Размещено на http://www.allbest.ru/

ФИТОПРЕПАРАТЫ В КОРРЕКЦИИ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ БИОМЕМБРАН, ИНДУЦИРОВАННЫХ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных,

патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

СИМОНОВА Наталья Владимировна

Благовещенск 2012

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Доровских Владимир Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Сиразиев Ромазан Закарьянович

доктор биологических наук, профессор Рядинская Нина Ильинична

доктор ветеринарных наук, профессор Ярцев Владимир Геннадьевич

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Р. Филиппова»

Защита диссертации состоится «28» мая 2012 года в 13⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» по адресу: 675005, г. Благовещенск, ул. Политехническая, 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет»

Автореферат разослан «____» ________________ 2012 года, размещен на сайте университета: http://www.dalgau.ru, направлен в ВАК РФ по адресу: referat_vak@mov.gov.ru.

Ученый секретарь

диссертационного совета О.Л. Самусенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Приспособление человека и животных к неадекватным условиям окружающей среды - одна из важнейших проблем современной медико-биологической науки. Ее решение возможно только на основе глубокого понимания естественных механизмов резистентности к неблагоприятным экологическим факторам, среди которых - адаптивные преобразования физико-химических характеристик мембран, в том числе необходимое в условиях воздействия ультрафиолетовой радиации повышение устойчивости липидов мембран к повреждающему действию кислородных радикалов (Punnonen K., 1991; Cheeseman K. H., 1993; Ноздрачёв А. Д., 1997; Владимиров Ю.А., 2000; Валеева И.Х., 2004; Доровских В.А., 2011).

В настоящее время исследование эффектов воздействия ультрафиолетового излучения для здоровья человека и животных является актуальным и своевременным ввиду последствий возросших уровней УФ облученности на поверхности земли из-за истощения озона в стратосфере, существенное уменьшение которого в последние 10 лет произошло в глобальном масштабе (ВОЗ/ЮНЕП/IRPA, 2009; WMO, 2003; WHO, 2004). С точки зрения науки несомненно, что при постоянстве всех других факторов, уменьшение общего содержания озона, происходящее при участии выбрасываемых в атмосферу антропогенных фторуглеродистых соединений, при загрязнении атмосферы формальдегидом, диоксидами серы, азота и другими соединениями, приведет к увеличению УФ-В излучения на уровне земной поверхности (Потапенко А.Я., 1996; Литвинов Н. Н., 2003; Munkata N., 2003; Smith G.J., Ryan K.G., 2004). УФЛ подвергают модификации клеточные мембраны, изменяя проницаемость мембран и мембранных транспортных систем: ненасыщенные жирные кислоты легко окисляются в перекисные соединения (Putvinsky et al., 1979; Azizova et al., 1980; Кулинский В.И., 1999; Могильский М.П., 2001; Доровских В.А. и соавт., 2006), повреждения белков, связанные с повреждениями цитоскелета и приводящие к тяжелым нарушениям функций плазменных мембран, являются причиной аберраций клеток и межклеточных коммуникаций, следствием которых является возможность свободного доступа токсинов внутриклеточного пространства (Сторожок Н. М., 1996; Кармолиев Р.Х., 2005; Nowak D., 2006). Кроме того, разрыв внутренних липидных мембран в эукариотных клетках приводит к многим патологическим последствиям, включая повреждение митохондрий, вытекание протеаз из разорванных лизосом и разрывы барьера проницаемости ядерных мембран (Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1993; Владимиров Ю.А., 2000; Кудряшов Ю.Б., 2001), а повреждение жизненно важных ионных насосов под действием УФ радиации влияет на многие процессы, основанные на ионном гомеостазе. Детали исследований в этой важной области эффектов УФО фрагментарны, однако ясно, что последствия повреждений компонентов мембран, вызванных УФО, довольно значительны, что на современном этапе вызывает необходимость более глубокого изучения влияния УФЛ на процессы перекисного окисления липидов биомембран.

Проблема свободнорадикальной патологии, важнейшей характеристикой которой является накопление токсических продуктов пероксидации, представляющее собой значимый патогенетический фактор в развитии многих заболеваний и патологических состояний (Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., 2000; Филиппова Е.В., Ларионов Л.П., 2004), в условиях повышенного УФО на фоне загрязнения воздуха, воды и продуктов, недостатка естественных антиоксидантов (витамины Е, С, А, селен и др.), имеет исключительно важное научное и практическое значение, поскольку напряжение системы антиоксидантной защиты организма способствует формированию "оксидативного стресса", проявляющегося на молекулярном, клеточном и организменном уровне (Sies H., Stahl W., Sundquist A.R., 1992). В связи с этим, поиск способов коррекции радиационно-индуцированного окисления в условиях УФО является своевременным и актуальным, так как повышение адаптационных возможностей человека и животных к повреждающему воздействию ультрафиолетовой радиации при помощи модификаторов биологического действия, в число которых входят средства природного происхождения, становится важным моментом профилактики возникновения патологических состояний. Препараты растительного происхождения, обладающие низкой токсичностью, высокой биодоступностью, широким спектром регулирующих эффектов и поливалентностью лечебного действия, находят все большее применение в медицинской и ветеринарной практике (Турищев С.Н., 2000; Рабинович А.М., 2001; Зиновьев А.И., 2003). Биологическая активность лекарственных растений определяется наличием в их составе веществ различных химических классов, подклассов и групп, которые обладают не одним, а несколькими видами действия (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Яременко К.В., 2001). Их количественный и качественный состав определяет доминирование и степень выраженности того или иного фармакологического эффекта конкретного растения и его выбор при назначении с лечебными и профилактическими целями (Спивак Е.М., Лукина В.В., 1993; Пастушенков Л.В., Лесиовская Е.Е., 1995; Разина Т.Г., 2006). Применение фитопрепаратов, обладающих антиоксидантным действием, в качестве стресс-корректоров в условиях неблагоприятного воздействия УФЛ, запускающих каскад механизмов свободнорадикального окисления липидов биомембран в теплокровном организме, на основе растений, произрастающих на Дальнем Востоке, является, на наш взгляд, целесообразным в связи с доступностью сырья, с учетом естественного происхождения и его экологической чистоты.

