Анализ фенофонда винограда методами биохимической генетики

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Необходимость изучения генетических характеристик винограда по молекулярным маркерам вызвана большим количеством сортов, таксономическая номенклатура которых до сих пор не упорядочена, наличием огромного количества сортов-синонимов, стремлением поддерживать генетическую чистоту ампелографических коллекций сортов и видов винограда. Традиционно характеристики видов, сортов, селекционных форм и клонов изучаются по ампелографическим показателям, рекомендованным МОВВ и включающим более 120 внешних морфологических признаков, биологических свойств и агрохозяйственных показателей. В настоящее время, особенно в виноградарских отраслях СНГ, используются биохимические характеристики сортов по содержанию белков, сахаров, титруемых кислот, витаминов, липидов, фенолов и др. Однако на проявление всех этих признаков, как правило, существенное влияние оказывают условия среды, а одним из трех основных требований к признакам, используемым для идентификации и оценки генотипов возделываемых растений, является их стабильность.

Частично недостатки традиционных методов оценки генотипов компенсируются использованием комплекса ампелографических признаков [1, 2]. Однако, наиболее эффективно идентификацию и оценку генотипов видов и сортов винограда, а также многие другие проблемы ампелографии и селекции можно решить на основе принципов молекулярного маркирования генетических систем винограда с использованием методов молекулярной и биохимической генетики. По мнению большинства исследователей, проблема идентификации видов и сортов винограда останется неразрешенной до тех пор, пока не будут применены молекулярно-генетические критерии. При этом наиболее удобен и доступен электрофорез полиморфных белков в полиакриламидном геле. Это направление развивается в ИВиВ "Магарач" с 1986 г. совместно с Институтом общей генетики РАН.

В предлагаемой статье представлены результаты идентификации примесных образцов в коллекции видов винограда, а также анализ гетерогенности клонов классических технических сортов методами биохимической генетики.

Для оценки чистоты коллекционных видов винограда были проанализированы 17 таксономических единиц подрода Euvitis Planch. рода Vitis (Tournef.) L. по спектрам 5 ферментных систем и по 8 полиморфным локусам, контролирующим эти ферменты (табл. 1): 6PGD1, 6PGD2 -6-фосфоглюконатдегидрогеназа 1,2; GPI2 - глюкозофосфатизомераза 2; SOD1, SOD2, SOD3 - супероксиддисмутаза 1,2,3; IDH - изоцитратдегидрогеназа; LAP - лейцинаминопептидаза.

Таблица 1. Фенотипы изученных видов рода Vitis (Tournef.) L. коллекции ИВиВ «Магарач» по спектрам изоферментов

Примечание: ам - виды американской группы,

в-аз - виды восточно-азиатской группы,

е-аз - виды евразиатской группы,

* - виды v. labrusca L. и v. vinifera L. представлены фенотипами их сортов.

При этом в предлагаемой статье фенотипы видов по спектрам ферментов 6PGD и SOD определены соответственно по двум (6Pgd1, 6Pgd2 ) и трем (Sod1, Sod2, Sod3) локусам, т.е. включают спектры ферментов 6PGD1, 6PGD2 и соответственно SOD1, SOD2, SOD3.

Подрод Euvitis Planch. рода Vitis (Tournef.) L. включает как культурный подвид, так и дикорастущие виды. Изученные в работе виды винограда относятся, согласно таксономическим данным, к трем группам: американской, восточно-азиатской (V. kasmpferi Koch., V. amurensis Rupr.) и евразиатской (подвиды V. vinifera ssp. silvestris Gmel. и V. vinifera ssp. sativa D.C.). По данным ампелографии, вид V. vulpina L. является синонимом V. riparia Mich., однако на магарачской коллекции они представлены как два самостоятельных вида, поэтому образцы этих обоих видов и были включены в анализ.

В качестве анализируемых образцов использована ткань листа, находящегося в стадии морфологической стабилизации, показывающего свежую зелень без признаков патологии. Электрофоретический анализ смеси белков, полученных из ткани листа, проведен в вертикальных блоках полиакриламидного геля в приборе конструкции Труввелера и Нефедова в трис-ЭДТА-боратной буферной системе [3].

