Микробные антагонисты для биологической санации почвы контаминированной патогенными микроорганизмами

Собственные исследования

Материалы и методы

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» в 2008 - 2011 годы в соответствии с планами НИР.

Материалом для исследования служили образцы почв из скотомогильников: образец чернозёмной почвы (Чистопольский район РТ); образец суглинистой почвы (Арский район РТ); образец серой-лесной почвы (Высогокорский район); образец почвы с давним сроком захоронения, из Республики Марий Эл, образец патологческого материала от трупа лабораторного животного.

Отбор проб проводили согласно методическим указаниям по санитарно - микробиологическому исследованию почвы (№ 2293-81, Утв. МЗ СССР 19.02.81). Транспортировку исследуемых образцов осуществляли в соотвествии с санитарными правилами «Порядок учёта, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1 и 4 групп патогенности» (СП 1.2.036-95).

Из образцов почв выделяли изоляты различных таксономических групп: бактерии, микроскопические грибы, актиномицеты. Микробиологические анализы почв проводились по общепринятым методам, с использованием специальных жидких и плотных питательных сред (Г.И. Ежов, 1974). Микроскопические грибы выделяли согласно методике, описанной В.В. Курасовой и соавт. (1971), актиномицеты по Г.Ф. Гаузе (1983).

Изучение морфологических, культуральных, тинкториальных, биохимических и патогенных свойств выделенных культур микроорганизмов проводили методами общей микробиологии (М.О. Биргер, 1983; Ф. Герхард, 1983).

Идентификацию выделенных изолятов проводили у микромицетов по В.И. Билай (1990), бактерий - с помощью определителя микроорганизмов Берджи (1997), актиномицетов - по Г.Ф. Гаузе (1983).

В опытах использовались следующие штаммы условно-патогенных и патогенных микроорганизмов: Bacillus anthracis - шт. № 55-ВНИИВВиМ; Bacillus cereus - шт. №8035, St.aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Candida albicans, Escherichia coli; патогенных и фитопатогенных микромицетов: Aspergillus fumigatus, Fusarium sporotrichioides, F. gramenеarum.

Количественный учет микроорганизмов в жидких и твердых питательных средах проводили методом предельных разведений и чашечным методом Коха на элективных средах (В.В. Аникиев, К. А. Лукомская, 1977).

Антагонистическое взаимодействие между микроорганизмами определяли несколькими методами: метод штрихового посева по Г.Ф. Гаузе (1958), «чашечные» методы: исследования отсроченного антагонизма по Фредерику (Fredericq, 1957), метод прямого антагонизма по Мюррею (Murray, Loeb, 1950), в модификации Б.Я. Усвяцова (1967), и для количественной оценки признака «пробирочный» метод О.В. Бухарина с соавт. (2000).

При изучении характеристики антагонизма микроорганизмов в почвенных моделях производили посев испытуемых суточных моно- и бинарных культур (Н.Г. Гайдукова, 1993; Р.Н. Бадмажапова, 2008). Обработку и стерилизацию почвенных образцов производили по методике Г.И. Ежова (1974). Работу с почвенными моделями проводили с учётом Методических указаний 4.2.1103-02 «Приготовление проб с имитаторами патогенных биологических агентов» (утв. Г.Г. Онищенко, 2002).

Моделирование условий скотомогильника проводили в специальных ёмкостях, которые заполняли почвой и помещали в них трупы животных заражённые суспензией B. cereus и S. typhimurium, вносили в место захоронения животных культуральные взвеси антагонистов. Контролем служили захоронения чистых животных и заражённых животных без обработки антагонистами. По истечении 3 месячного срока почву исследовали на содержание Bacillus cereus и S. typhimurium.

Статистическую обработку полученного материала проводили общепринятыми методами вариационной статистики с помощью критерия Стьюдента с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel 2007.

Результаты исследований

Выделение микроорганизмов из образцов почвы и характеристика их антагонизма

Из различных образцов почв были выделены и получены чистые культуры 113 изолятов микроорганизмов с определением их основных культурально-морфологических свойств.

