Физиологическое обоснование применения фитогепатопротектора "Винспир" в ветеринарии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Физиологическое обоснование применения фитогепатопротектора «Винспир» в ветеринарии

03.03.01 - Физиология

кандидата биологических наук

Павлова Ольга Николаевна

Казань, 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Гондарева Людмила Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Логинов Георгий Павлович

доктор биологических наук, профессор Зайцев Владимир Владимирович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится 23 апреля 2010 года в 13.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 220.034.02 при ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» по адресу 420074, г. Казань, ул. Сибирский тракт, 35, КГАВМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана».

Автореферат разослан марта 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, доцент Мухаметгалиев Н.Н.

Общая характеристика работы

гепатопротектор спирулин морфологический оксидативный

Актуальность исследования. Печень - жизненно важный непарный внутренний орган, выполняет большое количество различных физиологических функций.

В печени происходит один из этапов обезвреживания токсических веществ и подготовка к выводу их из организма. Скорость переработки токсических компонентов в печени ограничена и не может быть резко увеличена в соответствии с возрастающими потребностями организма и, как следствие, возникают нарушения нормального хода процессов метаболизма, иммунного ответа, детоксикации и антимикробной защиты организма [Н.А. Антипанова, Н.Н. Котляр, 2006; Ю.П. Гичев, 2002].

В патогенезе нарушений функций печени важную роль играет увеличение уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводящего к оксидативному стрессу, при котором нарушается проницаемость клеточных мембран и изменяются функции клеток. Огромную роль в этом процессе играют свободные радикалы [В.А. Барабой, И.И. Брехман, В.Г. Глотин, 1992; Ю.А. Владимиров, 2000].

Свободнорадикальное окисление - это необходимое условие обновления цитоплазматических мембран и их нормального функционирования, но поддержание гомеостаза в организме невозможно без работы антиоксидантных систем, нейтрализующих излишние свободные радикалы [Н.К. Зенков, 2001].

Антиоксиданты вырабатываются в различных тканевых структурах и клеточных компонентах, имеют различную субстратную специфичность, но все они обладают сродством к активным формам кислорода и обеспечивают комплексную защиту биополимеров.

Однако при окислительном стрессе механизмы ферментной защиты оказываются недостаточны и возникает необходимость дополнительного введения в организм низкомолекулярных антиоксидантов.

Проведенный нами анализ результатов исследований, приведенных в доступной литературе, показал, что биологически активные соединения (БАС) биомассы сине-зеленой микроводоросли спирулины платенсис (Spirulina platensis) и шрота семян винограда могут быть основой для изготовления высокоэффективных гепатопротекторов.

Уникальное сочетание БАС (белки, витамины группы В, С, Е, полиненасыщенные жирные кислоты, пигменты: каротиноиды, хлорофилл, фикоцианин) обуславливают позитивное влияние биомассы спирулины на организм человека и животных.

Виноградный шрот в свою очередь содержит биологически активные фенольные соединения и имеет богатый набор ценных минеральных компонентов. Суммарное сочетание этих растительных объектов взаимно обогащает и усиливает позитивное действие на организм.

В связи с этим, целью нашей работы явилось создание комплексного фитогепатопротектора - смеси «ВинСпир» и изучение ее влияния на морфологический состав крови и функцию печени.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи:

разработать технологию получения и создать гепатопротектор на основе биомассы спирулины и шрота семян винограда;

изучить морфологический состав крови крыс при нагрузке фитоантиоксидантами;

изучить влияние смеси «ВинСпир» и ее составляющих на морфологический состав крови животных, находящихся в состоянии оксидативного стресса;

изучить функцию системы ПОЛ-АО печени крыс на нагрузку смесью «ВинСпир» и отдельными ее компонентами у интакных крыс и на модели оксидативного стресса в сравнительном аспекте с в-каротином;

разработать регламент применения смеси «ВинСпир».

Научная новизна работы. Впервые создан комплексный фитогепатопротектор на основе биомассы спирулины и шрота семян винограда в соотношении 1:1 - смесь «ВинСпир». Разработана технология изготовления смеси и определена лекарственная форма.

Установлено, что компоненты «ВинСпир» обладают антиоксидантной активностью (экстракт биомассы спирулины ингибирует процесс аутоокисления адреналина на 76%, а экстракт шрота семян винограда - на 53%), имеют богатый микроэлементный состав и соответствуют параметрам микробиологической чистоты СанПин 2.3.2.1078-01.

Выявлено, что биомасса спирулины и шрот семян винограда позитивно влияют на состав периферической крови клинически здоровых животных и животных с гипофункцией печени, но более значимый положительный эффект наблюдается в случае их сочетанного применения в виде смеси «ВинСпир».

Выявлено, что на нагрузку композицией «ВинСпир» и ее компонентами организм клинически здоровых крыс отвечает смещением равновесия в системе ПОЛ-АО печени в сторону снижения выработки антиоксидантных ферментов.

Нагрузка фитоантиоксидантами организма крыс с гипофункцией печени восстанавливает нарушенное равновесие в системе ПОЛ-АО достоверным снижением активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, а также увеличением активности каталазы, глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и снижением концентрации малонового диальдегида в тканях органа.

Впервые выявлен гепатопротекторный эффект шрота семян винограда. Сочетанное применение биомассы спирулины и шрота семян винограда в виде смеси «ВинСпир» обогащает и усиливает их позитивное влияние на организм животных.

Доказано, что смесь «ВинСпир» по своему гепатопротекторному действию превосходит известный препарат в-каротин и может быть рекомендована как лечебное средство.

Полученные результаты являются новыми и дополняют научные знания о физиологии печени.

Практическая значимость. Шрот семян винограда является вторичным ресурсом и его использование создает безотходную технологию производства, что в настоящее время является актуальной задачей.

Биомасса спирулины и шрот семян винограда, необходимые для создания смеси «ВинСпир» доступны, экологически безопасны и экономически выгодны.

Смесь «ВинСпир» может быть использована при гипофункции печени, что позволяет расширить ассортимент существующих средств, обладающих выраженным антиоксидантным и гепатопротекторным действием.

