Опыт получения гипериммунной сыворотки для лечения вирусных инфекций крупного рогатого скота. Технологические аспекты

Размещено на http://www.allbest.ru/

Опыт получения гипериммунной сыворотки для лечения вирусных инфекций крупного рогатого скота. Технологические аспекты

Масленников И.В., Закирова С.В., Паньков Е.В.

Аннотация

В статье представлены данные исследования влияния разных методов получения сыворотки крови и ее обеззараживания на факторы ее специфической и неспецифической активности. Выявлено, что отделение сыворотки методом центрифугирования цитрированной крови с последующей дефибринацией плазмы вызывает понижение глобулиновой и лизоцимной активности сыворотки, в сравнении с сывороткой, отделенной методом естественного отстоя. Выявлено влияние консервантов на факторы специфической и неспецифической активности сыворотки. Исследование показало, что воздействие тимерозала и фенола на факторы активности сыворотки крови различно. Наибольшее снижение глобулиновой и лизоцимной активности сыворотки отмечено в образцах, консервированных фенолом.

Ключевые слова: ГИПЕРИММУННАЯ СЫВОРОТКА, ПРЕПАРАТЫ КРОВИ, СПЕЦИФИЧЕСКАЯ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ, ИММУНОГЛОБУЛИНЫ, ЛИЗОЦИМ

Препараты, полученные из крови человека и животных, используются для лечения инфекционных болезней, поражений токсинами, различных форм гемофилии, иммунологических и метаболических расстройств, врожденной или приобретенной гипопротеинемии и т.д. [1].

Их значимость в обеспечении здоровья животных в промышленном скотоводстве вызвала практический и исследовательский интерес к экспериментальному изучению данного направления.

Биопрепараты плазмы крови животных имеют широкое применение в ветеринарной и медицинской врачебной практике, они используются как с профилактической целью, так и для лечения различных заболеваний, особенно вирусной природы. Вакцинопрофилактика массовых вирусных заболеваний взрослого поголовья часто не решает, особенно в первые дни жизни, проблему защиты телят, зависящую, в основном, от наличия колостральных антител. Дефицит антиинфекционной защиты у телят, обусловленный возрастной недостаточной иммунокомпетентностью, можно восполнить искусственным введением специфических антител с гипериммунной сывороткой [2].

Изготовление и использование гипериммунной поливалентной сыворотки позволит успешно проводить профилактику вирусных болезней молодняка КРС. Однако производство препаратов крови должно гарантировать сохранение структуры и функции белков крови, обеспечивать специфическую и вирусную безопасность препаратов и исключать контаминацию чужеродными агентами.

Цель данной работы - изучить взаимосвязь разных методов отделения сыворотки крови и факторов её специфической и неспецифической активности.

Материалы и методы

Лабораторные исследования сыворотки проводили на базе Удмуртского ветеринарного диагностического центра (УВДЦ) и в лаборатории ветеринарной медицины института согласно ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ Р 53434-2009, ГОСТ Р 52249-2009, ГОСТ Р 52684-2006, ГОСТ 12.1.008-76ССБТ [3-6], с использованием диагностических наборов различного производства.

Факторы специфической и неспецифической активности сыворотки крови изучали при разных методах ее отделения, в опыте сравнения метода естественной ретракции кровяного сгустка (контроль) и путем центрифугирования цитрированной крови с последующей дефибринацией плазмы (опыт).

В опыте 1 сыворотку получали методом естественной ретракции кровяного сгустка. Для отделения сыворотки ее держали в теплом помещении при температуре 25єС в течение 10-12 часов, затем ведра выдерживали в холодильной камере при температуре 3-5 єС от 24 до 48 ч.

В опыте 2 получали сыворотку путем центрифугирования цитрированной крови с последующей дефибринацией плазмы.

Для предохранения крови от свертывания в опытных образцах применяли антикоагулянт - 10%-ный раствор лимоннокислого натрия, который готовили на 5%-ном растворе хлористого натрия и стерилизовали автоклавированием.

Для отделения форменных элементов крови полученную цитрированную кровь подвергали центрифугированию при 3000 об./мин в течение 10 минут (центрифуга лабораторная медицинская РС-6).

