными свойствами. В данной работе было исследовано преаналитическое действие двух соединений - азида натрия и мертиолята натрия (тимерозала).

Внесение 0,01 М азида натрия совместно с 0,1 М Tris-HCl буфером в состав листовых проб вызвало достоверное (p<0,01) снижение величины детектируемого сигнала (рис. 2). Использование данного соединения при подготовке этиолированных клубневых ростков привело к небольшому снижению исследуемого показателя, которое оказалось статистически не значимым (p>0,05). На основании полученных данных было сделано заключение о нежелательности использования азида натрия в процессах преаналитической подготовки растительного материала.

Рис. 2. Преаналитическое воздействие консервирующих соединений на ИФА К - контроль, АН - азид натрия (0,01 М), МН - мертиолят натрия (0,01 М)

Введение мертиолята натрия в состав растительных образцов приводило к статистически значимому повышению уровня детектируемого сигнала (p<0,01). Позитивное воздействие соединения не зависело от вида исследуемого материала и обнаруживалось при изучении листовых и клубневых проб картофеля. Было сделано предположение, что выявленный эффект связан с процессом трансформации тимерозала с образованием двух соединений: метилртути и тиосалициловой кислоты. Последнее соединение имело в своем составе тиогруппу, присутствие которой могло блокировать негативное воздействие веществ полифенольного ряда на аминокислотную структуру вирусного белка оболочки.

Эффект внесения 0,01 М тиосалициловой кислоты в состав листовых (рис. 3а) и клубневых (рис. 3б) проб оказался сопоставимым с влиянием других тиосодержащих соединений: 2-меркаптоэтанола и тиогликолевой кислоты, а также соединений, обладающих антиоксидантными (сульфит натрия, аскорбиновая кислота), хелатирующими (ЭДТА) и фенолсвязывающими (поливинилпироллидон) свойствами, внесенными в такой же концентрации.

Рис. 3. Влияние стабилизирующих соединений на результаты ИФА: а - листовые образцы, б - клубневые образцы. К - контроль, ТСК - тиосалициловая кислота, МЭ - 2-меркаптоэтанол, ЭДТА - этилендиаминтетроуксусная кислота, ПВП - поливинилпироллидон, СН - сульфит натрия, АСК - аскорбиновая кислота

Различия, выявленные между контролем и экспериментальными вариантами, оказались статистически достоверными (p<0,05). В тоже время между всеми экспериментальными вариантами достоверных статистических различий обнаружено не было (p>0,05). Согласно полученным результатам, антисептическое действие тиосалициловой кислоты на протяжении 7 суток хранения в условиях холодильной камеры оказалось сопоставимым с эффектом внесения в растительные ткани мертиолята натрия. Учитывая высокую токсичность ртутьсодержащих соединений, было сделано заключение о предпочтительном применении в ходе пробоподготовки нетоксичной тиосалициловой кислоты.

На основании проведенных исследований предложен следующий алгоритм преаналитической подготовки. После процедуры разрушения растительный материал вносится в полипропиленовые емкости, содержащие 0,1 М Tris-HCl буфер и 0,01 М тиосалициловую кислоту, затем он подвергается замораживанию и до постановки анализа хранится в условиях морозильной камеры (температура -18…-25 _С). По завершении хранения и процесса оттаивания, РРК удаляются с помощью центрифугирования и полученный супернатант вводится в диагностическое исследование. Сравнительное изучение, проведенное методом ИФА доказало эффективность разработанного комплекса преаналитических процедур (табл. 1).

Таблица 1 - Сравнительный анализ способов пробоподготовки

Вариант	n	Количество YВК-позитивных образцов
		Стандартный алгоритм	Разработанный алгоритм
		шт.	шт.	% к стандарту
Листовые пробы	704	91	97	+ 6,6*
Клубневые пробы	528	122	134	+ 9,8**

Примечание: n - количество исследованных образцов, * - p<0,05; ** - p<0,01

Подтверждение эффективности данного алгоритма также было получено при изучении растений картофеля, регенерированных из апикальной меристемной ткани и растущих на искусственных питательных средах.