Разработаны технические условия и технические инструкции для производства смеси «ВинСпир».

Результаты исследований внедрены в учебный процесс при подготовке и переподготовке специалистов в Поволжской государственной социально-гуманитарной академии в г. Самара и Ульяновском государственном университете в г. Ульяновск.

Имеется положительное решение № 2009136886/22(052141) о выдаче патента на полезную модель «Устройство для смешения компонентов биологически активных добавок растительного происхождения» от 05.10.2009 г.

Технологические решения по производству смеси «ВинСпир» и методы контроля качественного и количественного состава внедрены на предприятиях ООО «Эмульсионные технологии» и ООО НПФ «ХимПром» г. Самара.

Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XXXIV научной конференции студентов и аспирантов (Самара 2007); Медико-фармацевтическом конгрессе, 14-й Международной фармацевтической выставке «Аптека 2007» (Москва, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития пищевой промышленности и общественного питания» (Челябинск 2007);
Всероссийской научно-технической конференции «Современные сервисные технологии» (Самара 2007); «IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы развития транспортного комплекса» (Самара, 2008); «III Всероссийской научно-практической конференций «Процессы, технологии, оборудование и опыт переработки отходов и вторичного сырья» (Самара 2008); «III конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2008).

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из которых 4 - в рекомендуемых ВАК изданиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

Биомасса спирулины и шрот семян винограда имеют богатый микроэлементный состав, обладают выраженной антиоксидантной активностью, экологически безопасны и соответствуют требованиям микробиологической чистоты СанПин 2.3.2.1078-01. На основе биомассы спирулины и шрота семян винограда в соотношении 1:1 разработан комплексный фитогепатопротектор - смесь «ВинСпир».

Смесь «ВинСпир» и ее компоненты оказывают позитивное влияние на морфологический состав крови клинически здоровых животных и животных с гипофункцией печени.

Биомасса спирулины, шрот семян винограда и смесь «ВинСпир» оказывают выраженный гепатопротекторный эффект при гипофункции печени, снижая активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы и концентрацию малонового диальдегида, а также увеличивая активность каталазы, глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы в тканях органа, тем самым уменьшая уровень ПОЛ.

Гепатопротекторный эффект смеси «ВинСпир» значительно превосходит таковой отдельных ее компонентов и известный препарат в-каротин в среднем на 17 %.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 47 таблиц, 31 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объектам наблюдения и методам исследований, и пяти глав, содержащих результаты собственных исследований. Список литературы включает 188 источников, в том числе 44 иностранных авторов.

Содержание работы

Исследования проводились в опыте in vitro и in vivo на базе кафедры фармацевтической технологии, кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, кафедры фармакологии Самарского государственного медицинского университета, а также на кафедрах органической, биоорганической и медицинской химии, общей химии и хроматографии и кафедре зоологии Самарского государственного университета.

В качестве объектов наблюдения служили 570 беспородных белых крыс - самцов массой 190-210 г. На 40 животных изучали морфологический состав периферической крови после нагрузки растительными гепатопротекторами.

На 50 животных были проведены исследования по изучению изменений морфологического состава крови крыс под влиянием растительных гепатопротекторов на фоне оксидативного стресса.

Изучение функции системы ПОЛ-АО печени крыс на нагрузку растительными антиоксидантами у интакных крыс и на модели оксидативного стресса в сравнительном аспекте с в-каротином осуществляли на 100 животных.

Все эксперименты были проведены в 3-х повторностях.

В качестве фитоантиоксидантов-гепатопротекторов использовали биомассу спирулины и шрот семян винограда, а также разработанную на их основе в соотношении 1:1 комплексную смесь «ВинСпир».

В экспериментах использовали биомассу микроводоросли Spirulina platensis, культивирование которой осуществляется на базе ООО «Неофит» (г. Самара) и шрот семян винограда, который вырабатывают на базе ООО «Золотой Корень» г. Самара.

Для изучения биомассы спирулины, шрота семян винограда и разработки на их основе смеси «ВинСпир» нами были использованы физико-химические методы исследования (ТСХ, ВЭЖХ, рентгенфлоуресцентная спектрометрия); химические методы (исследование антиоксидантной активности); микробиологические методы (исследование микробиологической чистоты); биологические методы (исследование экологической безопасности по стандартной методике Н.С. Строганова), математические методы (статистическая обработка результатов исследований).

Также нами использовались общепринятые гематологические, физиологические и биохимические методы исследования состояния животных (определение активности ферментов, определение гематологических показателей) с целью выявления влияния фитоантиоксидантов на состав крови и систему перекисного окисления липидов - антиоксидантов печени здоровых животных и животных, находящихся в состоянии оксидативного стресса.

Схема проведения экспериментов представлена на рисунке 1.



Рисунок 1. Схема проведения экспериментов

Исследование биомассы спирулины, шрота семян винограда и разработка комплексного гепатопротектора на их основе. Качественный и количественный безэталонный элементный анализ биомассы спирулины и шрота семян винограда производился методом рентгеноспектрального флоуресцентного анализа. Полученные результаты подтвердили, что оба объекта имеют богатый минеральный состав.

Изучение антиоксидантной активности 1 % экстрактов биомассы спирулины и шрота семян винограда проводили методом аутоокисления низких концентраций адреналина в щелочной среде. Результаты показали, что водный экстракт биомассы спирулины ингибирует аутоокисление адреналина на 76%, экстракт шрота семян винограда - на 53%.

Исследование микробиологической чистоты растительных субстанций осуществляли по методике ГФ ХI для выявления и подсчета бактерий, дрожжевых и плесневых грибов. Полученные результаты выявили, что шрот семян винограда, и биомасса спирулины платенсис отвечают требованиям микробиологической чистоты СанПин 2.3.2.1078-01. Содержание КМАФАнМ (количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов) в водных экстрактах биомассы спирулины и шрота семян винограда соответствует норме, БГКП (колиформы) и дрожжи не обнаружены, плесень, также обнаруживается в пределах нормы.

