Повышение эффективности изготовления и использования сывороток-реагентов для типирования групп крови лошадей

Проведенный анализ показал, что, даже при соблюдении требования минимальных различий между донором и реципиентом по антигенам групп крови при составлении подбора, можно получить сложную поливалентную сыворотку, включающую антитела на нужный антиген, но в дальнейшем «очистить» ее до моноспецифического состояния практически невозможно. Приведенные в таблице 3 варианты нерациональных подборов демонстрируют генотипические характеристики лошадей-доноров, которых нецелесообразно использовать для получения сывороток-реагентов в связи имеющимися группами сцепления и необходимостью многоэтапной адсорбции. Важно отметить, что моноспецифическую сыворотку анти-Dm получить очень сложно, даже используя дальнейшую адсорбцию.

Учитывая, что каждый этап адсорбции снижает титр получаемой сыворотки, при составлении плана иммунизации продуцентов необходимо не только подбирать пары с минимальными различиями в наличии эритроцитарных антигенов, но и учитывать возможность последующей адсорбции лишних антител.

Апробация разработанной аналитической модели подборов доноров к реципиентам была проведена на 15 серийных иммунизациях лошадей, что позволило получить 11 сывороток и в целом повысить эффективность иммунизаций до 73%.

Влияние иммунизаций на содержание общего белка и иммуноглобулинов в сыворотке крови лошадей.

Практическая работа по получению сывороток-реагентов значительно усложняется потому, что 75-80% иммунизированных лошадей остается ареактивными. Известно, что иммунореактивность лошадей - продуцентов зависит от большого ряда факторов: возраста, физиологического состояния, типа нервной системы, времени года и т.д. (Дубровская Р.М., 1987; Потапова Д.В. 1989; Мемедейкин В.В., 1997). Поэтому при производстве сывороток-реагентов важно заранее прогнозировать иммунореактивность лошадей-продуцентов и оценивать результативность проводимой иммунизации.

При мониторинге содержания общего белка в сыворотке крови лошадей до начала и в процессе иммунизации не было установлено существенных изменений этого показателя в зависимости иммунореактивности продуцентов (Рис. 2). В то же время отмечена тенденция увеличения содержания общего белка в крови лошадей-продуцентов, давших сыворотку с высоким титром антител (1:16-1:32) уже после первого внутримышечного введения крови доноров реципиентам, т.е. на начальном этапе проведения иммунизации.

Несколько иная динамика колебаний общего количества белка наблюдалась у лошадей-реципиентов, давших сыворотку с невысоким титром антител (1:8), что может быть связано со спецификой антигенной активности эритроцитарных факторов.

После 4-й серийной иммунизации, к моменту взятия крови у лошадей-продуцентов в большом объеме, самое высокое содержание общего белка было отмечено у лошадей, давших сыворотку с высоким титром антител к эритроцитарным антигенам, тогда как у ареактивных доноров его уровень был даже ниже начального.

Рис. 2. Динамика содержания общего белка в сыворотке крови лошадей-продуцентов в процессе иммунизации

Более информативные результаты были получены при изучении динамики общего содержания иммуноглобулинов у лошадей-продуцентов (таблица 4).

Таблица 4. Динамика содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови реактивных и ареактивных лошадей-доноров при иммунизации

Примечание. Достоверность различий: *Р >0,95;**Р >0,99;***Р >0,999.

У лошадей-доноров, не выработавших эритроцитарных антител, общее содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови до иммунизации и во время нее было достоверно ниже и не подвергалось значительным колебаниями. Напротив, у двух групп реактивных доноров, общее содержание иммунных белков было достоверно выше еще до начала иммунизации и постепенно возрастало в процессе иммунизации.

Рис. 3. Динамика содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови продуцентов при иммунизациях лошадей

Полученные данные свидетельствуют, что показатель содержания общего количества иммуноглобулинов в сыворотке крови может служить в качестве критерия иммунореактивности лошадей-продуцентов и эффективности проводимой иммунизации.

Анализ связи эритроцитарного антигена Dc с заболеваемостью жеребят неонатальным изоэритролизисом

У 1-2% жеребят разных пород встречается заболевание неонатальным изоэритролизом, которое может быть обусловлено несовместимостью родительских пар по эритроцитарным антигенам Qa, а также, возможно, Aа, Ca, Dc и Pa. Для проверки гипотезы о связи широко распространенного антигена Dc с гемолитической болезнью новорожденных жеребят была проанализирована заводская карьера кобыл чистокровной верховой и арабской пород, имевших пять и более «несовместимых» жеребостей по этому антигену.