В ходе диагностического исследования 127 меристемных линий, с помощью метода ИФА было выявлено 29 YВК-позитивных образцов. При этом, применение разработанного алгоритма позволило повысить уровень детектируемого сигнала и достоверно диагностировать YВК в 4 образцах (13,8% от количества инфицированных линий), не обнаруженных при использовании обычного способа пробоподготовки (рис. 4, образцы 1-4). Кроме того, применение данного алгоритма позволило сделать заключение о наличии вируса в образце, результаты которого при обычном способе диагностики находились в области сомнительных результатов (рис. 4, образец 5).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Преаналитическая подготовка биоматериала при диагностике YВК в меристемных линиях картофеля

Содержание YВК в данных серонегативных образцах было подтверждено с помощью метода ОТ-ПЦР.

Разработанный алгоритм преаналитической подготовки растительного материала в последствие был использован при проведении диагностических исследований вирусных патогенов в семенном материале картофеля.

Мониторинг вирусных патогенов в условиях открытого грунта

Скрининговое диагностическое исследование, осуществленное методом ИФА, позволило оценить уровень распространения основных вирусных патогенов, поражающих посадки семенного картофеля в северной части Среднего Поволжья (табл. 2).

Таблица 2 - Уровень распространения вирусов картофеля в семенном материале суперэлитной репродукции

Год	n	Количество инфицированных образцов
		YВК	МВК	ХВК	ВСЛК
		шт.	%m	шт.	%m	шт.	%m	шт.	%m
2005	1 285	137	10,70,9	13	1,00,3	10	0,80,2	1	0,10,1
2006	688	32	4,70,8	21	3,10,7	3	0,40,3	0	0,0
2007	905	163	18,01,3	10	1,10,3	5	0,60,2	0	0,0
2008	1 196	185	15,51,0	57	4,80,6	96	8,00,8	3	0,30,1
2009	824	69	8,41,0	4	0,50,2	2	0,20,2	0	0,0
2010	756	196	25,91,6	7	0,90,3	0	0,0	0	0,0
2011	1 484	452	30,51,2	15	1,00,2	2	0,10,1	0	0,0
2012	1040	89	8,50,9	20	1,90,4	0	0,0	0	0,0

В течение восьми вегетационных сезонов было исследовано 8178 листовых проб. Наибольшим уровнем распространения характеризовался YВК. Было выявлено 1323 инфицированных образца, что составило 16,2% от всего исследованного материала.

На протяжении всего периода диагностических исследований в посадках картофеля стабильно выявлялся другой инфекционный агент - М-вирус картофеля (МВК). Было диагностировано 147 случаев поражения данным вирусом, с частотой встречаемости за период исследований 1,9%.

Диагностическое обнаружение Х-вируса картофеля (ХВК) было менее стабильным. Во все годы исследований диагностирование патогена находилось на низком уровне, за исключением данных 2008 г, в котором был выявлен значительный рост заболевания. Всего патоген был диагностировано в 118 образцах (1,4%).

Случаи инфицирования растений вирусом скручивания листьев картофеля (ВСЛК), отмечались крайне редко. Было обнаружено всего 4 вируссодержащих образца, что составило 0,05% от всего исследуемого материала.

Диагностика вирусов в меристемных линиях картофеля.

Применение биотехнологических методов получения безвирусных растений, возможно не только в процессе семеноводства сортов картофеля, но и при проведении селекционной работы. Сочетание селекционного и биотехнологического процессов позволяет осуществлять оздоровление перспективных гибридов до проведения государственного сортоиспытания и может обеспечить более быстрое внедрение новых сортов в производственную практику.

С помощью методов ИФА и ОТ-ПЦР было исследовано 175 образцов растений картофеля, регенерированных из апикальной меристемной ткани и растущих in vitro. В том числе 103 линии, регенерированные из сортов российской и зарубежной селекции, а также 72 линии перспективных гибридов, полученных в лаборатории селекции картофеля ГНУ ТатНИИСХ. Сравнительный анализ двух методов диагностики показал, что использование ОТ-ПЦР характеризовалось более высокой эффективностью, чем применение ИФА (табл. 3), являющегося основным методом лабораторного обнаружения патогенов в растениях картофеля растущих in vitro [ГОСТ 29267-91]. С помощью генодиагностики было выявлено: 1 ВСЛК-, 11 YВК- и 15 МВК-инфицированных меристемных линий, которые не были детектированы в ИФА. Дальнейший анализ данных был основан на результатах ПЦР-диагностики. В растениях, регенерированных из тканей сортов картофеля, были обнаружены все четыре диагностируемых патогена. Наибольшей частотой встречаемости характеризовался YВК. В меристемных линиях гибридов были диагностированы только два патогена, причем частота встречаемости МВК более чем в 3,5 раза превосходила частоту с которой выявлялся YВК (табл. 4).