Из 38 культур бактерий различных видов, в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий антагонизм проявили: к B.cereus - 6 изолятов, в отношении S. typhimurium - 4 изолята, в отношении E. coli - 5 изолятов, в отношении L. monocitogenes - 5 изолятов, в отношении C. аlbicans - 2 изолята, в отношении B.anthracis №55-ВНИИВВиМ - 5 изолятов. Наибольшее количество антагонистов было в отношении St. aureus - 12 изолятов бактерий. Выраженным антагонистическим действием по отношению к патогенным бактериям обладали изоляты культур рода Bacillus, (изоляты под шифрами Bacillus B4, Bacillus B5 и Bacillus B3). По отношению к микромицетам F.gramenearum, F. sporotrichioides и A. fumigatus, антагонистическим действием также обладали штаммы рода Bacillus.

Из актиномицетов антагонизм проявили: к B.cereus - 6 изолятов, S. typhimurium - 2 изолята, St. aureus - 7 изолятов, L. monocitogenes - 2 изолята, C. albicans 1 изолят, B.anthracis № 55-ВНИИВВиМ - 3 изолята. Наибольшее количество антагонистов было в отношении E. coli - 8 изолятов актиномицетов. Более активными были актиномицеты секции Roseus (Streptomyces Аc31/2) (таблица 1). При этом актиномицеты практически не проявили антагонизм в отношении микроскопических грибов.

Из 65 культур микромицетов антагонизм проявили: к B.cereus - 7 изолятов, в отношении St. aureus 5 изолятов, в отношении E. coli - 3 изолята, в отношении B.anthracis 55-ВНИИВВиМ - 2 изолята. Наибольшее количество антагонистов было в отношении C. albicans - 15 изолятов. Следует отметить, что антагонизм к условно-патогенным и патогенным микробам проявили в основном микромицеты рода Trichoderma являющиеся природными биодеструкторами и грибы рода Candida. В отношении Sal. typhimurium и в отношении L. monocitogenes, антагонизм не проявил ни один изолят. В отношении микромицетов F. grameniarum и F. sporotrichioides антагонизм проявили грибы Aspergillus spp. и Trichoderma spp. Следует отметить, что микроскопические грибы явились значительно более слабыми антагонистами, в сравнении с актиномицетами.

Таблица 1 - Антагонистические свойства выделенных актиномицетов

Примечание: «+» - наличие антагонизма; «-» отсутствие антагонизма

Таким образом, наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладали культуры рода Bacillus и актиномицеты.

Следующим этапом работы была оценка взаимного антагонизма наиболее активных изолятов - антагонистов, для образования консорциума микроорганизмов. Установлено, что изоляты Bacillus B4 и Bacillus B5 не проявляют между собой антагонизма, но при этом подавляют рост Bacillus B3. Также изоляты Bacillus B4, Bacillus B5 и Streptomyces Ас31/2 не проявили между собой антагонизма, что делает перспективным их совместное примменение, однако, Streptomyces Ас31/2 подавлял рост Bacillus B3. Следует отметить, что культура Escherichia coli В1 была подавляемой для всех антагонистов, но учитывая, что Escherichia coli В1 проявила антагонистические свойства в отношении сибиреязвенного штамма, данный изолят оставили для последующего изучения. В результате, для дальнейших исследований были отобраны как перспективные изоляты B.subtilis B5, B.subtilis B4, Escherichia coli В1, Trichoderma Tr2, Streptomyces Ас31/2.

Изучение биологических свойств антагонистов

Изучение биологических свойств включало: определение морфологических, культуральных, биохимических и патогенных свойств с составлением паспорта.

Bacillus B4 и Bacillus B5. При микроскопировании выявлены грамположительные удлиненной формы микроорганизмы длиной 1,2±0,2 мкм и шириной 0,1±0,01 мкм - (Bacillus B4); длиной 0,8±0,02, шириной 0,1±0,01 (Bacillus B5), в мазках располагаются поодиночке, парами, короткими цепочками. На МПА отмечено образование средних (2-4 мм), кремового цвета округлых, плоских, вязкой консистенции, не прозрачных колоний с гладкой поверхностью и ровными краями (S-формы колонии).