Выполненная работа является самостоятельным подразделом темы ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия «Механизмы изменения реактивности и резистентности организма, их влияние на развитие и течение патологических процессов в условиях экстремальных воздействий факторов внешней среды: пути повышения резистентности и стимуляции адаптивных процессов, их коррекция» (номер Гос. Регистрации 01.9.6000.3989).

Цель и задачи исследования. Целью исследований явилось изучение эффективности применения фитопрепаратов для коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран в теплокровном организме в условиях ультрафиолетового облучения.

Поставленная цель предопределила необходимость решения следующих задач:

изучить воздействие ультрафиолетового облучения в системе аскорбатзависимого ПОЛ в условиях in vitro;

оценить влияние УФО на устойчивость животных к физической нагрузке и интенсивность процессов пероксидации в условиях in vivo;

определить свободнорадикальный/окислительный компонент эффектов УФ-В излучения, включая определение реактивных промежуточных соединений;

исследовать уровень эндогенной антиоксидантной защиты клеток в тканях при УФО в условиях in vivo;

изучить морфофункциональные параметры легких при воздействии ультрафиолетового облучения;

изучить влияние различных доз УФО на характер адаптационных процессов в теплокровном организме;

установить возможность коррекции прооксидантного действия ультрафиолетовой радиации пероральным введением фитопрепаратов лабораторным (крысы) и сельскохозяйственным (телята, поросята) животным;

разработать рекомендации по профилактическому использованию исследуемых фитопрепаратов для повышения адаптационных возможностей организма к воздействию ультрафиолетовых лучей.

Научная новизна работы. Разработан способ и новое устройство для экспериментального моделирования активации процессов ПОЛ биомембран, представленное ультрафиолетовой камерой, позволяющей проводить исследования по изучению антиоксидантной активности лекарственных средств. ультрафиолетовый облучение теплокровный нагрузка

Исследовано влияние различных доз УФО на интенсивность ПОЛ биологических мембран в условиях in vivo. Научно обоснована и экспериментально доказана перспективность способа повышения антиоксидантного статуса теплокровного организма пероральным введением фитопрепаратов. Получены данные о потенцирующем влиянии адаптогенов - экстрактов элеутерококка, родиолы розовой, корня солодки на характер адаптационных процессов, развивающихся в организме при воздействии УФО. Впервые изучено влияние фитопрепаратов - настоев листьев березы, крапивы, подорожника - на устойчивость животных к физической нагрузке и интенсивность свободнорадикального окисления (СРО) липидов биомембран в условиях УФО. Получены данные о стресс-протективном действии фитопрепаратов на фоне радиационно-индуцированного окисления биомембран в условиях in vivo. Проведен сравнительный анализ влияния фитопрепаратов (экстрактов элеутерококка, родиолы розовой, корня солодки, сока подорожника, настоев листьев крапивы, березы, подорожника) на устойчивость животных к физической нагрузке и состояние ПОЛ/АОС в условиях УФО.

Впервые изучено влияние различных доз УФО на состояние системы ПОЛ/АОС в организме молодняка сельскохозяйственных животных (телят, поросят). Проведены исследования по изучению влияния фитопрепаратов на интенсивность процессов пероксидации в организме сельскохозяйственных животных (телят, поросят) в условиях облучения УФЛ. Проанализирована экономическая эффективность применения фитопрепаратов в качестве стресс-корректоров прооксидантного воздействия ультрафиолетового облучения на организм сельскохозяйственных животных.

Новизна выполненных исследований подтверждена патентом на изобретение «Способ и устройство для экспериментального моделирования активации процессов перекисного окисления липидов биологических мембран» (№2348079); патентом на изобретение «Способ повышения антиоксидантного статуса теплокровного организма в условиях ультрафиолетового облучения» (№2424580).

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании проведенных исследований выявлены фитопрепараты, способные ингибировать процессы ПОЛ биомембран, индуцированные УФО, и повышать неспецифическую резистентность теплокровного организма. Представленные данные стали основой для рекомендаций врачам стационаров и поликлиник - «Рекомендации по применению фитопрепаратов для коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран, индуцированных ультрафиолетовым облучением», утвержденные на заседании Ученого совета ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия (протокол №8 от 15.12.2009 г.).

На базе ЦНИЛ АГМА и лаборатории природопользования научно-образовательного центра АмГУ разработаны и утверждены Ученым советом ФГБОУ ВПО Амурский государственный университет (протокол №3 от 16.09.2009 г.) «Рекомендации по применению фитопрепаратов для повышения неспецифической резистентности и продуктивности сельскохозяйственных животных» для ветврачей животноводческих комплексов, руководителей хозяйств, арендных подразделений.

