Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Совершенствование ретроспективной диагностики токсоплазмоза кошек и собак

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология;

03.00.19 - паразитология

кандидата ветеринарных наук

Воробьева Марина Николаевна

Казань, 2007

Работа выполнена на кафедре патологии мелких животных и оперативной хирургии и кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО “Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана”, в отделе культивирования и идентификации вирусов Республиканского центра профилактики и борьбы со СПИД и инфекционными заболеваниями Минздрава РТ

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор, Равилов Рустам Хаметович

Научный консультант: кандидат биологических наук Герасимов Валерий Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Алимов Азат Миргасимович

доктор ветеринарных наук, профессор Хазиев Гадельгарай Закирович

Ведущее учреждение: ФГОУ ВПО “Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия”

Защита состоится 30 мая 2007 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д-220.034.01

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО “Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана”

Автореферат разослан 26 апреля 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор М.С. Ежкова

Общая характеристика работы

токсоплазмоз животное иммуноферментный сероконверсия

Актуальность темы. Актуальность проблемы токсоплазмоза обусловлена практически повсеместным распространением возбудителя в природе, высокой частотой инфицированности и способностью токсоплазм длительно персистировать в пораженных клетках, а также опасностью заражения людей от животных.

Болезнь регистрируется во всех странах мира. Зараженность токсоплазмами кошек и собак, сельскохозяйственных животных и человека в той или иной степени выявлена в большинстве стран Европы, Америки, Африки и Азии. Установлено, что примерно у 25-30% населения земного шара выявляются антитела к токсоплазмам (есть регионы, где до 50-90% людей имеют такие антитела). Кошке среди других представителей семейства кошачьих принадлежит основная роль в распространении этой инвазии. Кошки распространены во всех странах мира, имеют тесный контакт с человеком, сельскохозяйственными и домашними животными (Галузо И.Г., 1963).

Значительный полиморфизм клинических проявлений при токсоплазмозе, разнообразный характер течения болезни и преобладание латентных форм инвазии над клинически выраженными практически исключают возможность постановки диагноза только на основании клинической картины, в связи с этим возрастает роль лабораторных исследований, включающих паразитологические и иммунологические методы (Мороз Б.В., 1984).

Паразитологические исследования включают световую микроскопию и выделение паразита. Метод прямой микроскопии, хотя несложен и доступен, не всегда результативен, а выделение токсоплазм не пользуется широкой популярностью из-за большой трудоемкости и необходимости соблюдения режимных условий при работе с живым возбудителем. В подавляющем большинстве случаев при диагностике токсоплазмоза ориентируются на данные серологических исследований.

Наиболее популярными методами ретроспективной диагностики заболевания у людей являются реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) и иммуноферментный анализ (ИФА). РНИФ и ИФА успешно сочетают в себе чувствительность, специфичность и простоту выполнения теста. В ветеринарной практике для этих целей до настоящего времени применяют реакцию связывания комплемента (РСК), которая по своим характеристикам значительно уступает двум первым методам.

Применение иммуноферментного метода ветеринарными специалистами во многом сдерживается отсутствием в достаточном количестве необходимых компонентов (тест-систем и оборудования), но, учитывая его диагностическую важность, можно уверенно утверждать, что в перспективе ИФА станет достоянием ветеринарных лабораторий при диагностике инфекционных и инвазионных болезней.

В доступной литературе встречаются сообщения об использовании ИФА для диагностики токсоплазмозов у животных (Remington J.S., 1994; Lappin M.R., 1996; Lin D.S., 1997; Park Y.K., 1999; Sohn W.M., 1999). Несмотря на это, вопросы серологической диагностики токсоплазмоза у кошек и собак до настоящего времени остаются открытыми.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - усовершенствовать средства диагностики токсоплазмоза у мелких домашних животных (кошек и собак).

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

- провести комплекс исследований по выяснению этиологической роли токсоплазм при различной патологии у мелких домашних животных;

- разработать токсоплазменный антиген для иммунологических реакций и изучить его свойства;

- сконструировать тест-систему для ретроспективной диагностики токсоплазмоза у кошек и собак иммуноферментным методом;

- доказать преимущества разработанной тест-системы для индикации специфических антител по сравнению с общепринятыми;

- изучить сероконверсию токсоплазменных антител у иммунизированных кошек.

Научная новизна. Впервые сконструирована и апробирована в лабораторных и производственных условиях иммуноферментная тест-система для индикации в сыворотках крови кошек и собак противотоксоплазменных антител.

Разработана новая технология получения токсоплазменного антигена для иммунологических реакций.

С использованием разработанного набора диагностикумов проведен серологический скрининг спонтанно зараженных токсоплазмами мелких домашних животных.

Практическая ценность. Разработана тест-система ИФА для ретроспективной диагностики токсоплазмоза у кошек и собак.

Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику нормативно-технические документы:

- во “Временную инструкцию по изготовлению и контролю иммуноферментной тест-системы для выявления токсоплазменных антител у кошек и собак”, утвержденную ректором ФГОУ ВПО КГАВМ 3 декабря 2004 г.;

- в “Технические условия на опытную партию иммуноферментных тест-систем для выявления токсоплазменных антител у кошек и собак”, утвержденные ректором ФГОУ ВПО КГАВМ 3 декабря 2004 г.;

- во “Временное наставление по применению иммуноферментной тест-системы для выявления токсоплазменных антител у кошек и собак”, утвержденное начальником ГУВ Кабмина РТ 3 декабря 2004 г.;

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- Ежегодных итоговых заседаниях проблемных советов советов ФГОУ ВПО “Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана” (2002-05 гг.).

- Научно-практических конференциях по проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2002, 2004-06 гг.).

- Научно-практической конференции “Актуальные вопросы ветеринарной медицины домашних животных” (Екатеринбург, 2003 г.).

- XI, XIII и XIV Международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2003, 2005 и 2006 гг.).

- Конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 2004 г.).

- V Всероссийской научно-практической конференции “Ветеринарная медицина: современные проблемы и преспективы развития” (Саратов, 2005 г.)

- Международном симпозиуме “Научые основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний” (Казань, 2005 г.).

Публикация результато(в исследования. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ. Разработаны нормативно-технические документы на набор биопрепаратов: наставление по применению, инструкция по изготовлению и контролю, технические условия.

Основные положения диссертации, выдвигаемые для защиты:

значительная встречаемость подозрительных по заболеванию токсоплазмозом кошек и собак в практике городских ветеринарных клиник;

эффективность иммуноферментого анализа по сравнению с общепринятыми методами ретроспективной диагностики токсоплазмоза;

возможность использования ПЦР для идентификации токсоплазм;

высокая позитивность поголовья кошек и собак в отношении токсоплазменной инвазии при серологическом скрининге.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (5 глав), обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 271 источник, в том числе 198 иностранных и 6 ссылок на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 8 рисунками. Прилагаются разработанные нормативно-технические и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.

Содержание работы

Материалы и методы. Работа выполнена в 2001-2006 годы на кафедре патологии мелких животных и оперативной хирургии и кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО “Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана”, в отделе культивирования и идентификации вирусов Республиканского центра профилактики и борьбы со СПИД и инфекционными заболеваниями Минздрава РТ, в государственных и коммерческих ветеринарных клиниках г. Казани.

В опытах были использованы: взрослые кошки (32); взрослые собаки (20); сыворотки крови кошек (993); сыворотки крови собак (356); клинический материал (кал), полученный от кошек (128).

В качестве исходного материала при изготовлении токсоплазменного антигена и получении иммунных токсоплазменных сывороток использовали инактивированные лиофилизированные культуры производственных штаммов токсоплазм рода T. gondii.

При эпизоотологическом обследовании была использована ветеринарная учетная документация районных ветеринарных клиник, частных ветеринарных клиник и кабинетов, частнопрактикующих ветеринарных врачей.

Индикацию и идентификацию возбудителя в пробах патологического и клинического материала осуществляли при помощи световой микроскопии и в полимеразной цепной реакции. ПЦР проводили с использованием специфичных для Toxoplasma gondii олигонуклеотидных праймеров, сконструированных Burg J.L. с соавт. (1989).

В качестве серологических тестов использовали РСК и ИФА. РСК выполняли с использованием стандартного набора диагностикумов, ИФА - по непрямому методу. Учет результатов ИФА проводили с помощью спектрофотометра при длине световой волны 450 нм.

При получении антигена суспензию токсоплазм обрабатывали ультразвуком и детергентами в 5 различных сочетаниях: обработка УЗДН; обработка УЗДН и 1%-ным тритоном-Х100; обработка УЗДН и 1%-ным дезоксихолатом натрия; обработка УЗДН и 0,1%-ным додецилсульфатом натрия; обработка УЗДН и 1%-ным твином-80. Очистку полученных полуфабрикатов проводили путем ультрацентрифугирования при 100000g в течение 6,5 часов в градиенте плотности сахарозы 5-55% (w/v) с шагом 5%.

Электрофоретическое разделение биомолекул проводили электрофорезом в линейном (10-20%) градиенте плотности пластины ПААГ по методу, описанному Laemmli. Сканирование электрофореграмм проводили на сканере Sharp (Япония). Анализ результатов сканирования проводили с использованием специализированной компьютерной программы Image Master 1D Gel Analysis v 3.0.

Статистическую достоверность полученных данных определяли по методу Стъюдента. Статистическую обработку результатов серологических исследований проводили по методике описанной Сайдуллиным Т.С.

На отдельных этапах работа проводилась совместно с к.б.н. Хаертыновым К.С. и к.б.н. Вафиным Р.Р.

Клинико-эпизоотологические аспекты токсоплазмоза кошек и собак. По данным эпизоотологического обследования доля домашних плотоядных с клиническими признаками, характерными для токсоплазменной инвазии (рвота, диарея, желтуха, увеличение лимфатических узлов, панкреатит, поражения органов зрения, поражение центральной нервной системы, аборты, бесплодие, мертворожденние, рождение слабого нежизнеспособного молодняка, острая пневмония, сепсис и др.), этиология которых остается невыясненной, составляет от 17 до 25% от общего числа кошек и собак, владельцы которых обращаются к ветеринарным специалистам.