Исследуемые изоляты ферментируют сахарозу и лактозу без образования газа. Обладают протеолитической, уреазной, амилолитической и каталазной активностью, не образуют сероводород и индол. Не обладают патогенностью. Изоляты идентифицированы как Bacillus subtillis B4 и Bacillus subtillis B5.

Escherichia coli В1. При микроскопировании были выявлены грамотрицательные удлиненной формы микроорганизмы длиной 1-3 мкм и шириной 0,4-0,8 мкм, в мазках располагаются поодиночке, парами, короткими цепочками. На МПА отмечено образование средних (2-4 мм), плоских выпуклых мутных колонии с ровными краями (S-формы колоний). Изолят обладает слабой сахаролитической активностью и ферментирует без образования газа глюкозу и лактозу. Обладает протеолитической, уреазной, амилолитической и каталазной активностью, не образует сероводород и образует индол. Патогеннен для белых мышей.

Streptomyces Ас31/2. При микроскопировании мазков из агаровых культур был выявлен грамположительный, хорошо развитый разветвленный мицелий, цепочки споры с гладкой поверхностью. На МПА: колонии белого цвета, гладкие; на крахмало-аммиачном агаре: воздушный мицелий розоватого цвета, субстратный мицелий бесцветный, колонии изолированные круглые шероховатой поверхностью. Изолят ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу сахарозу, глицерин, маннит, дульцит, лактозу. Обладает протеолитической, уреазной и каталазной активностью, не образует сероводород и индол, не обладает амилолитической активностью. Не патогенен. Изолят идентифицировали как Streptomyces roseus Ас31/2.

Trichoderma Tr2. При микроскопировании мазков из агаровых культур было выявлено: бесцветный, стелющийся мицелий, конидиеносцы вертикальностоящие с мутовчатым разветвлением, бесцветные, конидии эллипсовидной формы. При исследовании морфологических свойств изолята на среде Чапека отмечено образование колоний от тёмно-зелёного до чёрного цвета. Не обладает патогенностью. Изолят идентифицировали как Trichoderma viride Tr2.

Изучение антагонизма бинарных культур в почвенных моделях

Результаты исследования динамики численности роста микробных клеток бинарных культур в стерильной почве при комнатной температуре в течение 6 месяцев (зима, весна, лето) показали, что для культур - бактерий максимальный выход микробной массы был после первого месяца культивирования, причем значительная доля клеток для каждой из данных бинарных культур принадлежит первой культуре - антагонисту. Максимальный выход микробной массы антагониста Streptomyces roseus Ас31/2 был после второго месяца, что связано с особенностями роста актиномицетов.

У бинарных культур Е. coli и В. cereus, Streptomyces roseus Ас31/2 и В. сereus, Streptomyces roseus Ас31/2 и S. typhimurium, Streptomyces roseus Ас31/2 и St. aureus, Streptomyces roseus Ас31/2 и Е. coli, В. subtilis B5 и В. cereus, В. subtilis B5 и В. cereus, В. subtilis B5 и S. typhimurium, В. subtilis B5 и St. aureus, В. subtilis B4 и В. cereus, В. subtilis B4 и S. typhimurium, В. subtilis B4 и St. aureus, Tricdhoderma viride Tr2 и В. cereus после четырёх - пяти месяцев поставленного эксперимента полностью прекратилось выделение подавляемой культуры. Значительная доля клеток для каждой из данных бинарных культур принадлежала культуре-антагонисту. В то же время, среди микромицетов прекращение выделения подавляемой культуры наблюдалось только в бинарной культуре Trichoderma viride Tr2 и Aspergillus fumigatus.

Таблица 2 - Динамика численности роста микробных клеток бинарных культур в стерильной почве при t=20⁰С (nx10⁶)*

* Примечание: в знаменателе КОЕ антагониста, в числителе КОЕ подавляемой культуры.

Результаты исследования динамики численности роста микробных клеток бинарных культур в стерильной почве при природно-климатических условиях (зима, весна, лето) показали, что у бинарных культур после пяти - шести месяцев поставленного эксперимента полностью прекратилось выделение подавляемой культуры. Также значительная доля клеток для каждой из данных бинарных культур принадлежала культуре-антагонисту. В целом более активными антагонистами проявили себя Streptomyces roseus Ас31/2 и штаммы В. subtilis.