Выявленные в результате исследований закономерности изменения содержания продуктов ПОЛ и основных компонентов АОС в условиях УФО расширяют научные представления по ряду вопросов патофизиологии и биохимии. С учетом выявленных закономерностей предложен способ экспериментального моделирования активации процессов перекисного окисления липидов биомембран, рассчитанный на научных сотрудников в области патофизиологии, фармакологии, биохимии и исследователей, изучающих механизмы свободнорадикального окисления липидов в условиях воздействия прооксидантных факторов на фоне фармакологической коррекции.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на Международной научно-практической конференции «Физическая культура и здоровье населения: проблемы, ценности, ориентиры» (Благовещенск, 2001); II, V, VI, VII Международных российско-китайских фармацевтических форумах «Современные проблемы фармакологии, фармакогнозии и фармации» (Россия, Благовещенск, 2005, 2009; Китай, Харбин, 2008, 2010); 1-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы физической культуры и спорта» (Уссурийск, 2006); V Международной научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Пенза, 2008); II Международной научной конференции «Современные проблемы регионального развития» (Биробиджан - Кульдур, 2008); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Научно-техническое и экономическое сотрудничество стран АТР в XXI веке» (Хабаровск, 2009); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2010); 20-ти Всероссийских и региональных научно-практических конференциях: 55-ой итоговой научной конференции АГМА (Благовещенск, 2000); региональных научно-практических конференциях «Молодежь ХХI века: шаг в будущее» (Благовещенск, 2001, 2002, 2003, 2004); конференции молодых ученых СО РАМН по проблемам фундаментальной и прикладной медицины (Новосибирск, 2002); региональной научно-практической конференции (Южно-Сахалинск, 2002); научно-практической конференции «Современные аспекты диагностики, лечения и профилактики заболеваний человека» (Благовещенск, 2002); научно-практической конференции, посвященной 80-летию СЭН Амурской области (Благовещенск, 2002); 59-й межвузовской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2004); 2-ой всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004); научно-практической конференции (Курск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы зооветеринарной науки в современных условиях» (Красноярск, 2005); Всероссийской научной конференции «Физическая культура и спорт в современном обществе» (Хабаровск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Профессиональное гигиеническое обучение, формирование здорового образа жизни детей, подростков и молодежи» (Москва, 2006); региональной научно-практической конференции «Демографическая ситуация и миграционная политика в Приамурье: социально-экономические, правовые и медико-биологические аспекты» (Благовещенск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Томск, 2006, 2007), XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), Всероссийском инновационном космическом конвенте (Углегорск, 2011), расширенном заседании кафедр фармакологии, физиологии, патофизиологии, биохимии, гистологии, ФПК ППС детских болезней и проблемной комиссии ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия (Благовещенск, 2011).

Результаты исследований использованы и внедрены в практическую деятельность специалистов хозяйств и арендных подразделений Амурской области, специалистов областного государственного учреждения (ОГУ) «Благовещенская районная станция по борьбе с болезнями животных», ОГУ «Благовещенская городская станция по борьбе с болезнями животных», ОГУ «Тамбовская районная станция по борьбе с болезнями животных», ИП Бондарев А.В. «Животноводческий комплекс п. Чигири Амурской области», ОГУ «с. Лозовое ОПХ ВНИИ СОИ», в учебном процессе и научных исследованиях ГБОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия», ФГБОУ ВПО «Амурский государственный университет», ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 68 научных работ, в том числе 17 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, 3 монографии, 5 учебных пособий, изданы рекомендации - «Рекомендации по применению фитопрепаратов для коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран, индуцированных ультрафиолетовым облучением», «Рекомендации по применению фитопрепаратов для повышения неспецифической резистентности и продуктивности сельскохозяйственных животных», получено 2 патента на изобретение и 2 приоритетных справки.

Основные положения, выносимые на защиту:

Результаты воздействия ультрафиолетового облучения в системе аскорбатзависимого ПОЛ в условиях in vitro.

Результаты влияния различных доз УФО на устойчивость животных к физической нагрузке и интенсивность процессов пероксидации в условиях in vivo.

Биохимические показатели крови и внутренних органов (печени, легких, миокарда) лабораторных животных (крыс) при использовании фитопрепаратов в условиях УФО.

Результаты влияния различных доз УФО на клиническое состояние, морфологические и биохимические показатели крови, интенсивность процессов пероксидации в организме сельскохозяйственных животных (телят, поросят).

Результаты экспериментальных исследований по профилактике окислительного стресса, вызванного действием УФО, у телят и поросят введением фитопрепаратов.

Данные экономической эффективности включения фитопрепаратов в рацион кормления телят и поросят.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 296 страницах компьютерного текста на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 446 источников, в том числе 170 на иностранном языке, и приложений. Работа содержит 46 таблиц, 58 рисунков.

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность Заслуженному деятелю науки РФ, доктору медицинских наук, профессору В.А. Доровских, доктору сельскохозяйственных наук, профессору Н.П. Симоновой, кандидату ветеринарных наук, доценту В.А. Симонову за всестороннюю помощь и поддержку в работе, а также коллективу кафедры фармакологии ГБОУ ВПО АГМА и, лично, кандидату медицинских наук, доценту В.И. Тиханову и кандидату медицинских наук, старшему научному сотруднику ЦНИЛ АГМА М.А. Штарбергу за методическую и практическую помощь в проведении исследований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследования

2.1.1. Общий объем проведенной работы. Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия», в лаборатории природопользования научно-образовательного центра ФГБОУ ВПО «Амурский государственный университет» и на базе животноводческих хозяйств Амурской области в течение 2001 - 2011 г.г. в рамках государственной НТП «Фундаментальная медицина» (номер Гос. Регистрации 01.2.010.54850).

