Молекулярно-генетическая идентификация патогенных агробактерий на виноградниках Краснодарского края

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 632.3:632.911.2

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства»

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ АГРОБАКТЕРИЙ НА ВИНОГРАДНИКАХ КРАСНОДАРСКОГО КРАЯ

Макаркина М.В

Владимиров И.А

Бактериальный рак винограда, одно из наиболее важных и распространенных бактериальных заболеваний винограда по всему миру, преимущественно вызывается онкогенными штаммами Agrobacterium vitis, реже - A. tumefaciens и A. rhizogenes [1, 2]. Бактериальный рак винограда разрушительное заболевание - уменьшает силу и урожайность зараженных растений до 40 % [3]. За последние несколько десятилетий, очаги инфекции были зарегистрировано в Китае, Японии, Южной Африки, на Ближнем Востоке, в Северной и Южной Америке, а также в ряде европейских стран [4]. Бактериальный рак особенно опасен в странах Восточной Европы, в том числе в России, Украине, Молдавии, где экологические условия возделывания характеризуются экстремальными перепадами температур зимой, поздней весной и ранней осенью [5, 6]. По многолетним наблюдениям, на плодоносящих виноградниках количество больных кустов за один год увеличивается в среднем на 6 %. За 5-летний период на 10-летних насаждениях выпады вследствие гибели кустов от бактериального рака составляют 8-19 % в зависимости от сорта [7].

Типичными симптомами бактериального рака винограда являются опухоли и пролиферации тканей на нижних участках штамба. Начальные симптомы обычно остаются незамеченными, поскольку молодые опухоли образуются под корой. Онкогенная ткань быстро разрастается и может полностью опоясывать ствол. Молодые опухоли мягкие, белого, светло-коричневого или розового цвета. Позже, поверхность опухоли становится темно-коричневой, сухой и опробковевает [8]

Агробактерии заражают виноградное растение в основном через раны, вызванные морозобоинами или прививкой. Сигнальные молекулы, высвобождаемые из раны, привлекают бактерии, которые прикрепляются к раневым участкам. Заражение происходит, путем перемещения онкогенного фрагмента плазмиды (Т-ДНК) из бактерии в геном растения [9]. Это приводит к синтезу растением таких гормонов как ауксин и цитокинин, которые вызывают неконтролируемое размножение растительных клеток и в конечном итоге приводят к формированию опухолей [1]. Важной характеристикой агробактериальной инфекции является системное распределение в виноградном растении [10] Бактерия может латентно жить в сосудистой системе виноградного растения не вызывая никаких видимых симптомов заболевания до благоприятных условий для инфекции, таких как ранения [11]. По этой причине, возбудитель часто распространяется в новых районах с бессимптомным посадочным материалом.

Апеллируя информацией о наличие тех или иных видов и штаммов в исследуемой зоне, можно подобрать соответствующие штаммы-антагонисты для борьбы с бактериальным раком. Это стало возможно благодаря популяризации молекулярно-генетических методов в диагностике возбудителей различных заболеваний. Так, изучение агробактерий на молекулярно-генетическом уровне в мире началось еще в конце прошлого века. Первые значимые успехи по молекулярно-генетической идентификации агробактерий опубликованы в 1995 году [12]. Позже последовала серия работ, направленных на точную видовую, а позже и штамм-специфичную идентификацию агробактерий. Праймеры для ПЦР-идентификации были разработаны на гены virA, pehA и 6a [13, 14], virD2 и ipt [12], virE2 [15], visF и visR [15], а также на гены virC [16], virF [17], iaa [18] и AVS [19], которые присутствуют в штаммах фитопатогенных Agrobacterium.

Цель исследования - молекулярно-генетическая идентификация патогенных агробактерий на виноградниках Краснодарского края.

Объекты и методы исследований. В качестве материала использовали опухолевидные наросты бактериального рака, обнаруженные на растениях винограда сортов Баклановский, Восторг идеальный, Каберне АЗОС, Бархатный, Преображение, Тасон, Низина, Сира, Кломбар, Рислинг, Совиньон, Аттика, Шардоне, Каберне Совиньон различного происхождения (Италия, Франция, Сербия, Россия) на виноградниках Краснодарского края - Крымска, Горячего ключа, Темрюкского района и окрестностей Краснодара. Всего проанализировано 22 образца.