Полученную плазму дефибринировали с целью перевода жидкого белка фибриногена в нерастворимое состояние - фибрин.

В контрольных образцах сыворотку отделяли после естественного оседания эритроцитов.

Влияние воздействия консервантов на факторы специфической и неспецифической активности сыворотки крови изучали в опыте, сравнивая факторы неспецифической (количество Ig А, М, G, лизоцим) при консервации сыворотки фенолом и тимерозалом (мертиолятом натрия). В контрольный образец консервантов не добавляли.

Сыворотку крови опытных образцов делили на две части и консервировали:

- в первом случае - 10%-ным раствором тимерозала (мертиолята натрия) из расчета 1мл/литр сыворотки, при этом содержание тимерозала (мертиолята натрия) определяется соотношением 1:10000;

- во втором случае - 5%-ным раствором химически чистого фенола до конечной концентрации 0,5%; затем при помощи вакуумного насоса перекачивали в стерильные отстойники, где сыворотку выдерживали 2 месяца при 4-10 єС; по истечении срока отстоя сыворотку подвергали стерилизации.

Изучение влияния стерилизации сыворотки крови проведено при помощи фильтрации через бактериальные фильтры на факторы ее специфической (титры антител) и неспецифической (количество Ig А, М, G, лизоцим) активности.

Опытные образцы сыворотки стерилизовали фильтрацией. Использовали однопатронный фильтродержатель ДФП-201L-250-А7-2 и фильтр на основе гидрофильной пористой мембраны из полиэфирсульфона ЭКОПОР-PES ЭФП-555-L/0,2-250-А7. Диаметр пор - 0,2 мкм. Фильтрующие элементы ЭКОПОР-PES предназначены для удаления из плазмы частиц размером более 0,2 мкм при температурах от -5 до 90 °С.

После завершения фильтрации сыворотку контролировали на стерильность в соответствии с требованиями ГОСТ 2808.

Изучение показателей неспецифической активности сыворотки крови проведено путём комплексных исследований, которые включают определение лизоцимной активности [7] и количественное определение иммуноглобулинов [8].

Специфическую активность сыворотки определяли по титру антител в реакциях гемагглютинации (РГА), торможения гемагглютинации (РТГА), непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием диагностических наборов различного производства. Исследования при помощи готовых диагностических наборов производили согласно прилагаемым инструкциям.

Результаты исследований

На основании полученных данных (табл. 1) можно отметить что, в опыте 2 в сравнении с опытом 1 и контролем концентрация глобулинов оказалась ниже на 2%, а лизоцимная активность - на 34,6%.

Таблица 1. Показатели активности сыворотки крови при разных методах ее отделения

На основании полученных данных можно отметить незначительное снижение титров противовирусных антител в опыте 2, в сравнении с опытом 1 и контролем. Концентрация глобулинов оказалась ниже на 2%, а лизоцимная активность - на 34,6%.

Отделение сыворотки методом центрифугирования цитрированной крови с последующей дефибринацией плазмы вызывает незначительное снижение показателей специфической и неспецифической активности сыворотки, в отличие от сыворотки, отделенной методом естественного отстоя свернувшейся крови.

Воздействие тимерозала и фенола на факторы активности сыворотки крови, отделенной разными способами, представлено в таблице 2.

Таблица 2. Показатели активности сыворотки крови при разных методах консерви-рования

В процессе исследований отмечено образование белого осадка в пробах, консервированных фенолом. Из данных, приведенных в таблице, видно, что наибольшее снижение глобулиновой (IgA - на 26,5%; IgM - на 29%; IgG - на 24%) и лизоцимной (на 32,5%) активности сыворотки отмечено в образцах, консервированных фенолом. Это приводит к предположению, что фенол частично осаждает белки крови.

Стерилизация сыворотки является обязательным этапом в промышленном изготовлении. Результаты исследования факторов крови после стерилизации представлены в таблице 3.