Сущность метода электрофореза белков заключается в следующем. Смесь белков, полученная в результате экстракции из любой ткани (лист, пыльца, ягода и т.д.) вносится в буферный раствор. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом. Основным источником заряда являются аминокислоты. Под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода. Такое явление носит название электрофореза. В зависимости от величины заряда и размеров макромолекулы приобретают разные скорости. Постепенно исходный препарат разделяется на молекулы, мигрирующие с одинаковой скоростью. После разделения белков проводится их фиксация и специфическое окрашивание. В результате получается спектр полос - множественные молекулярные формы белков или ферментов (рис. 1).

генетический виноград ампелографический

Рис. 1. Электрофоретические спектры ферментов видов винограда и аллельные спектры локусов, контролирующих эти ферменты: А - наблюдаемые фенотипы (табл. 1), В - аллельное состояние изученных локусов

Генетически возникновение множественности ферментов может быть обусловлено как множественностью генных локусов, так и множественностью аллелей одного гена. Следовательно, полученные спектры несут информацию о генотипах изучаемых образцов. В работе использованы стандартные методы биометрии.

Результаты идентификации генотипов различных форм винограда (с помощью методов биохимической и молекулярной генетики) являются основой для оценки генетической чистоты ампелографической коллекции. В связи с этим, наша задача заключалась в следующем: на основе полученных данных об изоферментных спектрах и аллельном составе локусов, их кодирующих, изучить дифференциацию видов рода Vitis (Tournef.) L. и как следствие - идентифицировать возможную подмесь.

По результатам анализа полученных спектров изоферментов идентифицированы генотипы видов выборки по 8 локусам (см. рис. 1). Каждому из них присвоено соответствующее обозначение фенотипа (A, B, S, C, L). Фенотипы и генотипы по 5 указанным ферментам и их контролирующим локусам оказались уникальными, т.е. ни один из выявленных как фенотипов, так и генотипов не повторялся у другого вида данной выборки (см. табл. 1). Для изучения генетической изменчивости видов рода Vitis (Tournef.) L., соответственно степени их генетического различия/сходства, на основе полученных результатов электрофоретического анализа ферментов, была построена матрица расстояний по Нею, анализ которой проведен методом кластеризации UPGMA.

Дифференциация рода Vitis (Tournef.) L. по результатам кластерного анализа в целом соответствует существующей классификации (рис. 2). Диапазон оценок генетических расстояний между видами достаточно велик: 0.23-0.80.

Рис. 2. Дифференциация таксонов винограда, построенная на основе анализа матриц генетических расстояний, виды, классификационные признаки которых не соответствуют описаниям

На рис. 2 приведены результаты анализа дифференциации рода Vitis (Tournef.) L. Как и следовало ожидать, наибольшее генетическое расстояние, следовательно, и наиболее четкие различия установлены между видами разных групп. Так, разновидности вида V. amurensis Rupr., представляющие генетически близкую группу, на дендрограмме образуют четкий подкластер "G". Подкластер "D" представлен видами американского происхождения, в основном из южной и юго-восточной части США. Виды восточной части США объединились во второй кластер.

В результате проведенного анализа дифференциации видов рода Vitis (Tournef.) L. установлено, что образцы, которые числятся в каталоге коллекции как восточно-азиатские виды V. kasmpferi Koch. и одна из форм V. аmurensis Rupr., по результатам кластерного анализа вошли в группу видов американского, а не восточно-азиатского, происхождения. Аналогичные данные получены и для образца, представленного в коллекции как подвид V. vinifera ssp. silvestris Gmel.

По данным ампелографии, виды V. vulpina L. и V. riparia Mich.- синонимы, анализ имеющихся в коллекции образцов обнаружил генетическое различие между ними (0.60). Кроме того, для образца, представленного на коллекции как вид V. vulpina L., относящийся по классификации Бейли к секции Vulpine, установлено наибольшее генетическое расстояние с остальными видами, входящими в эту секцию. Последующий анализ образцов, представленных на ампелографической коллекции как виды V. vulpina L., V. riparia Mich., V. kasmpferia Koch., V. silvestris Gmel. и одна из форм V. amurensis Rupr., по сумме признаков (спектры изоферментов и классические ампелографические признаки), позволил установить, что анализируемые растения представляют завезенные при закладке коллекции филлоксероустойчивые подвои для европейских сортов. Поскольку в качестве подвоев использовались виды американской группы или их гибриды, идентификация их генотипов в кластере американской группы видов вполне логична.