В опытах использовали биологический материал от 560 крыс, 210 поросят и 106 телят. Всего исследовано 1440 проб сывороток крови крыс, 2060 проб внутренних органов крыс, 816 проб сывороток крови поросят и 560 проб сывороток крови телят. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). План исследования соответствовал положениям Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации последнего пересмотра (Эдинбург, 2000), одобрен Этическим комитетом ГБОУ ВПО Амурская ГМА Минздравсоцразвития РФ (протокол №5 от 21.12.2009 г.).

Производственные испытания фитопрепаратов проведены в двух хозяйствах Амурской области согласно договору № 1.3 - 09, заключенному с Министерством сельского хозяйства Амурской области (от 29.04.2009 г.). В производственных испытаниях использовано 240 поросят и 116 телят.

2.1.2. Материалы исследования. Материалом для гематологического, биохимического исследований служила кровь и внутренние органы крыс, а также кровь сельскохозяйственных животных (телят, поросят).

Характеристика ультрафиолетовой установки, используемой в эксперименте.

Облучение экспериментальных животных (крыс) проводили в ультрафиолетовой камере (Симонова Н.В., Доровских В.А., Патент РФ №2348079), изготовленной из стекла, со встроенной в нее ультрафиолетовой дуговой ртутно-трубчатой горелкой ДРТ-240-1 (газосветной трубкой) из плавленого кварца, хорошо пропускающей ультрафиолетовые лучи. Трубка заполнена аргоном и парами ртути. В ее концы впаяны электроды, к которым подведен электрический ток. Возбуждаемые под действием тока атомы паров ртути в среде ионизированного газа генерируют ультрафиолетовые лучи.

Для УФО телят использовали ртутно-кварцевую горелку ДРТ-400, которая подвешивалась под потолком на дросселе на расстоянии 1,5 м от спины животных.

Для УФО поросят использовали облучающую установку с ртутно-кварцевой горелкой ДРТ-400 с высотой подвеса ламп 2 м от пола.

Характеристика исследуемых лекарственных средств.

1. Экстракт элеутерококка жидкий (Extractum Eleutherococci fluidum).

Спиртовой (на 40% этиловом спирте) экстракт (1:1) из корневищ с корнями элеутерококка колючего (свободноягодника колючего) - Eleutherococcus senticosus Maxim, семейства аралиевых (Araliaceae). Жидкость темно-коричневого цвета, слегка жгуче-горьковатого вкуса, своеобразного запаха.

2. Экстракт родиолы жидкий (Extractum Rhodiolae fluidum).

Спиртовой (на 40% этиловом спирте) экстракт (1:1) из корневищ с корнями родиолы розовой. Жидкость темно-бурого цвета с характерным ароматным запахом.

3. Экстракт корня солодки жидкий (Extractum radicis Glycyrrhizae fluidum).

Спиртовый (на 40% этиловом спирте) экстракт (1: 1) из корней и подземных побегов многолетних дикорастущих травянистых растений солодки голой и уральской, семейства бобовых (Leguminosae). Жидкость темно-коричневого цвета с характерным ароматным запахом.

4. Сок подорожника (Succus Plantaginis).

Смесь сока из свежих листьев подорожника большого и сока из наземных частей подорожника блошного, консервированная спиртом и метабисульфитом натрия (0,15%). Темная, слегка мутноватая жидкость красно-бурого цвета, кисловатого вкуса, своеобразного ароматического запаха.

5. Настой листьев крапивы (Infusa folii Urticae).

Приготовление настоя: листья крапивы, заготовленные во время цветения, измельчали, заливали кипящей водой из расчета 7,5 г на 200 мл воды, настаивали 60 минут, процеживали и охлаждали.

6. Настой листьев березы (Infusa folii Вetulae).

Приготовление настоя: листья березы, заготовленные в мае, измельчали, промывали холодной кипяченой водой, заливали кипяченой водой (температура воды 40 - 50⁰С) из расчета 8 г на 500 мл воды, настаивали 3 - 4 часа, воду сливали, листья отжимали, отстаивали в течение 6 часов, осадок удаляли (готовый настой имеет интенсивно зелёно-жёлтый цвет).

7. Настой листьев подорожника (Infusa folii Plantaginis).

Приготовление настоя: листья подорожника, заготовленные в июне-июле, измельчали, заливали кипящей водой из расчета 1 столовая ложка на 200 мл воды, настаивали 60 минут, процеживали, осадок удаляли.

Дозы и условия введения: фитопрепараты вводили ежедневно перорально за 30 минут до кормления в течение 28 дней. Дозы лекарственных средств представлены в таблице.

2.1.3. Методы исследования. Выполнены следующие исследования:

Изучение антиоксидантной активности в условиях in vitro проводили методом индукции аскорбатзависимого ПОЛ в суспензии желточных липопротеидов (Борисова И.Г. и соавт., 1992). Оценивали накопление малонового диальдегида в контрольных и опытных пробах.

Исследование устойчивости крыс к физической нагрузке проводили, оценивая длительность плавания подопытных животных в воде на 7, 14, 21, 28 дни исследований. Для этого крыс помещали в стеклянный аквариум, предусматривался световой режим и доступ воздуха для предупреждения гипоксии. Животные во время плавания находились в свободном состоянии.

Клинические исследования включали оценку клинического состояния сельскохозяйственных животных по изменению частоты дыхания, частоты сердечных сокращений, температуры тела.

Гематологические исследования. В пробах крови поросят и телят подсчитывали общее количество эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов по общепринятым методикам.