Показатели зажеребляемости, благополучной выжеребки и делового выхода жеребят у кобыл арабской чистокровной породы с «проблемными» подборами менялись волнообразно, достигая максимальных значений при 11 и 12 «несовместимых» жеребостях. Доля слабо- и мертворожденных жеребят колебалась в интервале от 10 до 36%, с максимальными значениями на пятую и восьмую жеребости (рис. 4). При этом многие кобылы выкармливали здоровых жеребят, унаследовавших отцовский антиген Dc, и после девяти «несовместимых» жеребостей.

Рис. 4. Динамика показателей воспроизводства кобыл арабской породы при несовместимости родительских пар по антигену Dc.

У маток чистокровной верховой породы, давших «несовместимых» жеребят по антигену Dc, была отмечена сходная динамика репродуктивных показателей. Более того, максимальные уровни зажеребляемости, благополучной выжеребки и делового выхода жеребят наблюдались после 9-11 «проблемных» жеребостей, при этом число слабо- и мертворожденных жеребят явно имело тенденцию к снижению.

Проведенный анализ основных показателей воспроизводства кобыл чистокровной верховой и арабской пород. имевших многочисленные «несовместимые» жеребости по эритроцитарному антигену Dc, не подтверждает его связи с возникновением иммуногенетической несовместимости у новорожденных жеребят.

Оптимизация параметров планшетного микрометода при типировании групп крови.

С целью апробации планшетного микрометода при типировании групп крови лошадей была разработана оценочная бальная шкала проявления агглютинации в лунках планшета с учетом таких факторов, как дисперсность агглютината, его конфигурация, яркость окраски и форма ободка. Для определения оптимальных параметров реакции агглютинации в планшете при определении групп крови лошадей проведен ряд серийных опытов.

В отличие от постановки реакций в серологических пробирках, наиболее четко выраженная крупнозернистая агглютинация эритроцитов в лунках планшета была отмечена при концентрации суспензии 1,5% и времени инкубации 1 час. Суспензия с 0,5% концентрацией имела очень бледную окраску, что затрудняло чтение результатов реакции, также как и 2,5% взвесь с излишне интенсивной окраской. Инкубация в термостате в течение 30 и 40 минут было явно недостаточной для полного проявления агглютинации эритроцитов с антителами сыворотки, а прочтение результатов через 1,5 и 3 часа несколько затрудняло дифференциацию бахромчатости краев по причине высыхания взвеси в лунках планшета.

Оптимальная концентрация суспензии эритроцитов для микрометода на планшете составляет 1,5%, время инкубации 1 час.

Экономическая эффективность результатов исследований.

Изготовление сывороток-реагентов - это длительный производственный процесс, связанный с содержанием большой группы лошадей - продуцентов. Основной статьей расхода при получении реагентов являются затраты на донорское поголовье, в том числе на приобретение и содержание животных. Поэтому очень важно иметь такое поголовье продуцентов, которое отвечает потребностям лаборатория по генотипам и иммунореактивности.

Расчет экономической эффективности использования аналитической схемы подборов пар доноров к реципиентам при составлении плана иммунизаций показал, что при этом методе один рубль затрат на производство сывороток позволяет получить 85 коп. прибыли, что является хорошим показателем эффективности.

Результаты внедрения микрометода наглядно представлены в таблице 5. Благодаря внедрению микрометода расход дефицитных сывороток-реагентов сократился в 3 раза, существенно снизились затраты рабочего времени и прочие расходы. При этом значительно повысилась чувствительность метода, а срок хранения проб крови увеличился в 1,5 раза.

В настоящее время лаборатория полностью перешла на планшетный микрометод, что позволило существенно сэкономить имеющиеся запасы сывороток-реагентов.

Таблица 5. Сравнительная оценка эффективности методов определения групп крови лошадей

Производственная проверка показала высокую эффективность системного подхода при использовании аналитической модели. Для 15 апробированных подборов результативность составила 73% , т е было получено 11 сывороток из 15 возможных.

Заключение

реагент лошадь иммуноглобулин донор

ВЫВОДЫ:

1. Результативность получения сывороток-реагентов для определения групп крови лошадей в значительной степени определяется планом иммунизации, который должен составляться с учетом генотипических различий доноров и реципиентов, а также возможности последующей адсорбции полученной сыворотки.

2. Большинство аллелей групп крови лошадей включают группы сцепленных антигенов, что необходимо учитывать как при подборах донорских пар, так и при адсорбции «сырых» сывороток.

3. При контроле содержания общего белка в сыворотке крови лошадей в процессе иммунизации не было выявлено четко выраженной зависимости иммунореактивности продуцентов от этого показателя.

4. Установлена достоверная связь между содержанием иммуноглобулинов в сыворотке крови лошадей и их иммунореактивностью. Реактивные лошади-продуценты с высоким титром антител имели достоверно более высокий уровень общего количества иммуноглобулинов еще до иммунизации, который постепенно увеличивался после каждой инъекции крови донора.

