Для углубления биологических знаний и повышения эффективности селекционных программ принципиальное значение имеет выбор генетических маркеров. У сельскохозяйственных растений, в том числе и винограда, чрезвычайно сложно выделить морфологические признаки, которые могут служить надежными генетическими маркерами при селекции. Кроме того, почти все они представлены только двумя аллельными состояниями, то есть в принципе обычные морфологические генетические маркеры имеют ограниченную информативность [15].

Перспективы использования генетических маркеров в селекции значительно расширились с открытием полиморфизма белков

изоферменты можно определять в малом объёме образца и при этом анализировать много проб одновременно;

с помощью электрофоретического анализа изоферментов удается выявить мутации на молекулярном уровне, что может оказаться актуальным при клоновой селекции винограда.

Все эти преимущества электрофореза могут привести к повышению эффективности и разрешающей способности классических методов ампелографии [18].

Сущность метода электрофореза белков в том, что находящиеся в буферном растворе макромолекулы (смесь белков, полученная в результате экстракции из любой растительной или животной ткани) обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды, а его основной источник - аминокислоты. Под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода. Такое явление носит название электрофореза. В зависимости от величины заряда и размеров макромолекулы приобретают разные скорости. Постепенно исходный препарат, состоящий из макромолекул, разделяется на зоны молекул, мигрирующих с одной скоростью. После разделения белков их фиксируют, специфически окрашивают и получают спектр полос, несущих информацию о компонентном составе исследуемых белков. Возникновение множественности ферментов может быть обусловлено как множественностью генных локусов, так и аллелей. В первом случае электрофоретические варианты - это изозимы (изоферменты), во втором - аллозимы (аллоферменты) [9, 23].

Полученные множественные молекулярные формы белков используются для дальнейших изучений.

Исследования по биохимической генетике винограда и генетической изменчивости его разных таксономических форм винограда по спектрам изоферментов впервые в бывшем СССР были начаты на материале ампелографической коллекции ИВиВ "Магарач" и на базе Института общей генетики (1985, табл.1).

фенотип виноград генетический маркер

Таблица 1

В качестве анализируемых образцов использовали ткань листа, находящегося в стадии морфологической стабилизации, показывающего свежую зелень без признаков патологии и отобранного в фазу цветения на 7-10-м междоузлиях. Для получения экстрактов активных белков предложен буфер Витис, основу которого составила среда Шефера [17] с нашими модификациями. Буфер Витис можно использовать для экстракции белков из тканей семян, ягод, пыльцы. Более подробные данные о методике проведения электрофоретического разделения смеси белков из тканей винограда, идентификации и интерпретации полученных электрофоретических спектров ферментов представлены ранее [6].

В работе использовали стандартные методы статистической генетики. Кластерный анализ проведен по методу UPGMA [16] на основе матриц генетических дистанций, полученных по методу Нея [7]. Кроме того, для визуализации матриц генетических расстояний пользовались методом многомерного шкалирования [19]. Идентичность спектров изученных ферментов у разных таксономических форм винограда определяли по формуле Socal [14]. При обработке данных использовали пакеты прикладных программ: SYSTAT v4.1, SYSTAT v5.0, HARVARD GRAPHICS V.2.0.

В результате электрофоретического анализа ферментов ткани листа винограда разных таксономических форм были получены спектры 17 ферментов (табл.2) Для дальнейшего анализа взяты первые 10 полиморфных ферментных систем, остальные были либо мономорфными, либо трудно интерпретируемыми, либо их электрофоретические спектры были не стабильными.

Для изучения генотипов видов винограда родов Ampelopsis Michx., Parthenosisus Planch. и Vitis L. подрод Euvitis Planch., методом электрофореза в полиакриламидном геле проанализирована ткань листа 21 вида по спектрам 5 ферментов, схемы которых представлены на рис.1.

По результатам анализа полученных спектров изоферментов идентифицированы генотипы видов взятой пробы по 8 локусам, осуществляющим генетический контроль указанных ферментов. При этом генотипы оказались уникальными для каждого вида, то есть не выявлены ни у одного другого вида данной выборки.

В табл.3 приведены фенотипы видов по изученным ферментам. Для изучения генетической изменчивости видов рода Vitis L. соответственно степени их генетического сходства (различия) на основе полученных результатов электрофоретического анализа указанных ферментов была построена матрица расстояний по Нею [7], анализ которой проведен методами кластеризации UPGMA и многомерного шкалирования [6, 19].

По данным ампелографии, виды V. vulpina Linn. и V. riparia Michx. - синонимы, но анализ имеющихся в коллекции образцов обнаружил довольно значительное генетическое различие (0,60) между ними.

Дальнейший анализ генетической изменчивости винограда рода Vitis L. из коллекции ИВиВ "Магарач" по спектрам изоферментов позволил дать оценку чистоты коллекции видов, в результате которой выявлена примесь: образцы видов, зарегистрированных в каталоге коллекции как виды V. kaempferia Koch., V. silvestris Gmel. и неустановленная форма V. amurensis Rupr.