Биохимические исследования включали определение:

· диеновой конъюгации липидов в липидных экстрактах крови и гомогенатов исследуемых тканей (печени, легких, миокарда) по методике И.Д. Стальной (1977);

· гидроперекисей липидов по методике Л.А. Романовой, И.Д. Стальной (1977);

· малонового диальдегида по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977);

· церулоплазмина по методике В.Г. Колба, В.С. Камышникова (1976);

· витамина Е по методике Р.Ж. Киселевич, С.И. Скварко (1972).

Морфологические исследования ткани легкого проводили при окрашивании препаратов гематоксилином Бемера-эозином, азур-2-эозином и резорцин-фуксином по Вейгерту. Микроскопирование и фотографирование проводили на фотомикроскопе Microphot-FXA (фирма Nicon). Просмотр готовых препаратов осуществляли на сканирующих электронных микроскопах «HHS-2» и «S-500» фирмы «Хитачи».

Исследование влияния фитопрепаратов на физическую выносливость крыс и интенсивность процессов пероксидации в условиях воздействия УФЛ проводили в двух сериях экспериментов. В первой серии экспериментальной работы ежедневно на протяжении 28 дней животным вводили экстракты элеутерококка, родиолы розовой, солодки и сок подорожника за 20 минут до облучения крыс в ультрафиолетовой камере (время экспозиции - 3 минуты). Животные при облучении находились в свободном состоянии. В работе камеры предусматривался световой режим и подача воздуха для предупреждения кислородной гипоксии. Одновременно исследовали 6 групп животных по 10 беспородных крыс - самцов массой 150 - 220 г в каждой группе: 1 группа - интактные, находились в стандартных условиях вивария; 2 группа - контрольные, подвергались воздействию УФЛ в камере ежедневно в течение 3 минут на протяжении 28 дней; 3, 4, 5, 6 группы - подопытные, животные данных групп перорально получали соответственно экстракты элеутерококка, родиолы розовой, корня солодки из расчета 1 мл/кг и сок подорожника из расчета 2,5 мл/кг массы животного.

Изучение влияния настоев лекарственных растений на интенсивность процессов пероксидации, индуцированных УФО, в организме крыс проводили по следующей схеме: 1 группа - интактные, находились в стандартных условиях вивария; 2 группа - контрольные, подвергались воздействию УФЛ в камере ежедневно в течение 3 минут на протяжении 28 дней; 3, 4, 5 группы - подопытные, животные данных групп перорально получали соответственно настои листьев крапивы, березы и подорожника из расчета 5 мл/кг массы животного ежедневно на протяжении 28 дней за 20 минут до облучения (время экспозиции - 3 минуты). Забой животных декапитацией проводили на 29 сутки от начала эксперимента.

Объектом исследования второго этапа экспериментальной работы стали сельскохозяйственные животные - телята черно-пестрой породы с 7-дневного до 5-месячного возраста. Подопытные и контрольные группы формировали по принципу аналогов с учетом возраста, пола, живой массы по 10 животных в каждой группе. Влияние различных доз УФО на клиническое состояние, морфологический состав крови телят и интенсивность процессов пероксидации изучали, облучая животных через день по следующей схеме: 1 группа - контрольная, животные данной группы не облучались; 2, 3, 4 группы - подопытные, животные подвергались воздействию УФЛ соответственно в дозах 53 мэрч/м² (время экспозиции 10 минут), 80 мэрч/м² (время экспозиции 15 минут), 133 мэрч/м² (время экспозиции 25 минут). Забор крови проводили в конце первого, второго, третьего, четвертого, пятого месяцев эксперимента.

Влияние адаптогенов на морфологический состав крови и показатели ПОЛ/АОС облучаемых УФЛ телят изучали на 60 телятах. Подопытные и контрольные группы формировали на телятах-аналогах в возрасте 7 дней (средней живой массой 35 кг при рождении). Животные были разделены на 6 групп: 1 группа - интактная, животные данной группы содержались в стандартных условиях, не подвергались воздействию УФЛ; 2 группа - контрольная, животные данной группы подвергались УФО в дозе 133 мэрч/м² (время экспозиции 25 минут) через день в течение 28 дней; 3, 4, 5, 6 группы - подопытные, животным данных групп перорально вводили соответственно экстракты элеутерококка, родиолы, солодки (суточная доза 5 мл) и сок подорожника (суточная доза 10 мл) ежедневно на фоне облучения УФЛ в дозе 133 мэрч/м² (время экспозиции 25 минут) через день в течение 28 дней.

Морфологический состав и состояние ПОЛ/АОС в крови телят на фоне введения настоев листьев березы, крапивы, подорожника в условиях УФО изучали на 50 телятах. Подопытные и контрольные группы формировали на телятах-аналогах в возрасте 7 дней (средней живой массой 35 кг при рождении). Животные были разделены на 5 групп: 1 группа - интактная, животные данной группы содержались в стандартных условиях, не подвергались воздействию УФЛ; 2 группа - контрольная, животные данной группы подвергались УФО в дозе 133 мэрч/м² (время экспозиции 25 минут) через день в течение 28 дней; 3, 4, 5 группы - подопытные, животным данных групп перорально вводили соответственно настои листьев березы, крапивы, подорожника (5 мл/кг) ежедневно на фоне облучения УФЛ в дозе 133 мэрч/м² (время экспозиции 25 минут) через день в течение 28 дней. Забор крови проводили на 14 и 28 дни эксперимента с последующим исследованием содержания эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, продуктов ПОЛ (гидроперекисей липидов, диеновых конъюгатов, малонового диальдегида) и основных компонентов АОС (церулоплазмина, витамина Е).