В результате фильтрации частицы размером более 0,2 мкм остаются на фильтре, в том числе и часть иммуноглобулинов IgA, IgM, т.к. они имеют более крупные размеры и большую активность. Глобулины IgG и специфические противовирусные антитела свободно проходят диаметр пор фильтра и сохраняют необходимую активность сыворотки. Снижение содержания глобулинов составило в среднем: IgA - на 27,5% , IgM - на 50%, IgG - на 7%. Лизоцимная активность сыворотки после фильтрации падает до 23,4-29,5 %.

сыворотка кровь обеззараживание консервант

Таблица 3. Влияние стерилизации на показатели активности сыворотки крови

Контрольные образцы сыворотки сохранили исходные показатели активности крови, за исключением снижения лизоцимной активности на 29,5-23,4 %.

Специфическая противовирусная активность сохранилась на уровне 93,4%.

Выводы

В результате изучения двух методов отделения сыворотки крови выявлено, что отделение сыворотки методом центрифугирования цитрированной крови с последующей дефибринацией плазмы вызывает понижение глобулиновой активности сыворотки на 2%, а лизоцимной - на 34,6%, в отличие от сыворотки, отделенной методом естественного отстоя свернувшейся крови.

Изучение влияния консервантов на факторы неспецифической активности сыворотки крови показало, что воздействие тимерозала и фенола на факторы активности сыворотки крови различно. Наибольшее снижение глобулиновой (IgA - на 26,5%; IgM - на 29%; IgG - на 24%) и лизоцимной (на 32,5%) активности сыворотки отмечено в образцах, консервированных фенолом.

Стерилизация сыворотки крови методом обеспложивающей фильтрации снижает активность, в основном, за счет фильтрации глобулинов IgA и IgМ в сравнении с контролем (отсутствие стерилизации). Содержание глобулинов понизилось в среднем: IgA - на 27,5% , IgM - на 50%, IgG - на 7%, лизоцимная активность - до 23,4-29,5 %. Специфическая противовирусная активность сохранилась на уровне 93,4%.

Таким образом, по результатам исследования разработана эффективная технология получения гипериммунной сыворотки, основанная на оптимальной комбинации специфических белковых антигенных комплексов, обеспечивающих высокий специфический иммунный ответ у 100% животных. Полученная гипериммунная сыворотка является высокоэффективным средством для лечения и профилактики массовых вирусных инфекций взрослого поголовья и молодняка крупного рогатого скота.

Список использованных источников

1. Супотницкий М.В., Елапов А.А., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю., Климов В.И., Лебединская Е.В., Корсун Л.В., Горбунова Е.В., Слободян В.Г., Меркулов В.А., Олефир Ю.В. Препараты, полученные из крови человека и животных, в аспекте показателей качества, эффективности и безопасности. Биопрепараты. - 2015; (3). - С. 33-48.

2. Закирова С.В., Паньков Е.В., Масленников И.В. Способ лечения и профилактики вирусных инфекций телят на основе применения поливалентной гипериммунной сыворотки «СПВИ-КРС» // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. - 2014, № 3. - С. 12-15.

3. ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.008-76ССБТ - Биологическая безопасность. Общие требования.

4. ГОСТ Р 53434-2009 - Принципы надлежащей лабораторной практики.

5. ГОСТ Р 52249-2009 - Правила производства и контроля качества лекарственных средств.

6. ГОСТ Р 52684-2006 - Средства лекарственные для животных. Правила приемки, методы отбора проб.

7. Дорофейчук В.Г. Определение активности лизоцима нефелометрическим методом // Лабораторное дело. - 1968, №1. - С. 28-30.

8. Грызлова О.Н., Емельяненко П.А., Денисенко В.Н. Модифицированный метод О.Barta и V.Barta для определения гемолитической активности комплемента сыворотки крови крупного рогатого скота // Сельскохозяйственная биология. - 1978, т. 13, №3. - С. 433-435.

Масленников И.В., Закирова С.В., Паньков Е.В. Опыт получения гипериммунной сыворотки для лечения вирусных инфекций крупного рогатого скота. Технологические аспекты // АгроЭкоИнфо. - 2017, №4. - http://agroecoinfo.narod.ru/journal/STATYI/2017/4/st_405.doc.

Размещено на Allbest.ru