Таблица 3 - Сравнительный анализ применения методов ИФА и ОТ-ПЦР при выявлении вирусов в меристемных линиях картофеля

Метод	Количество исследованных линий, шт.	Количество инфицированных линий, шт. (% m)
		YВК	МВК	ХВК	ВСЛК
ИФА	175	39 (22,3±3,1)	52 (29,7±3,5)	10 (5,7±1,8)	2 (1,1 ±0,8)
ОТ-ПЦР		50** (28,6±3,4)	67** (38,3±3,7)	10 (5,7±1,8)	3 (1,7±1,0)

Примечание: % m - относительное количество с ошибкой доли; ** - p<0,01

При анализе структуры инфицирования изучаемых образцов было выявлено, что количество неинфицированных линий, полученных из образцов перспективных гибридов, достоверно превосходило аналогичный показатель, обнаруженный у линий сортового происхождения.

Таблица 4 - Видовой состав вирусов, выявленный в меристемных линиях

Патоген	Сорта (n = 103)	Гибриды (n = 72)
	шт.	% ± m	шт.	% ± m
YВК**	39	37,9 ± 4,8	11	15,3 ± 4,2
МВК**	27	26,2 ± 4,3	40	55,6 ± 5,9
ХВК*	10	9,7 ± 2,9	0	0,0
ВСЛК	3	2,9 ± 1,7	0	0,0

Примечание: % m - относительное количество с ошибкой доли; * - p<0,05; ** - p<0,01

Количество линий, обладавших вирусной моноинфекцией, в исследуемых вариантах статистически не различалось. В то же время, при получении растений-регенерантов из сортового материала количество образцов пораженных смешанным типом инфекции было достоверно выше (p<0,05), чем при регенерации растений из тканей гибридов.

Биометрический анализ данных ИФА

Наблюдения, проведенные при выполнении скрининговых диагностических исследований, с применением как поликлональных, так и моноклональных антител, показали, что содержание YВК определяемое с помощью ИФА, не подчиняется закону нормального распределения, а в диагностических выборках было отмечено выраженное проявление элементов асимметрии и эксцесса. Выявлено четыре вида вариационных кривых, связанных с комбинированием различных типов асимметрии и эксцесса. Обнаруженные формы вариационного ряда оказались свойственны выборкам, сформированным как из листовых, так и клубневых проб картофеля.

Было выдвинуто предположение, что данные ИФА о содержании YВК-антигена отражают динамику распространения вирусной инфекции в популяции растений картофеля. Для проверки этой гипотезы был поставлен эксперимент с искусственным заражением растений картофеля. Заражение растений YВК проводилось в условиях защищенного грунта с помощью создания искусственного инфекционного фона и свободного лёта насекомых-переносчиков из популяции естественной среды.

При первичном YВК-инфицировании растений картофеля была выявлена одновершинная форма распределения признака с асимметричным смещением кривой и высоким накопление частот в левой части вариационного ряда (рис. 5а).



А)

Б)

Рис. 5. Вариационный ряд содержания YВК в листовых пробах (2007-2010 гг.): а - одновершинная форма кривой, б - двухвершинная форма кривой: 1 - первично-инфицированные растения, выращенные в защищенном грунте; 2, 3, 4 - растения, выращенные в открытом грунте, соответственно на 2, 3 и 4 год после заражения

Изучение растений, выращенных из инфицированного клубневого потомства (второй год исследований) в условиях открытого грунта, показало, что распределение изучаемого признака также оказалось одновершинным. На протяжении двух последующих вегетационных сезонов (третий и четвертый год исследований) был обнаружен переход от одновершинной к двухвершинной форме распределения признака (рис. 5б), сопровождавшийся постепенным переходом частот из левой части в правую часть вариационного ряда.