Объектом исследования третьего этапа экспериментальной работы стали поросята в возрасте от 4 до 6 месяцев. Подопытные и контрольные группы формировали по принципу аналогов с учетом возраста, пола, живой массы по 10 - 20 животных в каждой группе. Влияние различных доз УФО на клиническое состояние, морфологический состав крови поросят и интенсивность процессов пероксидации изучали, облучая животных через день по следующей схеме: 1 группа - контрольная, животные данной группы не облучались; 2, 3, 4 группы - подопытные, животные подвергались воздействию УФЛ соответственно в дозах 60 - 80 мэрч/м² (время экспозиции 10 минут), 120 - 160 мэрч/м² (время экспозиции 15 минут), 300 - 320 мэрч/м² (время экспозиции 20 минут). Забор крови проводили в конце первого, второго, третьего месяцев эксперимента.

Морфологический состав крови и состояние ПОЛ/АОС в крови поросят на фоне введения адаптогенов в условиях УФО изучали на 60 поросятах. Подопытные и контрольные группы формировали на поросятах-аналогах в возрасте 4 месяцев. Животные были разделены на 6 групп: 1 группа - интактная, животные данной группы содержались в стандартных условиях, не подвергались воздействию УФЛ; 2 группа - контрольная, животные данной группы подвергались УФО в дозе 300 - 320 мэрч/м² (время экспозиции 20 минут) через день в течение 28 дней; 3, 4, 5, 6 группы - подопытные, животным данных групп перорально вводили соответственно экстракты элеутерококка, родиолы, солодки (суточная доза 4 мл) и сок подорожника (суточная доза 8 мл) ежедневно на фоне облучения УФЛ в дозе 300 - 320 мэрч/м² (время экспозиции 20 минут) через день в течение 28 дней.

Морфологический состав крови и состояние ПОЛ/АОС в крови поросят на фоне введения настоев листьев березы, крапивы, подорожника в условиях УФО изучали на 60 поросятах. Подопытные и контрольные группы формировали на поросятах-аналогах в возрасте 4 месяцев по 12 животных в каждой группе. Животные были разделены на 5 групп: 1 группа - интактная, животные данной группы содержались в стандартных условиях, не подвергались воздействию УФЛ; 2 группа - контрольная, животные данной группы подвергались УФО в дозе 300 - 320 мэрч/м² (время экспозиции 20 минут) через день в течение 28 дней; 3, 4, 5 группы - подопытные, животным данных групп перорально вводили соответственно настои листьев березы, крапивы, подорожника (5 мл/кг) ежедневно на фоне облучения УФЛ в дозе 300 - 320 мэрч/м² (время экспозиции 20 минут) через день в течение 28 дней. Забор крови проводили на 14 и 28 дни эксперимента с последующим исследованием содержания эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, продуктов ПОЛ (гидроперекисей липидов, диеновых конъюгатов, малонового диальдегида) и основных компонентов АОС (церулоплазмина, витамина Е).

Статистические методы включали обработку полученных результатов с использованием параметрического критерия Стьюдента. Малый объем выборок изучаемых показателей послужил основанием выбора непараметрического критерия для оценки достоверности их различий - в работе использован критерий Уилкоксона - Манна-Уитни, при помощи которого определяли значимость различий количественных показателей. Различия считали достоверными при р<0,05 (Гланц Стентон, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.2.1 Изучение влияния УФО на показатели физической работоспособности и интенсивность процессов пероксидации в организме крыс

Результаты проведенных исследований показали, что УФО способствует формированию «синдрома липидной пероксидации», на что указывает достоверное увеличение уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ в крови и внутренних органах крыс (таблица 1): содержание гидроперекисей липидов в крови облучаемых крыс было на 39% выше по сравнению с аналогичным показателем в группе интактных животных, диеновых конъюгатов - на 26%, малонового диальдегида - на 23%.

Таблица 1

Содержание продуктов ПОЛ в крови (нмоль/мл) и внутренних органах (нмоль/г ткани) интактных и облучаемых крыс, М±m

Примечание - * достоверность различий между интактными и облучаемыми УФЛ животными (р<0,05)