Изучение экологической безопасности растительных антиоксидантов-гепатопротекторов проводили по стандартной методике Строганова Н.С. на тест-объектах - дафниях. Длительность эксперимента составляла 21 сутки. Каждая серия была проведена в трех повторностях. В ходе эксперимента учитывали: количество погибших и оставшихся в живых рачков; время появления яиц в выводковых камерах; время выхода молоди из выводковых камер и ее количество. Достоверность различий оценивали по критерию Вилкоксона - Манна - Уитни.

Выявлено, что биомасса спирулины, шрот семян винограда и их композиция в соотношении 1:1экологически безопасны.

Выявленные характеристики биомассы спирулины и шрота семян винограда позволяют использовать их в композиции в виде комплексной фитосмеси «ВинСпир».

Смесь «ВинСпир» представляет собой композицию биомассы спирулины и шрота семян винограда в соотношении 1:1. Разработана технология получения смеси «ВинСпир» (рис. 2) и ее лекарственная форма.



Рисунок 2. Технологическая схема производства капсул «ВинСпир»

На ручных весах отвешивают равное количество биомассы спирулины и шрота семян винограда, биомассу дополнительно измельчают в ступке, оба компонента тщательно смешивают. Затем полученной смесью порошков наполняют твердые желатиновые капсулы и их закрывают. Для получения кишечнорастворимых капсул производят обработку оболочек готовых и заполненных капсул формальдегидом для придания ей большей твердости с целью продления времени распадаемости капсулы, чтобы до попадания в кишечник не происходило ее разрушение, а, следовательно, и разрушение биологически активных соединений компонентов. Капсулы «ВинСпир» цилиндрической формы с полусферическими концами весом 0,6 г, состоящие из двух частей, которые входят одна в другую, не образуя зазоров. Внутри мелкодисперсный сыпучий порошок серо-зеленого цвета, имеющий специфический запах.

«ВинСпир» необходимо принимать по 1 капсуле 3 раза в день вместе с пищей тридцатидневным курсом с последующим повтором каждые полгода..

Для качественного анализа смеси «ВинСпир» нами выбран метод ТСХ, с помощью которого были идентифицированы в-каротин и фикоцианин биомассы спирулины, галловая кислота и флавоноиды шрота семян винограда. С помощью количественных методов анализа смеси «ВинСпир» было установлено, что содержание в-каротина в ней составляет 0,15±0,01 мг %, фикоцианина - 80,25±0,65 мг % и галловой кислоты - 8,27± 0,61 мг %.

Исследование морфологического состава крови крыс на фоне нагрузки фитоантиоксидантами. Исследование влияния фитогепатопротекторов на состав крови изучали в течение 35 дней на 40 белых беспородных крысах-самцах массой 190-210 г, разделенных на группы. Одна группа являлась контрольной и получала воду дистиллированную, животные опытных групп получали:

2 группа - суспензию биомассы спирулины;

3 группа - суспензию шрота семян винограда;

4 группа - суспензию «ВинСпир».

В соответствии с разделением на группы животным вводили воду и фитоантиоксиданты в виде суспензий внутрижелудочно с помощью зонда в дозе 10 мг/100 г веса тела, объемом 1 мл. Суспензии биомассы спирулины, шрота семян винограда и их композиции готовили на дистиллированной воде.

Взятие крови у крыс проводилось из хвостовых вен по общепринятой методике. Состав крови определяли у крыс до начала исследований, а также на 1, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 23, 28, 35 дни эксперимента. Оценивали следующие показатели: количество эритроцитов и лейкоцитов, лейкоформула, содержание гемоглобина и СОЭ.

Результаты исследований приведены в таблицах 1-4.

Динамика изменения, состава крови крыс представлена на рисунках и в таблицах.

Исследование влияния суспензии биомассы спирулины, шрота семян винограда и смеси «ВинСпир» показало, что содержание эритроцитов в крови животных достоверно увеличивается в зависимости от продолжительности поступления испытуемых веществ в организм (табл. 1).

Таблица 1. Количества эритроцитов в крови крыс на фоне нагрузки фитоантиоксидантами, (М·10¹²/л)

дни	контроль	суспензия шрота	суспензия спирулины	«ВинСпир»
0	2,80±0,18	2,84±0,17	2,90±0,17	2,82±0,15
35	3,15±0,27	5,35±0,141	4,78±0,161	5,45±0,091

Примечание. В этой таблице различия достоверны при P<0,05: ¹ - по сравнению с показателями животных контрольной группы.

Увеличение количества эритроцитов в 1 л крови животных на 35 день эксперимента, по сравнению с контрольной группой составило в 3 группе - 49,85 %, во 2 - 38,55 % и 4 группе - 57,97 %.

Концентрация гемоглобина в крови на момент окончания эксперимента по сравнению с контролем, в группе животных, получавших суспензию шрота виноградных семян, была выше на 34,4 %, в группе животных, получавших суспензию биомассы спирулины - на 22,0 %, а в группе, получавшей «ВинСпир» - на 39,5 %.

В контрольной группе наблюдались незначительные колебания концентрации гемоглобина в крови на протяжении всего эксперимента (табл. 2).

Таблица 2. Концентрации гемоглобина в крови крыс на фоне нагрузки внутрижелудочно фитоантиоксидантами, (г/л)

дни	контроль	суспензия шрота	суспензия спирулины	«ВинСпир»
0	74,5±3,5	77,2±2,4	75,4±2,6	77,1±2,3
35	87,0±4,0	115,2±3,11	106,1±3,41	121,4±3,81

Примечание. В этой таблице различия достоверны при P<0,05: ¹ - по сравнению с показателями животных контрольной группы.

Таблица 3. Изменение содержания лейкоцитов в крови крыс на фоне нагрузки внутрижелудочно фитоантиоксидантами, (М·10⁹/л)

дни	контроль	суспензия шрота	суспензия спирулины	«ВинСпир»
0	5,82±0,43	5,96±0,23	6,12±0,22	5,78±0,37
35	13,63±0,64	17,52±0,371	19,31±0,201	20,41±0,351

Примечание. В этой таблице различия достоверны при P<0,05: ¹ - по сравнению с показателями животных контрольной группы.