Последующий анализ коллекционных образцов видов VKA, VAM*, VSI, VVU, VRI по сумме признаков (спектры изоферментов и классические ампелографические признаки), проведенный сотрудниками отдела ампелографии и селекции ИВиВ "Магарач", позволил предположить, что анализируемые растения представляют завезенные при закладке коллекции филлоксероустойчивые подвои для европейских сортов.

Генетическая изменчивость сортов разных эколого-географических групп изучена по спектрам 7 изоферментов, но в данном сообщении приведены результаты по спектрам ферментов GPI, IDH, 6PGD, SOD. По ранее полученным данным известно, что генетический контроль этих изоферментов осуществляется 8 локусами, 4 из которых полиморфны (Gpi2, Idh, 6Pgd1, Sod2). Дальнейший анализ генетической изменчивости сортов проведен по полиморфным локусам. Ниже представлены некоторые результаты.

Установлены фенотипы более 130 сортов V. v. sativa D. C. по спектрам ферментов GPI, IDH, SOD, 6PGD, LAP.

Проведена паспортизация 20 сортов V. v. pontica balcanica Negr. и 15 крымских аборигенных сортов.

Проведены тесты на гетерозиготность генотипов сортов группы бассейна Черного моря.

1. Alleveldt G., Detweiller E. A model to differentiate grapevine cultivars witr help morfological characteristics // Rivista di viticulture ed Enologia. - 1989. - XLII - № 1. - P.59-63.

2. Benin M., Gasquer I., Mahfoudi A. et. al. Caracterisation biochimique des cepages de Vitis vinifera L. par electrophorese d'isoenzymes foliares: Essai de classification desvarietes // Vitis. - 1988. - 27. - № 3. - S.157-172.

3. Calo A., Costacurta A., Paludetii G., Colo G., Arulsekar S., Parfitt D. The use of isozyme markers to characterize grape cultivars // Rivista di viticoltura a di enologia. - 1989. - 1. - P.15-22.

4. Garaglio P. G. Enciclopedia vifivinicola mondiale La vifi eil vinonella legenda, nelle fradizioni e nella sforin // Enciclopedia vifivinicola mondiale. - Milano. - Italia. - 1973. - P.11-18.

5. Грамoтенко П.М. Естественные сортотипы восточной эколого-географической группы сортов винограда (convar. orientalis Negr.) // Вопросы виноградарства и виноделия. - 1968. - С 156-166.

6. Клочнева В.И., Трошин Л.П., Шурхал А.В., Ракицкая Т.А. Межвидовая и внутривидовая изменчивость винограда по аллозимным локусам // Научные труды ВНИИВиПП "Магарач". - 1989. - 9 - С.109-114.

7. Nei M. Genetic distance beffween populations // Amer. Natur. - 1972. - 106. - P.283-292.

8. Клочнева В.И., Трошин Л.П., Шурхал А.В., Ракицкая Т.А., Животовский Л.А. Идентификация видов, сортов и клонов винограда по белкам как маркерам генов (Методические указания). - М., 1990. - 35 с.

9. Parfitt D.E. The use of isozyme electrophoresis fop ampelography and evaluation of genetic diversity in Vitis vinifera L. // Rivista di viticoltura e di enologia. - 1989. - 1. - P.7-14.

10. Райдер К., Тейлор К. Изоферменты. - М.: Мир, 1983. - 107 с.

11. Рисованная В.И., Трошин Л.П. Характеристика видов и сортов рода Vitis L. c использованием молекулярно-генетических маркеров // Тез. док. Международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений". - Киев, 1994.

12. Рисованная В.И., Шурхал А.В. Изучение коллекционных форм винограда по изоферментным признакам // Тез. док.6 съездa ВОГИС. - Саратов, 1994.

13. Рисованная В.И., Полулях А.А. Генетическая изменчивость винограда // Тез. док.6 Международного симпозиума по селекции винограда. - Ялта, 1994.

14. Socal R. R., Rohlf F. J. Biometry. - San Francisco. - W. N. Freeman. - 1969.

15. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. - М.: Наука, 1985.

16. Sheat P. H., Socal R. R. Numerical taxonomy. - San Francisco. - W. N. Freeman and Co. - 1973. - 573 p.

17. Stavrakakis M. N. et. al. The between - and - within grape cultivars genetic variation // Scientia Horticulture. - 1983. - P.321-334.

18. Терехина А.Ю. Анализ данных методами многомерного шкалирования. - М.: Наука, 1986. - 167 с.

19. Топалэ Ш.Г. Полиплоидия у винограда. - К.: Штиинца, 1983. - 215 с.

20. Трошин Л.П. Оценка и отбор селекционного материала винограда. - Ялта, 1990. - 136 с.

21. Трошин Л.П., Рисованная В.И., Полулях А.А. Изменчивость признаков листа сортов винограда Vitis vinifera pontica balcanica Negr. // Виноградарство и виноделие. - Ялта. - 1995.

22. The nomenclature of multiple forms of enzymes. Recommendation // Biochem. J. - 1972. - Vol.126. - № 4. - P.769-772.

Размещено на Allbest.ru