5. Анализ показателей воспроизводства кобыл арабской и чистокровной верховых пород, имевших несовместимые жеребости по антигену Dc, не подтвердил связи гемолитической болезни жеребят с этим фактором.

6. В результате проведенных исследований отработаны оптимальные параметры проведения планшетного микрометода: концентрация взвеси эритроцитов должна составлять 1,5%, количество взвеси эритроцитов и сыворотки-реагента 0,25-0,30µл, время инкубации 1 час.

7. Использование микрометода позволяет снизить расход сывороток-реагентов и затраты рабочего времени в 3 раза, а также продолжительность анализа с четырех до одного часа. Планшетный микрометод типирования групп крови можно использовать как в лабораторных, так и в полевых условиях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ:

1. При получении сывороток - реагентов для типирования групп крови лошадей подбор пар «донор-реципиент» следует проводить с учетом групп сцепления и в соответствии с рекомендованной схемой, что позволит избежать получения проблемных сывороток.

2. Для успешной работы необходимо комплектовать донорский табун лошадьми со следующими генотипами Аa, Аadf, Аbc, Аce, Аbce; Dadlnr, Dadlr, Ddlnqr, Dbcm, Ddghm, Dcgm, Ddeloq, Ddek, Ddkl, Dcegimn, Cа, Kа, Uа, Pa, Pb, Qac, Qc, Qabc, Qb.

3. Отбор лошадей-продуцентов проводить с учетом высокого содержания иммуноглобулинов на уровне 11 мг/мл и выше.

4. Иммуногенетическим лабораториям целесообразно полностью перейти на типирование групп крови лошадей планшетным микрометодом, который позволяет существенно экономить сыворотки-реагенты и затраты рабочего времени персонала, а также может быть использован как в лабораторных, так и в полевых условиях.

Литература

1. Зайцев А.М., Мелентьева Н.М. Характеристика генетической структуры кузнецкой породы лошадей по эритроцитарным антигенам и полиморфным системам белков и ферментов крови// Материалы науч. сессии РСХА «Стратегия развития животноводства -21 век» и координационного совещания по научно-исследовательской работе в коневодстве. - Дивово, 2001.-С.70-72.

2. Мелентьева Н.М. Повышение эффективности изготовления и использования сывороток-реагентов для типирования групп крови лошадей// Сб.науч.тр. -Дивово, 2007. -С.107-111.

3. Мелентьева Н.М. Связь систем групп крови с заболеваемостью жеребят неонатальным изоэритролизисом// Журнал «Коневодство и конный спорт», 2007.- № 4. -С. 21-22.

4. Методические рекомендации по производству и использованию сывороток-реагентов для типирования групп крови лошадей// ВНИИК - 2005/ Храброва Л.А., Дубровская Р.М., Потапова Д.В, Мелентьева Н.М, Орехова Т.М.

5. Мелентьева Н.М., Храброва Л.А. Генетическая детерминация гемолитической болезни жеребят// Науч. основы сохранения и совершенствования пород лошадей. - Дивово, 2003. -С. 74-80.

6. Мелентьева Н.М., Храброва Л.А. Технологические аспекты микрометода определения групп крови лошадей// Итоги исследований по коневодству в первом году 21 века. - Дивово, 2002. - С.38-40

7. Мелентьева Н.М., Храброва Л.А. Усовершенствование методики получения сывороток-реагентов для открытых систем групп крови у лошадей// Проблемы сохранения генофонда, повышения племенных и продуктивных качеств заводских и местных пород лошадей: Тезисы. - Дивово, 2003. -С.41-44.

8. Мелентьева Н.М., Храброва Л.А., Матвиенко А.П. Оценка экономической эффективности применяемых методов изготовления и использования сывороток-реагентов для типирования групп крови лошадей// Сб.науч.тр. -Дивово, 2007. -С.103-106.

9. Угадчиков С.Т., Мелентьева Н.М., Цуцков В.В. Влияние минерально-витаминно-аминокислотного премикса на иммунореак-тивность лошадей-доноров//Материалы науч. сессии РСХА «Стратегия развития животноводства - 21 век» и координационного совещания по научно-исследовательской работе в коневодстве. - Дивово, 2001. С.93-94.

10. Храброва Л.А., Мелентьева Н.М. Гемолитическая болезнь новорожденных жеребят: диагностика и профилактика// Материалы 2-ой научно-практической конференции по болезням лошадей. - М., 2001. - С. 98-99.

11. Храброва Л.А., Мелентьева Н.М. Гемолитическая болезнь новорожденных жеребят: диагностика, профилактика// Материалы научной сессии РСХА «Стратегия развития животноводства - 21 век» и координационного совещания по научно-исследовательской работе в коневодстве. - Дивово, 2001. - С.68-70.

Размещено на Allbest.ru