Формы культивируемого подвида V. vinifera sativa D.C. по результатам анализа изоферментных спектров идентифицированы в одном кластере с разновидностями V. amurensis Rupr., что соответствует гипотезе А.М. Негруля о филогенетической близости евразиатского и восточно-азиатского видов.

Таким образом, дифференциация рода Vitis (Tournef.) L., полученная с использованием методов биохимической генетики, соответствует принятой классификации изученных видов. Анализ дифференциации видов подрода Euvitis Planch. рода Vitis (Tournef.) L. по спектрам изоферментов позволил идентифицировать подмесные образцы в коллекции видов.

Вопросы идентификации генотипов винограда не менее важны и в процессе клоновой селекции. Чрезвычайно сложно дифференцировать генотипы, являющимися ренетами и модификантами в популяции сорта, фенотип которого изменчив в зависимости от результатов взаимодействия генотип-среда. При этом ставится задача выявления генотипических вариаций среди массы фенотипически близких высокопродуктивных растений [4].

Нами проведены методами биохимической генетики исследования гетерогенности популяций и выявление клонов у классических технических сортов Алиготе, Бастардо магарачский, Каберне-Совиньон, Кокур белый, Мускат белый, Пино черный, серый и белый, Рислинг, Ркацители, Серсиаль, Шардоне, Траминер розовый и др. Клоны были проанализированы по следующим ферментам: глюкозафосфатизомераза (GPI), изоцитратдегидрогеназа (IDH), глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа (G-6-DH, CD), глутоматоксалаттрансаминаза (GOT), супероксиддисмутаза (SOD), аконитаза (ACON).

В результате установлено, что, например, из 14 клонов сорта Мускат белый 8 - оказались идентичными по спектрам всех ферментов как между собой, так и с базовым сортом; 5 идентичных между собой клонов отличались по спектрам фермента ACON от базового сорта и от предыдущих 8; и один клон выделялся по спектрам ACON и IDH как от базового сорта, так и от всех остальных.

По электрофоретическим профилям изоферментов ACON и IDH подтверждена гетерогенность насаждений и остальных сортов, что также послужило основанием для отбора высокопродуктивных клонов, часть из которых передана на государственные испытания Украины (Мускат Магарача / Мускат белый клон 20-11-1а // Заявка № 97073015, код 23769; Мускат Массандры / Мускат белый клон 2-14-1 // Заявка № 97073014, код 23768; Серсиаль Массандры / Серсиаль клон 7-11-П // Заявка № 97073013, код 23767; Серсиаль Магарача / Серсиаль клон 7-10 - 4 // Заявка № 97073016, код 23770).

Развернуты также исследования по маркированию генотипов клонов различных сортов на основе метода анализа их ДНК. Полученые данные, свидетельствующие об уникальности генотипов, у ряда ранее отобранных высокопродуктивных клонов. Все тестированные ценные клоны размножаются в Крыму и на Кубани.

Литература

1. Трошин Л.П., Рисованная В.И., Полулях А.И. Ампелографические признаки в изучении таксономических отношений сортов Vitis vinifera sativa pontica Negr. // Труды Научного центра виноградарства и виноделия. - Ялта, 1999. - С. 10-12.

2. Трошин Л.П., Полулях А.А., Рисованная В.И. Оценка таксономических отношений сортов V.v.s.p. balcanica Negr. и V.v.s.p. meridionali-balcanica Trosh. по морфометрическим признакам листа // Виноград и вино России. - 1998. - N 3. - C. 41-42.

3. Идентификация видов, сортов и клонов винограда по белкам как маркерам генов: (Методические указания) / В.И. Клочнева, Л.П.Трошин, А.В. Шурхал и др.; ВАСХНИЛ. - М., 1990. - 35 с.

4. Трошин Л.П. Ампелография и селекция винограда. - Краснодар: РИЦ «Вольные мастера», 1999. - 138 с.: цв. вкладка.

Размещено на Allbest.ru