Аналогичная тенденция прослеживалась и во внутренних органах экспериментальных животных: в ткани печени крыс на фоне УФО содержание гидроперекисей липидов было на 41% выше аналогичного показателя в группе интактных животных, диеновых конъюгатов - на 30%, малонового диальдегида - на 34,5%; в ткани легкого исследуемые показатели превысили уровень аналогичных в группе интактных крыс на 58,3%, 56,4% и 48,7% соответственно (р<0,05). Несколько иная картина была получена в ткани миокарда лабораторных животных: уровень МДА в группе животных, облучаемых УФЛ, практически не отличался от такового в группе интактных крыс, а содержание диеновых конъюгатов в группе животных, содержащихся в стандартных условиях вивария, даже превосходило аналогичный показатель в группе облучаемых крыс на 15%, однако, уровень гидроперекисей липидов в группе интактных животных был на 39% меньше, чем в группе облучаемых животных. Следовательно, результаты эксперимента свидетельствовали о том, что УФО выступило в роли мощного прооксидантного фактора, способствующего накоплению продуктов радикального характера, объяснение которому, на наш взгляд, лежит в механизме действия УФЛ: в фотоэлектрических процессах ультрафиолетовые лучи выбивают электрон с внешней орбиты атомов клеточных молекул, превращая их в положительно заряженные ионы. В свою очередь, перераспределение электронов является пусковым звеном в инициировании процессов пероксидации. «Ионная коньюктура» в клетках и тканях изменяется, электрические свойства биоколлоидов нарушаются, что приводит к повышению проницаемости клеточных мембран под действием УФЛ: увеличение содержания ионов Na⁺ в клетке способствует избыточному накоплению ионов Cl^- и воды, что вызывает увеличение клеточного объема, результатом которого является сдавление мелких кровеносных сосудов и затруднение кровообращения; накопление в цитоплазме ионов Са²⁺ запускает мембранодеструктивные процессы, связанные с активацией гидролитических ферментов, в частности фосфолипазы А₂, что влечет за собой повреждение внутриклеточных структур; повышение проницаемости для Н⁺ и ОН^- ионов приводит к разобщению окислительного фосфорилирования в митохондриях и потере ими способности аккумулировать Са²⁺; усиление проницаемости для ионов К⁺ ведет к набуханию митохондрий и нарушению биоэнергетических функций. Перекисное повреждение мембран лизосом является причиной повреждения внутриклеточных структур лизосомальными ферментами, а дальнейшее накопление ППОЛ при облучении инактивирует важнейшие мембранные ферменты, такие как Г-6-Ф-аза, цитохром Р-450, Са²⁺-АТФ-аза, МАО, переносчики электронов редокс-цепей митохондрий. Дефицит макроэргов и повреждение клеточных структур собственными гидролитическими ферментами еще больше увеличивает ионную проницаемость мембран клетки и вводит ее в порочный круг нарушения ионного гомеостаза и биоэнергетики, который, если его не разорвать, неумолимо ведет клетку к разрушению.

В свою очередь, анализируя содержание основных компонентов АОС (рисунок 1), было констатировано, что уровень церулоплазмина в плазме крови облучаемых животных был на 29% ниже, в печени - на 44% по сравнению с группой интактных животных, содержание витамина Е в печени имело тенденцию к снижению на 24,4% в условиях УФО, что логично вытекает из общей картины состояния ПОЛ/АОС в теплокровном организме в условиях воздействия стрессовых факторов. Антиоксидантная система, как известно, представляет собой многоуровневую систему, поддерживающую в клетках физиологическую концентрацию супероксидрадикалов и перекисей водорода, что предотвращает цепной процесс образования других, значительно более агрессивных и токсичных свободнорадикальных и перекисных продуктов (Зубкова С. М., 1997; Подколзин А. А., 2000; Ковалева Л. П., 2003). При повышенной энергетической нагрузке и постоянной индукции биосинтеза продуктов пероксидации в условиях длительного УФО, напряжение функционирования звеньев антиоксидантной защиты организма приводит к постепенному истощению компонентов АОС, что усугубляется, как правило, дисбалансом и дефицитом экзогенных микроэлементов (цинк, медь, марганец, железо, селен и др.), необходимых для синтеза антирадикальных и антиперекисных ферментов.

Рисунок 1 Содержание основных компонентов АОС в крови (мкг/мл) и ткани печени (мкг/г) интактных и облучаемых УФЛ крыс

Таким образом, ультрафиолетовое облучение экспериментальных животных способствует активации процессов ПОЛ на фоне снижения устойчивости крыс к физической нагрузке во все дни исследования (рисунок 2): на 7 день - на 21%, 14 - на 23%, 21 - на 32%, 28 - на 34% относительно животных интактной группы, что обусловлено влиянием на клеточные мембраны ППОЛ, изменяющих активность липаз, фосфолипаз, проницаемость липидного бислоя мембран, липоидозащитных ферментов ионного транспорта в дыхательной цепи митохондрий.

Рисунок 2 Продолжительность плавания интактных и облучаемых УФЛ крыс, минуты

Прооксидантное действие УФО было подтверждено нами результатами морфологических исследований системы дыхания (рисунки 3, 4), в которых неоднородность структуры соединительной ткани бронхов и альвеол, фрагментация и очаговое разрушение эластических волокон в межальвеолярных перегородках, а также усиление макрофагальной и лимфоидной инфильтрации структур легкого свидетельствует о стадии адаптивного напряжения.

Рисунок 3 Респираторный отдел легкого крысы на фоне длительного в течение 28 дней воздействия УФО. Крупные и многочисленные лимфоидные инфильтраты вокруг кровеносных сосудов (ЛИ). Размер альвеол и толщина их стенок варьирует. Окраска: гематоксилином Бемера - эозином. Увеличение: 320

Рисунок 4 Респираторный отдел легкого крысы на фоне длительного в течение 28 дней воздействия УФО. Большинство альвеол уменьшены в размере, их просвет заполнен крупными макрофагами (М). Межальвеолярные перегородки утолщены и инфильтрированы лимфоцитами (Л). Окраска: гематоксилином Бемера - эозином. Увеличение: 680

Таким образом, экспериментально было доказано, что УФО инициирует в теплокровном организме свободнорадикальные и перекисные процессы, продукты которых (альдегиды, диальдегиды, эпоксиды) нарушают метаболизм веществ в организме и оказывают повреждающее действие на биомембраны, отличающиеся большим содержанием ПНЖК в фосфолипидах, определяющих высокую способность к цепным реакциям окисления, что играет важную роль в снижении функциональной активности и гибели клетки, поскольку способствует массовому накоплению избытка токсических продуктов окисления - ППОЛ в связи с их многократным воспроизведением.