Уровень содержания YВК в листовых пробах растений картофеля на протяжении первого и второго годов репродуцирования характеризовался положительными величинами коэффициентов асимметрии и эксцесса (табл. 5). В ходе третьего и четвертого годов выращивания был выявлен постепенный переход этих статистических показателей к отрицательным величинам. На протяжении четырех вегетационных сезонов отмечено последовательное повышение уровня содержания YВК, о чем свидетельствовало увеличение вариационного размаха, межквартильного интервала, среднего арифметического значения и медианы.

Таблица 5 - Статистические показатели данных ИФА при YВК-инфицировании вегетативных репродукций картофеля (коэффициент позитивности, отн. ед.)

Показатель	Защищенный грунт	Открытый грунт
	1 год	2 год	3 год	4 год
Выборка, шт.	17	26	31	59
min - max	1,00 - 2,47	1,01 - 5,75	1,00 - 24,54	1,05 - 51,02
P25 - P75	1,12 - 1,56	1,18 - 1,96	2,32 - 19,02	2,57 - 46,43
Х	1,33	1,92	10,15	26,91
Ме	1,18	1,22	7,38	32,02
	0,39	1,37	8,05	19,97
Cv, %	29,32	71,35	79,31	74,21
As	+1,94**	+2,10**	+0,58	-0,21
Ex	+3,92***	+3,70***	-1,18***	-1,78***

Примечание: min-max - вариационный размах, P25-P75 - межквартильный интервал, Х - среднее арифметическое значение, Ме - медиана, - стандартное отклонение, Cv - коэффициент вариации, As - коэффициент вариации, Ex - коэффициент эксцесса. Знаком «*» отмечено достоверное отклонение показателей варьирования от нормального распределения: ** - p<0,01; *** - p<0,001

Параллельно с этим, происходило увеличение показателей варьирования: стандартного отклонения и коэффициента вариации. Наименьший уровень варьирования был обнаружен у первично-инфицированных растений картофеля, которые выращивались в условиях защищенного грунта. При возделывании растений в открытом грунте величина коэффициента вариации возрастала более чем в 2 раза, и в дальнейших поколениях оставалась относительно стабильной.

Структура популяции YВК в Среднем Поволжье.

Исследование YВК-инфицированных образцов, проведенное с использованием моноклональных антител, позволило установить частоту распространения ординарного (O/С) и некротического (N) серотипов вируса на территории северной части Среднего Поволжья, а также в двух прилегающих районах Волго-Вятского региона России (табл. 6).

Во всех исследованных популяциях обнаружена относительно высокая частота циркуляции N-серотипа, ранее считавшегося малораспространенным на данной территории.

Установление штаммового состава изолятов YВК было осуществлено по совокупности визуального наблюдения симптомов болезни на растениях картофеля, результатов искусственного заражения растений табака, а также определения серологических свойств изучаемых изолятов. В ходе исследования обнаружено несколько различающихся групп патогена.

Таблица 6 - Частота распространения серотипов YВК (2011-2012 гг.)

Точка учета	n	Количество образцов, шт.	Частота серотипа, %m
		O/C	N	O/C+N	O/C	N
с. Большие Кабаны (Республика Татарстан)	510	204	174	127	53,02,2	47,02,2
с. Савали (Кировская область)	289	103	73	107	55,32,9	44,72,9
с. Комсомольское (Чувашская Республика)	159	25	104	23	24,03,4	76,03,4

Изоляты первой группы (Smr1-04, Smr2-04, Kzn2-06, Kzn68-12, Kms1-11), проявляли положительную реакцию с YВКО/С-специфичными моноклональными антителами, не вызывали морфологических изменений на клубнях картофеля; при искусственном заражении растений табака приводили к симптомам просветления листовой ткани, примыкающей к листовым жилкам. Данная совокупность изолятов была идентифицирована как ординарный штамм YВКO.

Вторая группа (изоляты Kzn1-05, Kzn62-12, Kzn77-12, Kms2-11, Ekt1-11) взаимодействовали с YВКN-специфичными антителами, не индуцировали морфологических изменений на клубнях картофеля. При искусственном инфицировании растений табака образцы Kzn1-05 и Kzn77-12 индуцировали процесс некротизации листовой ткани. Данная группа изолятов была идентифицирована как генетически-различающиеся варианты некротического штамма YВКN.

К третьей группе были отнесены образцы Kzn2-05, Kzn69-12 и Stv1-11, которые, взаимодействуя с YВКО/С-специфичными антителами, вызывали процесс некротизации тканей табака. Изоляты данной группы были идентифицированы, как штамм YВК-Wilga (YВКN-Wi).

