Адаптация методики микросателлитного анализа для изучения генетического разнообразия сортов винограда Пино белый, Рислинг и их клонов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кубанский государственный аграрный университет

Адаптация методики микросателлитного анализа для изучения генетического разнообразия сортов винограда Пино белый, Рислинг и их клонов

Звягин А.С., Трошин Л.П., Мухина Ж.М., Супрун И.И.

Краснодар

Выведение новых сортов сельскохозяйственных культур основано на использовании природного или созданного человеком генетического разнообразия. Для обнаружения, оценки и охраны этого разнообразия, отбора растений, несущих хозяйственно ценные признаки, и отслеживания этих признаков в процессе селекции используют легко распознаваемые фенотипические проявления генов - маркеры.

Издавна применяемые в этих целях морфологические и биохимические маркерные признаки указывают на особенности формы, окраски или биохимического состава растения. Число их не так уж и велико, к тому же полигенная структура многих признаков строения и состава растений ограничивает возможности генетического картирования агрономически важных генов и контроля над переносом этих генов в новые формы растений.

Развитие методов молекулярной биологии, в частности, таких как рестрикционный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР) - амплификация ДНК, сиквенс ДНК - определение последовательности ДНК - привело к появлению нового класса молекулярно-генетических маркеров -- фрагментов ДНК, соответствующих нуклеотидным последовательностям, входящих непосредственно в структуру агрономически важного гена или сцепленного с этим геном. Высокая степень полиморфизма, характеризующая один из видов молекулярных маркеров - микросателитные последовательности (SSRs) - микросателитные ДНК-маркеры, позволяет использовать их при изучении генетического разнообразия виноградных клонов и сортов.

Целью работы являлся анализ генетического разнообразия сортов и их клонов винограда с использованием полиморфизма микросателлитных ДНК-маркеров.

Для проведения исследований были использованы генотипы винограда из коллекции учхоза «Кубань» КГАУ: сорт Пино белый и клон Пино белый Стадорнова, сорт Рислинг и клон Рислинг анапский.

Для выделения ДНК использовали бесхлорофилльные листья, получаемые путем проращивания черенков в камерах с водой в темноте, при температуре 25-27 ⁰С.

Экстракцию ДНК проводили, используя три методики:

1) CTAB-метод (Doyle & Doyle, 1987);

2) экстракция ДНК с использованием сорбента SiO₂;

3) CTAB-метод, модифицированный для винограда (Doyle & Doyle, 1990) - эта методика была модифицирована за счет использования NaCl для удаления полисахаридов и PVP (Polyvinylpyrrolidone) - для удаления полифенолов по следующей схеме.

Литья растирали в жидком азоте до состояния светло-зеленой пудры, которую затем вносили в микропробирки, с прогретым до 60 °С 2*СТАВ буфером, содержащим 2% СТАВ (цетилтриметиламмоний бромид), 1,4 М хлористого натрия, 0,1 М Трис-гидрохлорид, 20мМ ЭДТА (этилендиаминотетраацетат). При этом соблюдали соотношение 500 мкл буфера на 0,1 г ткани. Образцы инкубировали 1 ч при 60 °С, после чего вносили равный объем хлороформа при перемешивании в течение 20 мин. На следующем этапе образцы центрифугировали 10 минут при 8 тыс.об. мин., отбирали супернатант и добавляли к нему 0,2 V 5*СТАВ буфера, содержащего 5% СТАВ и 350 мМ ЭДТА, и инкубировали 20 минут при 60 °С.

После инкубации в пробирки с образцами вносили равный объем хлороформа и инкубировали при перемешивании 20 минут, центрифугировали 10 минут при 5 тыс.об. мин., отбирали верхнюю фазу, в чистую пробирку добавляли равный объем буфера для преципитации (1% СТАВ, 50мМ Трис-НС1, ЭДТА) и оставляли на ночь при комнатной температуре.

После преципитации ДНК осадок растворяли в 500 мкл солевого буфера (1 М NaС1, 10мМ Трис-НС1, 1мМ ЭДТА), добавляли 1 мл этилового спирта (96 %) и ставили в -20 °С на 2-3 ч. По истечении этого времени центрифугировали образцы 10 минут при 13 тыс.об.мин., после чего осадок промывали 70 % этиловым спиртом, высушивали и растворяли в 50 мкл ТЕ (ТРИС-ЭДТА 1м).

Концентрацию выделенной ДНК определяли спектрофотометрическим по стандартной методике (Маниатис и др., 1984), а также методом разведений полученных препаратов с последующим их электрофорезом в 2% агарозном геле, содержащем 1мкг/мл бромистого этидия и визуализацией в ультрафиолете. При этом исходили из того, что порог чувствительности бромистого этидия в агарозных гелях составляет 10 нг ДНК (Остерман Л.А., 1981).