2.2.2 Изучение влияния адаптогенов на показатели физической выносливости и интенсивность процессов пероксидации, индуцированных УФО, в организме крыс

Поиск лекарственных средств, препятствующих процессам пероксидации в организме в условиях УФО, является на сегодняшний день актуальным, причем достоинствами препаратов растительного происхождения является отсутствие токсичности, побочных эффектов и низкая себестоимость.

Исследование физической выносливости крыс на фоне введения фитопрепаратов в условиях УФО показало, что использование экстракта элеутерококка практически не влияет на длительность плавания животных, введение экстракта родиолы способствует увеличению длительности плавания крыс в динамике относительно контроля на 8% - 30%. Наилучшие показатели были получены на фоне введения экстракта корня солодки (рисунок 5), которые свидетельствовали о достоверном увеличении длительности плавания крыс в сравнении с животными контрольной группы: на 7 день эксперимента на 24%, 14 день - на 13%, 21 день - на 28%, 28 день - на 38%, что, в свою очередь, подтверждалось результатами биохимических исследований состояния ПОЛ/АОС на фоне фармакокоррекции в условиях УФО (таблица 2): введение экстракта корня солодки способствовало достоверному снижению в крови экспериментальных животных уровня гидроперекисей липидов на 34%, диеновых конъюгатов на 29%, МДА - на 17% на фоне увеличения содержания церулоплазмина на 27%, витамина Е - на 31% по сравнению с соответствующими показателями в группе контрольных крыс, что подтверждает возможность коррекции радиационно-индуцированного окисления липидов в условиях стрессового воздействия ультрафиолета введением экстракта корня солодки, интерпретировать которую можно, во-первых, химической идентичностью солодки и кортикостероидных гормонов благодаря наличию глицерризина, при гидролизе которого образуется глицирризиновая кислота (Машковский М.Д., 2010). Последняя, подвергаясь в организме метаболическим преобразованиям, оказывает кортикостероидоподобное действие.

Рисунок 5 Продолжительность плавания крыс в условиях УФО и на фоне введения экстракта корня солодки, минуты

Таблица 2

Содержание продуктов ПОЛ и основных компонентов АОС в плазме крови крыс, подвергнутых УФО, на фоне введения адаптогенов, M±m

Примечание - * и ** - достоверность различий между интактными * и контрольными ** животными (р<0,05)

Во-вторых, учитывая, что солодка обладает свойством стимулировать кору надпочечников (Соколов С.Я., Замотаев И.П., 1988) и, в частности, клетки пучкового слоя, продуцирующего у крыс кортикостерон, она влияет на синтез эндогенных антиокислителей и их активность. Благоприятное влияние препарата солодки на организм подопытных животных объясняется также и тем, что в ней, помимо глицерризина, содержатся и другие фармакологически активные вещества: флавоноиды, проявляющие антиоксидантное действие (Зиновьев А.И., 2003), дубильные вещества, определяющие мембраностабилизирующий эффект, восстанавливающие процессы репарации и улучшающие работу антиоксидантных систем (Разина Т.Г., 2006), каротиноиды, проявляющие антиоксидантную активность при интеграции в мембранные фосфолипидно-белковые структуры, пектиновые и белковые вещества, витамины (в частности, аскорбиновая кислота), пигменты, эфирные масла.

Выраженная антистрессорная активность сока подорожника (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000), антиканцерогенный эффект его полифенольного комплекса - плантастина (Синяков А.Ф., 1998) послужили основанием для углубленного изучения этого растения в эксперименте. Введение сока подорожника экспериментальным животным в условиях УФО способствовало достоверному увеличению длительности плавания крыс в сравнении с животными контрольной группы: на 7 день эксперимента продолжительность плавания животных была выше аналогичного показателя в группе контрольных (облучаемых) крыс на 27,5% и выше, чем в группе интактных животных на 7%; 14 день - на 25% по сравнению с контролем и на 5% - с интактными крысами; 21 день - на 24,3%; 28 день - на 28% (р<0,05). Оценивая состояние ПОЛ/АОС было отмечено (таблица 2), что введение данного лекарственного средства достоверно снижало содержание гидроперекисей липидов в крови облучаемых животных на 20%, диеновых конъюгатов - на 25%, МДА - на 21% на фоне увеличения на 20% и 21% уровня церулоплазмина и витамина Е соответственно, что подтверждает наличие у препарата антиокислительных и антистрессорных свойств, которые, по-видимому, связаны с присутствием в составе растения инвертина, танинов, аскорбиновой и лимонной кислот, активирующих АОС организма и репаративные процессы, причем сочетание полисахаридов с ферментами и витаминами способствует повышению неспецифической резистентности организма, а инактивация свободнорадикальных соединений восстанавливает функциональные показатели тех популяций клеток, которые обладают наибольшей чувствительностью к повреждающему действию АФК.

Введение экстракта родиолы облучаемым животным способствовало снижению содержания основных ППОЛ по отношению к контролю, однако различия были не достоверны. Антиоксидантный эффект адаптогена, наличие которого показано в работах Е.П. Шмерко (1996), В.А. Дадали (2003), связан, на наш взгляд, с возможностью активировать АОС организма за счет повышения уровня эндогенных антиокислителей в крови, активации синтеза эндогенных антиоксидантов в печени или их лучшему всасыванию с пищей, что нашло подтверждение в эксперименте: в крови содержание церулоплазмина в группе крыс, получавших родиолу, превысило таковое в контроле на 30%, витамина Е - на 25,9% (таблица 2); в печени уровень церулоплазмина был выше на 40%, витамина Е - на 38,4%. В группе облучаемых животных, получавших экстракт элеутерококка, тенденции к снижению содержания продуктов пероксидации выявлено не было.