ДНК из опухолей выделяли модифицированным CTAB-методом [20, 21]. Для исследования изолятов агробактерий использовали два метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) - классическую ПЦР [22] и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) [23].

ПЦР проводили в 25 мкл смеси, содержащей 1х ПЦР-буфер для Taq-полимеразы с сульфатом аммония, 0,125 мМ/мкл dNTP, 0,25 пМ/мкл праймер прямой, 0,25 пМ/мкл праймер обратный, 0,05% БСА, 0,125 e.a/мкл Taq-полимераза (ООО «Бигль», Санкт-Петербург, Россия). Реакцию ПЦР в режиме реального времени проводили в 20мкл смеси, содержащей 1х ПЦР-буфер для Taq-полимеразы, 0,125 мМ/мкл dNTP, 0,25 пМ/мкл праймер прямой, 0,25 пМ/мкл праймер обратный, 0,05% БСА, 0,125 e.a/мкл Taq-полимераза, 0,125 пМ/мкл гидролизный зонд (ООО «Бигль», Санкт-Петербург, Россия).

ПЦР-РВ ставили по программе: 5 мин при 94оС., 40 циклов - 18сек при 94оС, 40 сек при Tm (температура отжига праймеров), 40сек при 72оС, с использованием прибора АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург, Россия). Классическую ПЦР ставили по программе: 5 мин при 94оС., 40 циклов - 18сек при 94оС, 40 сек при Tm (температура отжига праймеров), 60сек при 72оС, далее 4 мин при 72оС с использованием прибора Eppendorf «Mastercycler Gradient» (Eppendorf, Гамбург, Германия).

Относительное количество фрагментов ДНК оценивали методом электрофореза в 1% агарозном геле («Helicon», Москва, Россия) по интенсивности свечения спектров в УФ свете, после нанесения 3 мкл ПЦР-продукта, смешанного с 0,5мкл 0,125% раствора ксиленцианола в 30% глицерине и разгона в 1х SB-буфере при напряженности электрического поля 5В/см. В качестве маркера молекулярного веса использовали 100bp+1,5kb ladder (Лаборатория генной и клеточной инженерии, СПБГУ, Санкт-Петербург, Россия).

Секвенирование ДНК методом Сенджера проводили на базе РЦ СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Полученные последовательности фрагментов ДНК анализировали в базе данных NCBI [24]. рак виноград агробактерия антагонист

Обсуждение результатов. Молодые, свежие и активно растущие опухоли являются наиболее подходящим растительный материалом для изоляции Agrobacterium SPP. ПЦР является удобным методом для быстрой идентификации патогенных видов Agrobacterium и их дифференциации от непатогенных. В данной работе для видовой идентификации использовали метод ПЦР-РВ с использованием праймеров и гидролизного зона к pehA гену - тест система для обнаружения A. vitis [25], и к virD2 гену - тест система для обнаружения A. tumefaciens [26]. И классический метод ПЦР с использованием праймеров к virF гену для более точной идентификации. Кроме того были отработаны тест-системы к генам virD2, 6b и iaaH, однако, в их случае получен отрицательный результат. Это может быть связано со значительным генетическим разнообразием среди штаммов Agrobacterium.

Рисунок 1. Выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагментов гена virF, семи изолятов A. vitis из Краснодарского края (A-G) относительно друг друга.

Методом ПЦР-РВ с использованием тест системы к pehA гену удалось обнаружить наличие ДНК A. vitis во всех анализируемых образцах, тест системой к virD2 гену A. tumefaciens не был обнаружен ни в одном образце.

Следующим этапом было выборочное изучение шести образцов классическим метод ПЦР с использованием тест системы к virF гену. Удалось амплифицировать целевой фрагмент (~400 п.н.) во всех образцах. Последующее секвенирование показало их 100 % соответствие фрагменту гена virF A. vitis и абсолютную идентичность между собой:

Таким образом, в исследуемых образцах опухолевидных наростов, обнаруженных на территории Краснодарского края, в качестве возбудителя бактериального рака винограда выявлена агробактерия вида A. vitis.