Увеличение числа лейкоцитов в группе крыс, получавшей суспензию виноградного шрота, по сравнению с контролем составляет 28,54 %, получавшей суспензию спирулины - 41,67 %, а композицию - 49,74 % (табл.3).

В контрольной группе также отмечается рост числа лейкоцитов, но в целом, все эти колебания также находились в пределах физиологической нормы.

В лейкоцитарной формуле колебания эозинофилов и моноцитов были в статистически незначимых пределах, в отличие от сегментоядерных и палочкоядерных лейкоцитов (табл. 4).

Таблица 4 Динамика содержания палочкоядерных лейкоцитов в крови на фоне нагрузки внутрижелудочно фитоантиоксидантами (%)

дни	контроль	суспензия шрота	суспензия спирулины	«ВинСпир»
0	1,73±0,32	1,67±0,14	1,71±0,14	1,69±0,14
35	1,70±0,17	2,19±0,151	2,12±0,371	2,22±0,0,181

Примечание. В этой таблице различия достоверны при P<0,05: ¹ - по сравнению с показателями животных контрольной группы.

Увеличение числа палочкоядерных лейкоцитов в группе крыс, получавшей суспензию виноградного шрота, по сравнению с контролем составляет 28,82 %, получавшей суспензию спирулины - 24,71 %, а композицию - 30,59 %.

Изменение сегментоядерных лейкоцитов было существенным, но статистически значимым только в группе животных, получавших суспензию «ВинСпир».

Отклонения в содержании лимфоцитов и СОЭ у подопытных животных происходили в минимальных и статистически незначимых пределах.

Таким образом, по результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что биомасса спирулины и шрот семян винограда позитивно влияют на состав периферической крови крыс. Но более значимый положительный эффект наблюдается в случае применения их композиции - смеси «ВинСпир», сочетающей в себе биологически активные соединения двух ценных растительных субстанций.

Изучение защитного действия фитоантиоксидантов по морфологическому составу крови. Исследования проводили на 50 беспородных белых крысах-самцах массой 190-210 г. , разделенных на 5 равночисленных групп. Крысы первой группы служили как контроль и получали дистиллированную воду. Животным 3, 4 и 5 групп в течение 30 дней внутрижелудочно вводили в дозе 10 мг/100 г массы тела биомассу спирулины, шрот семян винограда и смесь «ВинСпир» соответственно группе.

Затем, в течение 6 дней крысам внутримышечно вводили 50 % раствор тетрахлорметана на абрикосовом масле в дозе 2 г/кг массы тела животного параллельно с введением фитоантиоксидантов, а животным 2 группы - параллельно с введением дистиллированной воды.

На 37 день эксперимента у крыс брали кровь для исследования морфологического состава. Результаты исследования приведены в таблице 5.

Оценку изменения состава крови проводили по следующим показателям: количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоформула, концентрация гемоглобина, СОЭ.

Таблица 5. Гематологические показатели крыс при приеме фитоантиоксидантов на фоне оксидативного стресса

Показатель	Группы животных
	Контроль	Контроль + ССl4	Спирулина + ССl4	Шрот семян винограда + ССl4	Смесь «ВинСпир» + ССl4
Эритроциты, М·1012/л	4,98±0,19	3,15±0,141	3,97±0,151	4,13±0,121	4,45±0,161
Гемоглобин, г/л	115,2±2,9	79,6±1,91	92,5±3,31	98,7±2,91	103,3±2,91
Лейкоциты, М·109/л	8,45±0,27	13,06±0,291	11,93±0,311	11,64±0,281	10,45±0,331
Палочкоядерные лейкоциты, %	2,22±0,18	1,13±0,121	1,67±0,131	1,60±0,141	1,87±0,161
Сегментоядерные лейкоциты, %	18,67±0,93	24,82±1,631	21,12±1,25	20,37±1,061	19,69±1,031
Эозинофилы, %	2,05±0,37	1,17±0,181	1,68±0,37	1,74±0,35	1,71±0,33
Моноциты, %	1,33±0,21	2,24±0,381	1,83±0,29	1,75±0,24	1,67±0,31
Лимфоциты, %	67,17±2,37	84,67±3,551	72,31±3,321	73,33±3,251	71,52±2,521
СОЭ	1,36±0,23	1,88±0,44	1,66±0,23	1,50±0,18	1,53±0,19

Примечание. В этой таблице различия достоверны при P<0,05: ¹ - по сравнению с показателями животных контрольной группы, получавших тетрахлорметан.

Установлено, что у интактных животных количество эритроцитов в крови составляло 4,98±0,19 М·10¹²/л. У крыс, получавших тетрахлорметан, количества эритроцитов в крови достоверно снизилось на 36,75 %, концентрации гемоглобина - на 30,90 %, а число лейкоцитов увеличилось на 60,95 %.

В лейкоформуле: палочкоядерных лейкоцитов меньше на 49,10 %, эозинофилов - на 42,93 %, сегментоядерных больше на 32,94 %, моноцитов - на 68,42 %, лимфоцитов - на 26,05 % относительно интактных животных.

У животных, получавших биомассу спирулины, достоверно увеличилось количество эритроцитов в крови на 26,03 % и концентрация гемоглобина на 16,21 % по сравнению с результатами, полученными от животных, находящихся в состоянии оксидативного стресса (табл. 5).

Биомасса спирулины способствовала достоверному снижению роста лейкоцитов на 8,65 % в крови на фоне введения тетрахлорметана; количество палочкоядерных лейкоцитов достоверно увеличилось на 47,78 %.

Отмечалась тенденция к снижению количества сегментоядерных лейкоцитов, увеличению эозинофилов и снижению моноцитов, но различия между контрольной группой животных и животными, получавшими биомассу спирулины, на фоне оксидативного стресса, оказались не достоверными.

В группе крыс, получавшей биомассу спирулины, также отмечалось достоверное снижение количества лимфоцитов на 14,59 %.

Выявлено, что шрот семян винограда достоверно увеличивает количество эритроцитов в крови на 31,11 % и концентрацию гемоглобина на 23,99 % на фоне оксидативного стресса.