При изучении клубневого материала, выращенного на территории Республик Татарстан, Чувашия и Удмуртия, а также Пензенской, Свердловской и Челябинской областей, на поверхности клубней различных сортов и гибридов картофеля были выявлены некротические кольца, дуги, а также вдавленные участки из опробковевшей ткани (рис. 6а). В процессе хранения кольцевые структуры углублялись, растрескивались, а в ряде случаев распространялись на значительную часть поверхности клубня (рис. 6б). Некротическая зона была представлена поверхностной опробковевшей тканью, не затрагивавшей сосудистое кольцо (рис. 6в). Выявленные симптомы являлись характерными проявлениями кольцевого некроза клубней картофеля (КНКК).



Рис. 6. Кольцевой некроз клубней картофеля: а - после уборки урожая, б - после хранения на протяжении 6 месяцев, в - особенности процесса некротизации

Обнаружение зараженных растений носило спорадический характер. Согласно результатам трехлетнего изучения средневзвешенная частота встречаемости морфологически-выявляемой формы болезни в учетной точке, расположенной около с. Бол. Кабаны (Республика Татарстан) составила 0,2% от всей проанализированной выборки (табл. 7).

Таблица 7 - Частота встречаемости растений имеющих клубни с проявлениями кольцевого некроза

Годы	Количество исследованных растений, шт.	Количество инфицированных растений
		шт.	%
2009	10 245	15	0,15
2010	9 510	17	0,18
2011	10 664	28	0,25

Изучение в условиях защищенного грунта показало, что при посадке в торфогрунт до 30% некротизированных клубней поражались почвенными патогенами и не давали всходов. Частота образования некрозов в клубневом потомстве пораженных образцов в различные годы варьировала и редко превышала 70 % уровень. На протяжении шести месяцев послеуборочного хранения количество клубней содержащих кольцевые некрозы не изменялось.

Дифференциальная диагностика, проведенная с помощью метода ИФА, показала отсутствие в данных образцах вируса метельчатости верхушки картофеля (ВМВК) и вируса погремковости табака (ВПТ), способных вызывать развитие подобных симптомов [Le Romancer et al., 1994]. В то же время, все образцы с проявлениями КНКК оказались позитивными в реакции с видоспецифичными YВКО/С/N антителами. Большинство изученных изолятов YВК, выявленных в материале с симптомами КНКК показали положительную реакцию на наличие N-серотипа, а также индуцировали развитие некротических поражений листовой ткани табака. Было сделано предположение, что возбудителем выявленных случаев кольцевого некроза является штамм YВКNTN.

Для проверки данного предположения была проведена идентификация патогена с помощью метода ОТ-ПЦР (рис. 7).

Рис. 7. Идентификация штамма YВКNTN с помощью реакции ОТ-ПЦР М-маркер молекулярных размеров; 1 -отрицательный контроль; 2 - образец Kzn2-06 (YВКО), 3 - образец Kzn1-05 (YВКN), 4-8 - образцы Kzn1-06, Kzn3-06; Kzn4-06, Kzn1-08 и Kzn4-08 (YВКNTN)

При исследовании образцов, обладающих проявлениями КНКК, был выявлен фрагмент, размером 835 п.н., соответствующий амплифицируемой нуклеотидной последовательности штамма YВКNTN.

Штаммовый состав возбудителя КНКК оказался неоднородным. Согласно данным серодиагностики, процесс некротизации клубней картофеля в трех образцах - Kzn6-06, Kzn25-11 и Kzn32-11 был индуцирован вирусом, обладающим О/C-серотипом. При этом искусственное заражение растений табака только биоматериалом образца Kzn32-11 приводило к процессу некротизации листовых жилок. Данные изоляты были идентифицированы нами как КНКК-индуцирующие варианты штамма YВКN-Wi.

В настоящее время происхождение различных штаммов YВК связывают с процессом гомологичной рекомбинации, протекающим между базовыми YВКO- и YВКN-генотипами вируса [Blanco-Urgoiti et al., 1998].