Таким образом, наблюдается ингибирование роста подавляемой культуры в конкуренции за питательные субстраты, при которой доминирующую роль играет микроб-антагонист. При прекращении выделения подавляемой культуры наблюдалось одновременно и спад количества клеток микроба-антагониста. Количественная характеристика данных культур в стерильной почве в природно-климатических условиях подтверждают результаты численности бинарных культур при комнатной температуре.

Изучение антагонизма консорциума микроорганизмов в отношении патогенных микробов в почвенных моделях

Изучение патогенных бактерий в естественной природной среде обитания имеет важное научное значение в конструировании модельных проектов и экспериментов. Нами изучалась жизнеспособность микробных изолятов в течение 6 месяцев (зима, весна, лето) в стерильных и нестерильных условиях (стерильной - при изучении влияния консорциума микроорганизмов в стерильной почве при комнатной температуре (20°С), нестерильной - при изучении влияния консорциума и всей ассоциации почвенных микроорганизмов в полевых условиях).

Изучена динамика количественной характеристики патогенных микробов под воздействием консорциума антагонистов в стерильных условиях культивирования (20°С).

Культура St. aureus. В первом месяце (без антагонитстов) при 20°С количество выделенных бактерий из почвы составило 8x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, к 3-ему месяцу количество микробов составило 5x10⁶ КОЕ. Затем происходило снижение количества клеток до 1x10⁶ КОЕ. При культивировании с консорциумом в первом месяце при 20°С количество выделенных бактерий St. aureus из почвы составило 6x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, в дальнейшем происходило снижение к 4-му месяцу до 0,5x10⁶ КОЕ, на 5 и 6 месяцы исследования культура St. aureus не выделялась.

Культура E.coli. В первом месяце при 20°С количество выделенных бактерий из почвы составило 2x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, затем происходило постепенное увеличение количества клеток до 8x10⁶ и в последствии резкое снижение до 4x10⁶ КОЕ . При культивировании с консорциумом в первом месяце при 20°С количество выделенных бактерий E.coli из почвы составило 2x10⁶ КОЕ на 1 г почвы, к 3-му месяцу незначительно увеличилось до 3x10⁶ КОЕ, в дальнейшем происходило снижение к 4-му месяцу до 1x10⁶ КОЕ, на 5 и 6 месяцы исследования культура E.coli не выделялась.

Культура S. typhimurium. В первом месяце при 20°С количество выделенных бактерий из почвы составило 13x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, затем происходило постепенное ежемесячное увеличение микробной массы и к 5-му месяцу количество микробов составило 8x10⁶ КОЕ. Затем происходило резкое снижение количества клеток до 2x10⁶ КОЕ. При культивировании с консорциумом в первом месяце при 20°С количество выделенных бактерий S. typhimurium из почвы составило 6x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, в дальнейшем происходило снижение к 4-му месяцу до 1x10⁶ КОЕ, на 5 и 6 месяцы исследования культура S. typhimurium не выделялась.

Сибиреязвенный вакцинный штамм 55. В первом месяце при 20°С количество выделенных бактерий из почвы составило 4x10⁶ КОЕ на 1 гр. затем повышение на 2 месяц, и постепенное снижение к 4 месяцу и резкое снижение на 5 и 6 мес. - количество микробов составило 2x10⁶ КОЕ. При культивировании с консорциумом в первом месяце при 20°С количество выделенных бактерий из почвы составило 3x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, в дальнейшем происходило снижение к 5-му месяцу до 0,5x10⁶ КОЕ, на 6 месяц исследования культура сибиреязвенного вакцинного штамма 55 не выделялась.

Изучена динамика количественной характеристики патогенных микробов под воздействием консорциума антагонистов в нестерильных, полевых условиях.

Культура St. aureus. В первом месяце (без антагонитстов) количество выделенных бактерий из почвы составило 3x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, к 4-му месяцу количество микробов увеличилось и составило 5x10⁶ КОЕ. Затем происходило снижение количества клеток до 3x10⁶ КОЕ, и к 6-му месяцу количество микробов составило 1x10⁶ КОЕ. При культивировании с консорциумом в первом месяце количество выделенных бактерий St. aureus из почвы составило 2x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, в дальнейшем происходило снижение к 4-му месяцу до 1x10⁶ КОЕ, на 5 и 6 месяцы исследования культура St. aureus не выделялась (рис. 1).