В крови животных, получавших шрот семян винограда, по сравнению с результатами, полученными от животных, находящихся в состоянии оксидативного стресса, количество лейкоцитов меньше на 10,87 %, количество палочкоядерных лейкоцитов достоверно больше на 41,59 %, сегментоядерных - меньше на 17,93 %.

Отмечалась тенденция к увеличению эозинофилов и снижению количества моноцитов, но различия между контрольной группой животных и группой, получавшей шрот семян винограда, на фоне введения тетрахлорметана, оказались не достоверными.

В группе крыс, употреблявшей шрот семян винограда, отмечалось достоверное снижение количества лимфоцитов на 13,39 %.

Выявлено, что у животных, получавших смесь «ВинСпир» достоверно увеличивается количество эритроцитов в крови на 41,27 % и концентрация гемоглобина на 29,77 % на фоне оксидативного стресса.

В лейкоцитарное формуле происходили следующие изменения: смесь «ВинСпир» способствовала достоверному снижению роста лейкоцитов на 19,98 % в крови на фоне введения тетрахлорметана; количество палочкоядерных лейкоцитов достоверно увеличилось на 65,48 %, сегментоядерных - достоверно снизилось на 20,67 %. Отмечалась тенденция к увеличению эозинофилов и снижению количества моноцитов в крови, но различия между контрольной группой животных и группой, получавшей смесь «ВинСпир» на фоне введения тетрахлорметана оказались не достоверными.

В группе крыс, получавшей смесь «ВинСпир» на фоне оксидативного стресса, отмечалось достоверное снижение количества лимфоцитов на 15,53 %.

Скорость оседания эритроцитов у животных, получавших фитоантиоксиданты на фоне оксидативного стресса, изменялась незначительно.

Таким образом, по результатам экспериментов можно сделать вывод, что гепатопротекторы растительного происхождения оказывают позитивное влияние на состав крови на фоне оксидативного стресса, а смесь «ВинСпир», как комплексный гепатопротектор нормализует состав крови эффективнее своих компонентов, взятых по отдельности.

Исследование системы ПОЛ-АО печени здоровых половозрелых крыс при применении фитоантиоксидантов. Исследование влияния растительных гепатопротекторов на систему перекисного окисления липидов-антиоксидантов в тканях печени здоровых половозрелых крыс осуществляли на 40 белых лабораторных крысах-самцах массой 190-210 г. В эксперименте участвовали половозрелые крысы одного месяца рождения. Крыс содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Животные были разбиты на 4 группы, по 10 крыс в каждой (табл. 6).

Таблица 6. Группы экспериментальных животных

объекты исследования номера групп	1	2	3	4
Вода дистиллированная	+
Суспензия биомассы спирулины		+
Суспензия шрота винограда			+
Суспензии смеси «ВинСпир»				+

Фитоантиоксиданты вводили однократно в желудок с помощью зонда в виде суспензии, приготовленной на воде дистиллированной в дозе 10 мг/100 г массы животного, объемом 1 мл ежедневно в течение 36 дней. Затем крыс убивали в соответствии с этическими нормами и проводили извлечение печени. Гомогенат из печени готовился механическим измельчением ткани печени массой 1 г с 9 мл трис-буфера (рН 7,4), со скоростью 5000 об/мин в сосуде с двойными стенками, постоянно охлаждаемым проточной водой.

Оценку влияния фитоантиоксидантов на систему ПОЛ-АО печени крыс проводили по концентрации малонового диальдегида и активности ферментов: каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, аланинаминотрансфераза и аспартатаминотрансфераза, а также массе печени.

В таблице 7 приведены результаты по изучению массы печени крыс получавших фитоантиоксиданты.

Таблица 7. Масса печени крыс, получавших в течение 36 дней фитоантиоксиданты

Группа животных	Масса печени, г
Контроль	7,98±0,30
Спирулина	8,18±0,27
Шрот семян винограда	8,31±0,38
Смесь «ВинСпир»	8,11±0,43

Установлено, что введение в организм животных биомассы спирулины, шрота семян винограда и смеси «ВинСпир» не отражается на массе печени.

По результатам эксперимента, представленным в таблице 8, видно, что введение биомассы спирулины, шрота семян винограда и смеси «ВинСпир» в организм здоровых животных не сказывается на активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, а также концентрации малонового диальдегида, так как их уровни практически совпадают с показателями интактных крыс (различия не превышают 2 %).

Таблица 8. Состояние системы ПОЛ-АО крыс при 36 дневном применении фитоантиоксидантов

№ п/п	Показатель	Группы животных
		1-контроль	2-спирулина	3-шрот семян винограда	4-смесь «ВинСпир»
1	Активность АсАТ, мкмоль/с*л	0,285±0,012	0,291±0,011	0,301±0,013	0,295±0,011
2	Активность АлАТ, мкмоль/с*л	1,596±0,058	1,613±0,074	1,622±0,069	1,614±0,063
3	Активность каталазы, мкат/л	51,37±2,51	43,95±2,411	42,54±2,641	41,19±2,991
4	Активность СОД, АЕД/мг белка печени	1,308±0,057	1,215±0,053	1,159±0,0381	1,111±0,0561
5	Активность ГП,мкмоль/мин/мг белка печени	1,680±0,053	1,579±0,055	1,522±0,0441	1,505±0,0481
6	Концентрация МДА, мкмоль/л	3,95±0,15	4,02±0,17	4,16±0,19	4,11±0,18

Примечание. В этой таблице различия достоверны при P<0,05: ¹ - по сравнению с показателями контрольной группы (интактных) животных.

Установлено, что использованные нами фитосубстанции снижают активность антиоксидантных ферментов системы ПОЛ-АО и этот эффект находится в прямой зависимости от природы источника. Так, биомасса спирулины снижает активность каталазы, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы у животных, на 14,44 %, 7,11 % и 6,01 % соответственно.

Дополнительное внутрижелудочное введение шрота семян винограда также способствовало снижению активности каталазы на 17,19 %, супероксиддисмутазы - на 11.39 % и глутатионпероксидазы - на 9,4 %.

Под влиянием смеси «ВинСпир» активность каталазы снизилась на 19.81%, супероксиддисмутазы - на 15,06 %, а глутатионпероксидазы - на 10,41 % относительно интактных животных.