Рис. 8. - Поиск рекомбинационных сайтов с помощью мультиплексной ОТ-ПЦР: М - ДНК-маркер, 1 - негативный контроль, 2 - Kzn68-12 (YВКО), 3 Kzn32-11 (YВКN-Wi), 4 - Kzn1-05 (YВКN), 5 - Ekt2-11 (YВКNTN), 6 - Kzn3-06 (YВКNTN), 7 - Izh1-11 (смесь штаммов), 8 - Pnz1-11 (смесь штаммов)

Поиск, проведенный с помощью мультиплексной ОТ-ПЦР, выявил в геноме всех изолятов, отнесенных к штаммам YВКN и YВКNTN, двух рекомбинантных точек (рис. 8), находящихся в генах HC-Pro и VPg. Об этом свидетельствовало присутствие на электрофореграмме двух фрагментов, обладавших молекулярным размером 181 и 452 п.н. В случае изолятов, отнесенных к штаммам YВКО и YВКN-Wi, было обнаружено одно рекомбинационное событие в гене HC-Pro. В этом случае на электрофореграмме присутствовали фрагменты с молекулярной массой 181 и 689 п.н., причем амплификация последнего фрагмента свидетельствовала об отсутствии рекомбинационного перехода в гене VPg.

Также, рекомбинационному анализу была подвергнута нуклеотидная последовательность Р1-гена YВК (рис. 9). Все образцы, принадлежащие к штаммам YВКN и YВКNTN обладали нуклеотидной последовательностью, гомологичной базовому YВКN-генотипу. Исследование изолятов, идентифицированных по биологическим свойствам на штаммы YВКO и YВКN-Wi показало, что данная группа по нуклеотидной структуре Р1-гена относится к «YВКN-Wi-подобной» форме генома и дифференцируется на две подгруппы - YВКN-Wi-A и YВКN-Wi-В.

Рис. 9. - Фрагмент нуклеотидной последовательности Р1 гена исследованных изолятов YВК Изоляты сравнения: SCRI-O (AJ585196), PN_10A (DQ008213), SCRI-N (AJ585197) и Hung-NTN (M95491). Подчеркиванием отмечены области рекомбинационных переходов. Точками обозначены совпадающие нуклеотидные позиции. Тире отражают пропущенные фрагменты нуклеотидной последовательности

Изоляты подгруппы YВКN-Wi-A (Stv1-11, Kzn69-12, Smr1-04, Kzn32-11), обладали полной гомологией с базовым YВКN-генотипом в Р1-области. Изоляты подгруппы YВКN-Wi-В (Kms1-11, Kzn2-05, Kzn6-06, Kzn68-12) имели частичную гомологию с YВКО-генотипом и содержали одну минорную точку рекомбинации. В образцах Kms1-11 и Kzn2-05 точка рекомбинации находилась в области 495-505 нуклеотидов генома YВК. В базе данных GenBank найдено более 50 изолятов YВК из разных стран мира со 100% уровнем гомологии по данному региону. В геноме образца Kzn68-12 рекомбинационная точка находилась в области 700-710 нуклеотидов. В базе данных было обнаружено 6 образцов, имеющих подобный рекомбинационный переход: два изолята, выделенных на территории Польши, а также четыре изолята, выявленных на территории Сирии. Изолят Kzn6-06 содержал уникальную точку рекомбинации в области 550-560 нуклеотидов генома YВК, которая была выявлена впервые.

Нуклеотидная последовательность CP-гена YВК и аминокислотная структура белка оболочки являются молекулярными мишенями, которые детектируются при использовании методов ОТ-ПЦР и ИФА. Для определения нуклеотидной последовательности CP-гена YВК были использованы ДНК-продукты, полученные с использованием разработанных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих концевые участки локусов NIb и 3/-UTR. На основании данных секвенирования ДНК, был проведен расчет величин эволюционных дистанций между типичными представителями штаммов YВК и изучаемыми изолятами (табл. 8).