Культура S. typhimurium. В первом месяце количество выделенных бактерий из почвы составило 4x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, к 3-ему месяцу количество микробов составило 3x10⁶ КОЕ. Затем происходило уменьшение количества клеток и к 6-му месяцу количество микробов составило 1x10⁶ КОЕ. При культивировании с консорциумом в первом месяце количество выделенных бактерий S. typhimurium из почвы составило 2x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, к 4-му месяцу уменьшилось до 0,5x10⁶ КОЕ, на 5 и 6 месяцы исследования культура Salm. typhimurium не выделялась.

Сибиреязвенный вакцинный штамм 55. В первом месяце количество выделенных бактерий из почвы составило 4x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, затем происходил скачок увеличения микробной массы к 3-му месяцу 7x10⁶ КОЕ, к 5 и 6 мес. происходило снижение количество микробов, которое составило 3x10⁶ КОЕ. При культивировании с консорциумом в первом месяце количество выделенных бактерий из почвы составило 2x10⁶ КОЕ на 1 гр. почвы, затем снижение и к 5 и 6 мес. количество микробов составило 0,5x10⁶ КОЕ (рис. 2).

Таким образом, культивирование бактерий в полевых условиях, как отдельно, так и с антагонистами варьировала количественная характеристика микробов на 1 гр почвы. Данный результат указывает, что взятые в опыт культуры в большинстве своем относились к мезофильной группе. Хотя отдельные группы микробов обладали свойством психрофильности. Отмечалась некоторая цикличность: к весеннему периоду численность микробных клеток имела тенденцию к увеличению, связанную с повышением температуры среды. И в тоже время наблюдалась противоположная тенденция снижения численности и отсутствия роста в летний период, Это возможно связано с активизацией биохимических процессов в почве, которые негативно могли отражаться на росте и размножения микробов.

Рисунок 1 - Динамика численности роста микробных клеток St. aureus в почве в полевых условиях (nx10⁶).

Рисунок 2 - Динамика численности роста микробных клеток сибиреязвенного вакцинного штамма 55 в почве в полевых условиях (nx10⁶).

Следует отмеметить, что внесение в почву консорциума микробов - антагонистов, несколько сглаживала эту цикличность, вероятно, что повышение температуры в весенние месяцы приводило к активации антагонистов, как за счёт выработки антибиотических средств, так и за счёт скорости роста и заполнения экологических ниш.

Моделирование условий скотомогильника

Моделирование условий скотомогильника провели в лабораторных условиях. Результаты свидетельствуют о достоверном снижении содержания КОЕ B. cereus и S. typhimurium: при обработке консорциумом антагонистов число КОЕ на 1 г почвы B. cereus составило от 10 до 10² , при содержании 10³ - 10⁴ в контроле, число КОЕ S. typhimurium составило от 0 до 10, при содержании 10²- 10³ в контроле.

Таким образом, нами выделены культуры микроорганизмов - потенциальных антагонистов к условно-патогенным и патогенным микробам (в том числе к сибирской язве). Изучены их свойства, а в опытах с использованием различных модельных вариантов установлены и подтверждены их антагонистические свойства. Полученные результаты позволяют говорить о перспективности данных изолятов и технологий для биологической санации. скотомогильник микроб антагонист

Изучение антагонистических взаимоотношений между отдельными представителями почвенного микромира в отношении патогенных для человека и животных микроорганизмов, а на первом этапе даже получение первичных данных, может сыграть немаловажную роль при разработке методов и средств биологической санации скотомогильников и оздоровления почвенных территорий, загрязненных возбудителями инфекционных заболеваний.

Анализируя литературные данные (Г.Г. Онищенко, 2006 и др.) и результаты собственных исследований, необходимо согласиться с выводами ряда исследователей, что санитарной микробиологии почв и изучению роли почвенных микроорганизмов в здоровье человека должно уделяться значительно больше внимания. Даже потенциально существующая возможность снижения риска возникновения эпидемии или эпизоотии делает такое исследование практически значимым.