Сравнительное изучение системы ПОЛ-АО печени половозрелых крыс при применении фитоантиоксидантов-гепатопротекторов и в-каротина. Исследования проводили на 60 белых лабораторных крысах-самцах массой 190-210 г, разделенных на 6 групп, по 10 крыс в каждой (табл. 9).

Фитоантиоксиданты вводили однократно в желудок с помощью зонда в виде суспензии, приготовленной на воде дистиллированной (в-каротин использовали в виде масляного раствора) в дозе 10 мг/100 г массы животного, объемом 1 мл ежедневно в течение 30 дней до начала эксперимента и в течение 6 дней параллельно с введением тетрахлорметана. На седьмой день крыс убивали в соответствии с этическими нормами, затем проводили извлечение печени и оценивали те же параметры системы ПОЛ-АО печени, что и в предыдущем опыте.

Таблица 9. Группы экспериментальных животных

объекты исследования номера групп	1	2	3	4	5	6
Вода дистиллированная	+	+
CCl4		+	+	+	+	+
Суспензия биомассы спирулины			+
Суспензия шрота винограда				+
Суспензии смеси «ВинСпир»					+
Масляный раствор в-каротина						+

В табл. 10 приведены результаты изменение массы печени крыс, находящихся в состоянии оксидативного стресса, при дополнительной нагрузке внутрижелудочно фитоантиоксидантами.

Таблица 10. Масса печени крыс при использовании фитогепатопротекторов

Группа животных	Масса печени, г
Контроль	7,98±0,30
Контроль + ССl4	12,86±0,29
Спирулина + ССl4	9,95±0,371
Шрот семян винограда + ССl4	10,35±0,561
Смесь «ВинСпир» + ССl4	9,77±0,461
в-каротин+ ССl4	11,45±0,511,2

Примечание. В этой таблице различия достоверны при P<0,05: ¹ -по сравнению с показателями животных контрольной группы, получавших тетрахлорметан, ² - по сравнению с показателями животных группы, получавших композицию «ВинСпир» на фоне введения тетрахлорметана.

По результатам эксперимента видно, что в контрольной группе крыс, которой вводили тетрахлорметан, произошло увеличение массы печени относительно контроля на 61,15 %. В группе крыс, получавших суспензию биомассы спирулины на фоне оксидативного стресса, масса печени была ниже на 22,62 %, в группе, получавшей суспензию шрота семян винограда - на 19,52 %, суспензию «ВинСпир» - на 24,02 %, а в-каротин - на 43,48 % относительно контрольной группы животных, которым вводили тетрахлорметан.

Таким образом, смесь «ВинСпир», представляющая собой комплекс природных антиоксидантов, способствует снижению роста массы печени, при негативном воздействии тетрахлорметана эффективнее своих компонентов по отдельности и превосходит эффективность в-каротина на 21,05 % .

В табл. 11 приведены результаты изучения системы ПОЛ-АО в тканях опытных крыс на 7-й день после шестидневного внутримышечного введения тетрахлорметана на фоне приема фитоантиоксидантов.

По результатам эксперимента было выявлено, что активность аспартатаминотрансферазы в группе крыс, которым вводили тетрахлорметан, возросла в ? 7 раз по сравнению с показателями интактных животных. Такая же тенденция отмечалась и при изучении активности аланинаминотрансферазы, которая возросла на 43,11 % относительно интактных животных.

Активность каталазы, после введения тетрахлорметана снижается на 42,94% относительно контрольной группы, активность супероксиддисмутазы - на 46,02 %, а глутатионпероксидазы - на 38,33 %.

Таблица 11. Состояние системы ПОЛ-АО после использования фитогепатопротекторов

Показатель	Группы животных
	1-Контроль	2-Контроль + ССl4	3-Спирулина + ССl4	4--Шрот семян винограда + ССl4	5-Смесь «ВинСпир» + ССl4	6-в-каротин+ ССl4
Активность АсАТ, мкмоль/с*л	0,285±0,012	1,989±0,0671	1,439±0,0421	1,717±0,0711	1,219±0,0331	1,698±0,0541,2
Активность АлАТ, мкмоль/с*л	1,596±0,058	2,284±0,0761	1,898±0,0721	1,958±0,0701	1,799±0,0661	2,037±0,0691,2
Активность каталазы, мкат/л	51,37±2,51	29,31±1,621	39,63±1,331	36,15±1,101	43,19±1,831	37,55±1,551,2
Активность СОД, АЕД/мг белка печени	1,308±0,057	0,706±0,0231	0,997±0,0421	0,896±0,0331	1,143±0,0441	1,010±0,0391,2
Активность ГП, мкмоль/мин/мг белка печени	1,680±0,053	1,036±0,0411	1,245±0,0471	1,178±0,0511	1,331±0,0531	1,168±0,0451,2
Концентрация МДА, мкмоль/л	3,95±0,15	7,44±0,221	6,08±0,201	6,58±0,171	5,45±0,131	6,82±0,161,2

Примечание. В этой таблице различия достоверны при P<0,05: ¹ -по сравнению с показателями животных контрольной группы, получавшей тетрахлорметан, ² - по сравнению с показателями животных группы, получавшей композицию «ВинСпир» на фоне введения тетрахлорметана.

При оксидативном стрессе повышается содержание конечного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида в тканях печени. По результатам эксперимента нами было выявлено, что концентрация МДА в тканях печени возросла на 88,35 % относительно интактных животных.

Что касается растительных антиоксидантов, то они нормализуют нарушенное равновесие в системе ПОЛ-АО.

По результатам эксперимента, представленным в табл. 11, видно, что биомасса спирулины снижает активность аспартатаминотрансферазы на 27,65 % и аланинаминотрансферазы на 16,91 % в сыворотке крови на фоне введения тетрахлорметана.

Активность каталазы, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы возрастала под влиянием биомассы спирулины на фоне введения тетрахлорметана, на 35,21 %, 41,22 % и 20,17 % соответственно, относительно контрольной группы животных, находящихся в состоянии оксидативного стресса.