Таблица 8 - Показатели эволюционных дистанций между нуклеотидными последовательностями СР-гена исследуемых и типичных изолятов YВК

№ п/п	Изолят	Штамм	SCRI-O	SCRI-N	PRI-509
			J-C	N-G	J-C	N-G	J-C	N-G
1.	SCRI-O	YВКO	-	-	0,110	0,459	0,071	0,307
2.	Smr1-04	YВКO	0,011	0,028	0,115	0,465	0,078	0,329
3.	Smr2-04	YВКO	0,008	0,017	0,113	0,466	0,073	0,313
4.	Kzn69-12	YВКO	0,008	0,017	0,104	0,430	0,076	0,333
5.	Kms1-11	YВКO	0,011	0,028	0,109	0,450	0,078	0,333
6.	Kzn2-05	YВКN-Wi	0,015	0,045	0,113	0,479	0,079	0,340
7.	Kzn6-06	YВКN-Wi	0,005	0,011	0,104	0,439	0,073	0,324
8.	Kzn32-11	YВКN-Wi	0,008	0,011	0,113	0,456	0,073	0,305
9.	Syv1-11	YВКN-Wi	0,009	0,028	0,112	0,468	0,075	0,331
10.	SCRI-N	YВКN	0,110	0,459	-	-	0,113	0,494
11.	Kzn62-12	YВКN	0,094	0,347	0,029	0,106	0,107	0,444
12.	Kzn77-12	YВКN	0,096	0,348	0,025	0,094	0,109	0,445
13.	Kms2-11	YВКN	0,092	0,356	0,025	0,094	0,102	0,415
14.	Ekt1-11	YВКN	0,096	0,365	0,025	0,106	0,109	0,464
15.	Kzn1-06	YВКNTN	0,092	0,364	0,029	0,106	0,107	0,463
16.	Kzn3-06	YВКNTN	0,096	0,365	0,025	0,106	0,103	0,425
17.	Kzn4-06	YВКNTN	0,092	0,347	0,027	0,094	0,107	0,445
18.	Kzn5-06	YВКNTN	0,089	0,338	0,024	0,088	0,104	0,434
19.	Kzn1-07	YВКNTN	0,092	0,347	0,025	0,100	0,103	0,434
20.	Chl1-09	YВКNTN	0,096	0,364	0,025	0,094	0,106	0,443
21.	Kms3-11	YВКNTN	0,094	0,340	0,025	0,094	0,107	0,436
22.	Ekt2-11	YВКNTN	0,094	0,356	0,027	0,113	0,107	0,454
23.	PRI-509	YВКC	0,071	0,307	0,113	0,494	-	-

Примечание: J-C - модель Джукса-Кантора, N-G - модель Неи-Годжобори. Подчеркиванием отмечены изоляты сравнения: SCRI-O (AJ585196), SCRI-N (AJ585197) и PRI-509 (EU563512)

Проведенный расчет показал высокий уровень гомологии CP-гена исследованных изолятов YВКO и YВКN-Wi с типичным изолятом SCRI-O (AJ585196), а также эволюционную близость вариантов YВКN и YВКNTN с типичным изолятом SCRI-N (AJ585197). Все исследованные образцы характеризовались высоким уровнем различий с изолятом PRI-509, который является типичным представителем штамма YВКС (EU563512). Таким образом, молекулярно-генетический анализ подтвердил правильность идентификации штаммового состава, проведенной на основании морфологических и серологических методов исследования.

На основании нуклеотидных последовательностей СР-гена были восстановлены аминокислотные последовательности белка оболочки изучаемых изолятов. Анализ основных антигенных детерминант, определяющих проявление серологических свойств [Nikolaeva et al., 2012] по аминокислотным позициям 1, 11, 17, 24 и 29, а также функционально-активных сайтов [Atreya et al., 1995; Seo et al., 2010; Moury, Simon, 2011] в позициях 6-8, 25, 68, 136-151 показал, что все исследованные российские образцы YВК обладали высоким уровнем гомологии с изолятами, широко-распространенными в странах Европы и Северной Америки.

ВЫВОДЫ

1. Применение усовершенствованного алгоритма преаналитической подготовки, включающего: а) внесение в состав разрушенного растительного материала 0,01 М тиосалициловой кислоты и 0,1 М Tris-HCl буфера, б) однократного цикла замораживания-оттаивания, в) удаления разрушенных растительных компонентов с помощью центрифугирования, позволило повысить уровень выявления YВК в листовых пробах на 6,6%; в клубневых этиолированных ростках на 9,8%; в биоматериале меристемных растений in vitro на 13,8%.

2. В условиях открытого грунта северной части Среднего Поволжья наибольшей частотой распространения характеризовался YВК, обнаруженный в 16,8% исследованных образцов. Другие патогены диагностировались реже: МВК - 1,9%, ХВК - 1,4% и ВСЛК - 0,05% изученных образцов.