Результаты проведённых исследований позволяют говорить о перспективности исследований в области использования антагонистов для различных областей народного хозяйства, в том числе в ветеринарии - для санации различных объектов.

выводы

1. Наибольшим потенциалом антагонистического воздействия в почве в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов B.cereus, Sal. typhimurium, St. aureus, E. coli и L. monocitogenes обладают культуры рода Bacillus: Bacillus subtilis B4, Bacillus subtilis B5, актиномицеты Streptomyces roseus Ас31/2, микромицеты: Trichoderma viride Tr2.

2. В отношении B. anthracis наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладают культуры Streptomyces roseus Ас31/2, Bacillus subtilis B4 и Е. coli В1.

3. К фитопатогенным и патогенным микромицетам F.grameniarum, F. sporotrichioides и A. fumigatus наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладали культуры рода Bacillus.

4. В микробиоценозе изучаемых бинарных культур наблюдается антагонизм микроорганизмов, сопровождаемый угнетением роста второй культуры (Е. coli + В. cereus, Streptomyces roseus Ас31/2 + В. cereus, Streptomyces roseus Ас31/2 + S. typhimurium, Streptomyces roseus Ас31/2 + St. aureus, Streptomyces roseus Ас31/2 + Е. coli, В. subtilis B5 + В. cereus, В. subtilis B5 + В. cereus, В. subtilis B5 + S. typhimurium, В. subtilis B5 + St. aureus, В. subtilis B4 + В. cereus, В. subtilis B4 + S. typhimurium, В. subtilis B4 + St. aureus, Tricdhoderma viride Tr2 + В. cereus). Во всех отмеченных случаях при прекращении выделения подавляемой культуры наблюдалось одновременно и спад числа клеток микроба-антагониста.

5. Установлено, что изоляты - антагонисты обладают выраженной сахаролитической, протеолитической, каталазной и уреазной активностью. Изоляты не патогенны для лабораторных животных, (за исключением культуры Escherichia coli В1).

6. Эффективность применения консорциума для санации почвы подтверждена при моделировании условий контаминации почвы патогенными микроорганизмами: при обработке консорциумом антагонистов число КОЕ на 1 г почвы B. cereus составило от 10 до 10², при содержании 10³ - 10⁴ в контроле, число КОЕ S. typhimurium составило от 0 до 10, при содержании 10²- 10³ в контроле.

практические предложения

Результаты исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику НТД:

1. «Методические указания по снижению риска распространения и возникновения сибирской язвы», утвержденные Начальником ГУВ КМ РТ Камаловым Б.В. от 31.10.2011.

2. Паспорта штаммов для депонирования: Streptomyces roseus Ас31/2, Bacillus subtilis B4, Bacillus subtilis. B5, Trichoderma viride Tr2, Escherichia coli В1;

3. Полученные результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре микробиологии в ФГБОУ ВПО «КГАВМ имени Н.Э. Баумана».

список публикаций

1. Семенова С.А., Галиуллин А.К. Микробные антагонисты для биологической санации скотомогильников // Ученые записки КГАВМ. - Казань.-2010.-Т.204.-С. 246-251.

2. Семенова С.А. Антагонисты патогенной микрофлоры скотомогильников. // Материалы международной научно - практической конференции посвященной 50-летию Федерального Центра токсикологической, радиационной и биологической безпасности. - Казань.- 2010. - С.468-471.

3. Семенова С.А., Галиуллин А.К., Матросова Л.Е., Тремасов М.Я. // Антагонистические свойства микроорганизмов и почвенных микромицетов // Иммунопатология, аллергология, инфектология. -2010.-№1. - С. 226-227.

4. Семенова С.А., Галиуллин А.К., Маркунина Е.В. Микробный пейзаж почвы сибиреязвенных захоронений. // Ученые записки КГАВМ.-Казань.-2010.-Т.200.- С. 192-197.

5. Семенова С.А., Галиуллин А.К. Изучение микробных антагонистов при моделировании условий скотомогильников. // Ученые записки КГАВМ. - Казань.-2011.-Т.205.-С. 190-193.

Размещено на Allbest.ru