В группе крыс, получавшей биомассу спирулины, на фоне введения тетрахлорметана, концентрация малонового диальдегида снизилась на 18,28 % относительно контрольной группы, подвергавшейся воздействию тетрахлорметана.

Шрот семян винограда также снижает активность аспартатаминотрансферазы на 13,68 % и аланинаминотрансферазы на 14,27 % в сыворотке крови на фоне тетрахлорметана.

Также следует отметить, что шрот семян винограда, как и биомасса спирулины, способствовал росту активности каталазы, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в тканях печени, на фоне введения тетрахлорметана, в частности, активность каталазы возросла на 23,34 %, активность супероксиддисмутазы - на 26,91 %, а глутатионпероксидазы - на 13,71 %.

В группе крыс, получавшей суспензию шрота семян винограда, на фоне введения тетрахлорметана, концентрация малонового диальдегида была снижена на 11,56 %.

Выявлено, что смесь «ВинСпир» снижает активность аспартатаминотрансферазы на 38,71 % и аланинаминотрансферазы на 21,23 % в сыворотке крови на фоне тетрахлорметана, что превышает эффективность отдельных ее компонентов.

Смесь «ВинСпир», как биомасса спирулины и шрот семян винограда, но с большим эффектом, способствовала росту активности каталазы, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в тканях печени на фоне введения тетрахлорметана, в частности, активность каталазы возросла на 47,36 %, активность супероксиддисмутазы - на 61,89 %, а глутатионпероксидазы - на 28,47 %.

В группе крыс, получавшей суспензию «ВинСпир», на фоне введения тетрахлорметана, концентрация малонового диальдегида снизилась на 26,75 %.

Таким образом, фитоантиоксиданты проявляют выраженный гепатопротекторный эффект. Причем, смесь «ВинСпир», как комплексная смесь нормализует активность и концентрацию ферментов в системе ПОЛ-АО эффективнее своих компонентов по отдельности.

Так как смесь «ВинСпир» новый прпарат, было решено сравнить его эффективность с эталонным антиоксидантом-гепатопротектором в-каротином.

Результаты экспериментов, представленные в табл. 11 свидетельствуют о том, что активность аспартатаминотрансферазы в группе крыс, получавшей только тетрахлорметан, возросла в ? 7 раз относительно интактных животных, суспензию смеси «ВинСпир» на фоне введения тетрахлорметана ? в 4,3 раза, а в-каротин - в ? 6 раз.

Следовательно, смесь «ВинСпир» способствует снижению роста активности аспартатаминотрансферазы в тканях печени при воздействии тетрахлорметана на порядок эффективнее в-каротина.

Активность аланинаминотрансферазы, в группе крыс, получавшей воду дистиллированную на фоне введения тетрахлорметана, возросла на 43,11 % относительно интактных животных, в группе, получавшей помимо тетрахлорметана, суспензию «ВинСпир» - на 12,72 %, а в-каротин - 27,63 %.

Доказано, что смесь «ВинСпир» способствует снижению роста активности аланинаминотрансферазы в плазме крови при воздействии тетрахлорметана эффективнее в-каротина на 14,91 %.

При исследовании активности каталазы было выявлено, что в группе крыс, получавшей воду дистиллированную на фоне введения тетрахлорметана, наблюдалось снижение уровня активности каталазы на 42,94 % относительно контроля, в группе, получавшей, помимо тетрахлорметана, суспензию композиции «ВинСпир» - на 15,92 %, а в-каротин - на 26,90 %.

Таким образом, комплексная антиоксидантная смесь «ВинСпир» нормализует активность каталазы в тканях печени при воздействии тетрахлорметана, повышая ее уровень, эффективнее, чем в-каротин на 10,98 %.

Изучение уровня активности супероксиддисмутазы выявило, что в группе крыс, получавшей воду дистиллированную, на фоне введения тетрахлорметана, наблюдалось снижение уровня активности супероксиддисмутазы на 46,02 % относительно интактных животных, в группе, получавшей, помимо тетрахлорметана, суспензию композиции - на 12,61 %, в-каротин - на 22,78 %.

Смесь «ВинСпир» нормализует активность супероксиддисмутазы в тканях печени при воздействии тетрахлорметана, способствуя повышению ее уровня, эффективнее в-каротина на 10,17 %.

По результатам изучения активности глутатионпероксидазы было выявлено, что в группе крыс, получавшей воду дистиллированную на фоне введения тетрахлорметана, наблюдалось снижение уровня активности глутатионпероксидазы на 38,33 % относительно интактных животных, в группе, получавшей, помимо тетрахлорметана, суспензию «ВинСпир» - на 20,77 %, а в-каротин - на 30,48 %.

Таким образом, смесь «ВинСпир» нормализует активность глутатионпероксидазы в тканях печени при воздействии тетрахлорметана, существенно повышая ее, эффективнее в-каротина на 9,71 %.

Изучая уровень концентрации малонового диальдегида в тканях печени было выявлено, что в группе крыс, получавшей воду дистиллированную, на фоне введения тетрахлорметана, концентрация малонового диальдегида возросла на 88,35 % относительно интактных животных, в группе, получавшей помимо тетрахлорметана, суспензию смеси «ВинСпир» - на 37,97 %, а в-каротин - на 72,65 %.

По результатам эксперимента видно, что смесь «ВинСпир» способствует снижению роста концентрации малонового диальдегида в тканях печени при воздействии тетрахлорметана эффективнее в-каротина на 34,68 %.

Таким образом, экспериментально подтверждено, что смесь «ВинСпир» как комплексное средство на основе растительных объектов, проявляющих антиоксидантные свойства, является на ? 17 % более сильным гепатопротектором по сравнению с в-каротином.

Выводы

Научно обоснована технология и применение комплексного средства на основе биомассы спирулины и шрота семян винограда - смеси «ВинСпир», состоящей из равных частей компонентов. «ВинСпир» представляет собой порошок серо-зеленого цвета с характерным запахом водорослей, содержит 0,15±0,01 мг % в-каротина, 80,25±0,65 мг % фикоцианина и 8,27± 0,61 мг % галловой кислоты и другие биологически активные вещества, выпускается в кишечнорастворимых капсулах по 0,6 г.