Для анализа генетического разнообразия клонов коллекции были использованы 6 нейтральных микросателлитных маркеров: VRZAG79, VVMD5, VVMD7 (Bowers and Meredith, 1997), VRZAG62 и VVS2 (Thomas and Scott, 1993).

Праймерные пары, фланкирующие указанные микросателлитные локусы, были синтезированы фирмой ЗАО «Синтол», Россия.

В ходе исследования для всех маркеров были использованы одинаковые условия ПЦР, позволяющие получить максимальное количество продукта реакции. Наряду с этим при таких условиях реакции возможен повышенный выход неспецифически-амплифицированных фрагментов, однако для определения наличия-отсутствия разницы в размерах продуктов реакции, а не ее величины, это не является серьезной помехой.

Ниже приведены параметры ПЦР, использованные в данном эксперименте: 9 минут при 94 ^оС - начальная денатурация, следующих 35 циклов:

30 секунд денатурация при 94 ^оС,

1 минута отжиг праймеров при 55 ^оС,

2 минуты синтез при 72 ^оС;

последний цикл синтеза 5 минут при 72 ^oС.

Изначально температура отжига праймеров была рассчитана по формуле: Т= 4 °С х (С + G) + 2 °С Х(А + Т)-3, где G, С, А, Т - количество гуанидиновых, цитозиновых, адениновых и тиминовых оснований, соответственно. В дальнейшем эмпирически подобрали оптимальную температуру для каждой праймерной пары путем уменьшения или увеличения ее, в зависимости от качества получаемого ПЦР-продукта.

ПЦР-смесь включала: вода для ПЦР - 11,5 мкл, буфер - 2,5, dNTP (дезокситуклеотидтрифосфатов) - 3 мкл, 3 мкл ДНК, 2 мкл каждого праймера, 1 мкл Таq-полимеразы, в общем объеме 25 мкл.

Амплификация была проведена в амплификаторе Терцик МС-2, производства НПО «ДНК-технологии», Россия.

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали 8%-ный акриламидный гель на основе 1 х Трис-боратного буфера (0,09 М Трис, 0,09 М борной кислоты, 2мМ ЭДТА, рН=8,2). Полимеризацию геля проводили при комнатной температуре в течение 1 ч. В качестве катализаторов полимеризации использовали ТЕМЕД и аммония персульфат из расчета 40 мкл ТЕМЕДа (100 % раствор) и 350 мкл аммония персульфата 10%-ного на 40 мл раствора геля. микросателлитный виноград пино

После окончания полимеризации лунки геля промывали электродным буфером (1^хТрис-боратный буфер) и проводили предварительный электрофорез без внесенных образцов, для удаления из геля остатков катализаторов и незаполимеризовавшегося акриламида, при напряжении 150У, в течение 1 ч. После чего вносили в лунки геля по 10 мкл продуктов амплификации в неденатурирующем буфере нанесения (40 % сахароза, 0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксиленцианол) , при этом соблюдали соотношение: продукты ПЦР/буфер нанесения = 5/1.

Электрофорез проводили при напряжении 250V в течение 3 ч. В работе был использован аппарат вертикального электрофореза VE-3 фирмы Хеликон. После электрофореза гелевые пластины помещали на 30 минут в раствор бромистого этидия 5мкг/мл и фотографировали в ультрафиолете.

Идентификацию и определение размеров аллелей микросателлитных локусов проводили с использованием программы Gel-Рго Ana1уzег 3.1.

Анализ данных показал, что генотипы сортогруппы Пино заметно различались по исследованным маркерам: по VVMD5 размер аллелей у сорта Пино белый составил 276 пар нуклеотидов (пн), у клона Пино белый Стадорнова - 258 пн; по маркеру VVMD7 - у Пино белого 248 пн, а у Пино белого Стадорнова 254 пн; по маркеру VVMD27 - соответственно по Пино белому 185 пн, а у Пино белого Стадорнова 197 пн. У образцов сортогруппы Рислинг по маркеру VRZAG79: у сорта - 247 пн, у клона Рислинг анапский - 251 пн (таблица).

ДНК-фингерпринт клонов винограда

Это свидетельствует о наличии полиморфизма исследуемых популяций - клоны различаются по данным микросателлитным локусам и потому их обоснованно можно передавать как высокопродуктивные мутанты на госиспытания.

Вывод

Уровень полиморфизма, выявленный в результате данного исследования, позволяет говорить о перспективности использования микросателитных ДНК-маркеров для паспортизации генотипов винограда, созданных клоновой селекцией.

Опубликовано в сборнике «Новации и эффективность производственных процессов в виноградарстве и виноделии». - Т. II. Виноградарство. - Краснодар, 2005. - С. 113-117.

Размещено на Allbest.ru