3. Меристемные растения сортов и гибридов картофеля характеризовались различным количественным и видовым составом вирусных патогенов. Поражение меристемных линии сортов картофеля составило: YВК - 37,9%, МВК - 26,2%, ХВК - 9,7% и ВСЛК - 2,9%. Линии перспективных гибридов содержали МВК в 55,6% , а YВК в 15,3% исследованных случаев.

4. Результаты ИФА, отражающие уровень содержания YВК в биоматериале, характеризуются проявлениями асимметрии и эксцесса. Выявлен переход от одновершинной к двухвершинной форме вариационного ряда изучаемого признака, происходящий при распространении YВК в ряду вегетативных репродукций картофеля.

5. На территории Среднего Поволжья патоген представлен изолятами, проявляющими свойства штаммов YВКО и YВКN, а также штаммов YВКNTN и YВКN-Wi, индуцирующих развитие кольцевого некроза клубней картофеля. В геноме изолятов обнаружены сайты рекомбинационных переходов в генах P1, HC-Pro и VPg. Нуклеотидная последовательность CР-гена и аминокислотная последовательность белка оболочки соответствуют типичным штаммам патогена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью достоверного диагностического выявления YВК для своевременного удаления инфицированных партий семенного материала рекомендуется применять усовершенствованный алгоритм пробоподготовки, включающий внесение в состав разрушенных растительных тканей 0,1 М Tris-HCl буфера и 0,01 М тиосалициловой кислоты, осуществление цикла замораживания-оттаивания и центрифугирование биоматериала.

2. Для выявления растений картофеля устойчивых к YВК при осуществлении селекционной работы на территории Среднего Поволжья, в качестве инфекционного материала целесообразно использовать различные штаммы патогена, в том числе способные индуцировать некротические повреждения клубней.

3. При проведении фитосанитарного мониторинга выбор диагностических тест-систем для выявления YВК методом ОТ-ПЦР должен осуществляться с учетом возможного детектирования рекомбинантных форм вируса.

Список работ по теме диссертации

Публикации в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Вологин, С.Г. Диагностика внутриклеточных патогенов в меристемных линиях картофеля / С.Г. Вологин, Р.Р. Назмиева, З. Сташевски, Ф.Ф. Замалиева // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2012. - №4. - С. 59-61.

2. Вологин, С.Г. Обнаружение кольцевого некроза клубней картофеля на территории Республики Татарстан / С.Г. Вологин, Н.Д. Былинкина, З. Сташевски, Ф.Ф. Замалиева // Вестник защиты растений. - 2013. - №1. - С. 60-64.

Публикации в материалах всероссийских и международных конференций

3. Вологин, С.Г. Анализ результатов диагностики вирусов в растениях картофеля, регенерированных их апикальной меристемы/ С.Г. Вологин, И.В. Пикалова // Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения: материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Казань: Фолиантъ, 2009.- С. 190 - 193.

4. Вологин, С.Г. Технологические аспекты подготовки проб для проведения диагностики патогенов картофеля / С.Г. Вологин // Инновационные разработки молодых ученых - АПК России: материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Казань: Фолиантъ, 2010. - С. 221-226.

5. Вологин, С.Г. Биометрическое изучение результатов диагностики вирусов картофеля, осуществляемой методом иммуноферментного анализа / С.Г. Вологин // Состояние и перспективы научных исследований по картофелеводству, овощеводству и бахчеводству: материалы Международной научно-практической конференции. - Алматы-Кайнар, 2011. С. 192-197.

6. Вологин, С.Г. Исследование кольцевого некроза клубней картофеля выявленного в Среднем Поволжье / С.Г. Вологин, Н.Д. Былинкина // Научное обеспечение агропромышленного комплекса России: материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Казань: Центр инновационных технологий, 2012. - С. 165-170.

7. Вологин, С.Г. Идентификация возбудителя кольцевого некроза клубней картофеля выявленного на территории Среднего Поволжья / С.Г. Вологин, Н.Д. Былинкина // Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России: материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Екатеринбург: Уральское издательство, 2012. - С. 299-303.

8. Вологин, С.Г. Штаммовое разнообразие Y-вируса картофеля в Среднем Поволжье/ С.Г. Вологин, Н.Д. Былинкина // Стратегия взаимодействия микро...