Введение в организм здоровых животных шрота семян винограда биомассы спирулины и смеси «ВинСпир» сопровождается увеличением количества эритроцитов на 49,85 %, 38,55 % и 57,97 %, увеличением концентрации гемоглобина на 34,4 %, 22,0 %, и 39,5 %, увеличением количества лейкоцитов на 28,54 %, 41,67 % и 49,74 %, в том числе палочкоядерных - на 28,82 %, 24,71 % и 30,59 % соответственно группе. Количество эозинофилов, моноцитов и лимфоцитов, а также СОЭ в крови животных изменялось статистически не значимо и не выходило за пределы физиологической нормы.

Смесь «ВинСпир» и ее отдельные компоненты при внутрижелудочном введении клинически здоровым крысам не вызывают существенных изменений в системе ПОЛ-АО печени. Активность АсАТ, АлАТ и концентрация малонового диальдегида у интактных животных и животных, получавших растительные объекты практически не отличались (отклонения уровней были в пределах 2 %). Активность каталазы, СОД и ГП в группах крыс, получавших биомассу спирулины, шрот семян винограда и смесь «ВинСпир» были снижены в пределах физиологической нормы. Активность каталазы снизилась на 14,44 %, 17,19 % и 19,81 %, активность СОД - на 7,11 %, 11,39 % и 15,06 %, активность ГП - на 6,01 %, 9,4 % и 10,41 % соответственно.

Оксидативный стресс сопровождается снижением количества эритроцитов на 36,75 %, концентрации гемоглобина на 30,90 % и увеличением числа лейкоцитов на 60,95 %. В лейкоформуле наблюдается увеличение сегментоядерных нейтрофилов на 32,94 %, моноцитов - на 68,42 %, увеличение лимфоцитов на 26,05 %, снижение палочкоядерных нейтрофилов - на 49,10 % и эозинофилов - 42,93 % соответственно по сравнению с показателями интактных животных.

Введение животным биомассы спирулины на фоне оксидативного стресса, сопровождается увеличением количества эритроцитов и концентрации гемоглобина на 26,03 % и 16,21 % соответственно, снижением количества лейкоцитов на 8,65 %, в том числе, увеличением палочкоядерных нейтрофилов на 47,78 % и снижением лимфоцитов на 14,59 %. Шрот семян винограда способствует увеличению количества эритроцитов и концентрации гемоглобина на 31,11 % и 23,99 % соответственно, снижению количества лейкоцитов на 10,87 %, в том числе, увеличению палочкоядерных нейтрофилов на 41,59%, снижению сегментоядерных нейтрофилов на 17,93 % и снижению лимфоцитов на 13,39 %. На фоне введения смеси «ВинСпир» у животных наблюдается увеличение количества эритроцитов и концентрации гемоглобина на 41,27 % и 29,77 % соответственно, снижение количества лейкоцитов на 19,98 %, в том числе, увеличение палочкоядерных нейтрофилов на 65,48 %, снижение сегментоядерных нейтрофилов на 20,67 %, снижение лимфоцитов на 15,53 %.

Введение в организм смеси «ВинСпир» или ее отдельных компонентов совместно с тетрахлорметаном способствует восстановлению нарушенного оксидативным стрессом равновесия в системе ПОЛ-АО печени. Биомасса спирулины достоверно снижает активность АсАТ на 27,65 %, АлАТ - 16,91 %, повышает активность каталазы на 35,21 %, СОД - 41,22 %, ГП - 20,17% и снижает концентрацию МДА на 18,28 %. Шрот семян винограда достоверно снижает активность АсАТ на 13,68 %, АлАТ - 14,27 %, повышает активность каталазы на 23,34 %, СОД - 26,91 %, ГП - 13,71 % и снижает концентрацию МДА на 11,56 %. Смесь «ВинСпир» достоверно снижает активность АсАТ на 38,71 %, АлАТ - 21,23 %, повышает активность каталазы на 47,36 %, СОД - 61,89 %, ГП - 28,47 % и снижает концентрацию МДА на 26,75 % по сравнению с показателями животных, при нагрузке тетрахлорметаном. Гепатопротекторный эффект смеси «ВинСпир» превосходит таковой у ее отдельных компонентов.

Смесь «ВинСпир» по сравнению с в-каротином является сильным гепатопротектором. Она на порядок эффективнее в-каротина снижает активность АсАТ, на 14,91 % снижает активность АлАТ, на 10,98 % повышает активность каталазы, 10,17 %, СОД - на 9,71 %, ГП - 9,71 %, и на 34,68 % снижает концентрацию МДА у животных при нагрузке тетрахлорметаном.

Практические предложения

1. Шрот семян винограда является ценной растительной субстанцией, способной обеспечивать организм важными макро- и микроэлементами и биологически активными веществами, которые положительно влияют на морфологический состав крови и функции печени животных. Поэтому шрот семян винограда следует шире внедрять в схему кормления домашних животных (собак, кошек и других декоративных животных).

2. Смесь «ВинСпир» является эффективным гепатопротектором и ее следует применять как лечебное средство при гипофункции печени.

3. Более детальное изучение биологических и лечебных свойств биомассы спирулины и шрота семян винограда позволит создать конкурентоспособные гепатопротекторные лечебные средства.

4. Разработаны технические условия и технические инструкции для производства смеси «ВинСпир».

5. Результаты исследований внедрены в учебный процесс при подготовке и переподготовке специалистов в Поволжской государственной социально-гуманитарной академии в г. Самара и Ульяновском государственном университете в г. Ульяновск.

6. Технологические решения по производству смеси «ВинСпир» и методы контроля качественного и количественного состава внедрены на предприятиях ООО «Эмульсионные технологии» и ООО НПФ «ХимПром» г. Самара.

Список публикаций по теме диссертации

Павлова, О.Н. Классификация биологически активных добавок к пище и их применение в медицине и лечебном питании // Дни студенческой науки: сб. материалов 34 научной конференции студентов и аспирантов. Самарская государственная академия путей сообщения. - Выпуск 8. - Самара, 2007. - С. 108.

Желонкин, Н.Н. Определение микробиологических параметров ...