Использование методов молекулярно-генетической идентификации позволяет быстро и точно определять возбудителя заболевания бактериального рака в растительном материале виноградных растений.

Литература

1. Burr, T. J. Crown gall of grape: biology of Agrobacterium vitis and the development of disease control strategies / T. J. Burr, C.Bazzi, S.Sьle, L.Otten // Plant Disease. - 1998. - V. 82(12). - P. 1288-1297.

2. Knauf, V.C. Comparison of Ti Plasmids from Three Different Biotypes of Agrobacterium tumefaciens Isolated from Grapevines / V.C. Knauf, C.G. Panagopoulus, E.W. Nester // Journal of bacteriology. - 1983. - V. 153, №3. - P. 1535-1542.

3. Schroth, M.N. Reduction in yield and vigor of grapevine caused by crown gall disease / M.N. Schroth, A.H. McCain, J.H. Foott, O.C. Huisman // Plant Disease. - 1988. - V.72. - P. 241-246.

4. Kuzmanoviж, N. Identification of Agrobacterium vitis as a causal agent of grapevine crown gall in Serbia / N. Kuzmanoviж, K. Gaљiж, M. Ivanoviж, A. Prokiж, A. Obradoviж // Archives of Biological Sciences. - 2012. - V. 64, №. 4. - P. 1487-1494.

5. Леманова, Н.Б. Бактериальные опухоли винограда на вино¬градниках континентальной Европы / Н.Б. Леманова // Микробиология. Изв. АН МССР. - 1979. - № 2. - C. 26-33.

6. Султанова, О.Д. Бактериальные заболевания винограда и изучение их распространения в Молдавии / О.Д. Султанова, Н.Б. Леманова // Защита винограда и плодовых культур от вредителей и болезней. - Кишинев, 1979. - С. 84-87.

7. Леманова, Н.Б. Биологический контроль бактериального рака Agrobacterium tumefaciens / Н.Б. Леманова, М.К. Магер // Защита и карантин растений. - 2011. - №6. - С. 25-27.

8. Burr, T.J. A root-specific decay of grapevine caused by Agrobacterium tumefaciens and A. radiobacter biovar 3 / T.J. Burr, A.L. Bishop, B.H. Katz, L.M. Blanchard, C. Bazzi // Phytopathology. - 1987. - V.77. - P. 1424-1427.

9. Zhu, J. The bases of crown gall tumorigenesis / J. Zhu, P.M. Oger, B. Schrammeijer, P.J.J. Hooykaas, S.K. Farrand, S.C.Winans // Journal of Bacteriology. - 2000 - V. 182. - P. 3885-3895.

10. Lehoczky, J. Spread of Agrobacterium tumefaciens in the vessels of the grapevine after natural infection / J. Lehoczky // Phytopath. - 1968, V. 63, №3. - P. 239-246.

11. Бурдинская, В.Ф. Латентная зараженность винограда бактериальным раком / В.Ф. Бурдинская, Н.О. Арестова // Защита и карантин растений. - №10. - 2010. - С. 38-39.

12. Haas, J.H. Universal PCR primers for detection of phytopathogenic Agrobacterium strains / J.H. Haas, L.W. Moore, W. Ream, S. Manulis // Applied and Environmental Microbiology. - 1995. - Т. 61. - №. 8. - С. 2879-2884.

13. Eastwell, K.C. A rapid and sensitive method to detect Agrobacterium vitis in grapevine cuttings using the polymerase chain reaction / K.C. Eastwell, C. Kenneth, G. Leslie Willis, D.T.Cavileer // Plant Disease. - 1995. - V.79, №8. - P. 822-827.

14. Herlache, T.C.Characterization of the Agrobacterium vitis pehA gene and comparison of the encoded polygalacturonase with the homologous enzymes from Erwinia carotovora and Ralstonia solanacearum / T.C. Herlache, A.T. Hotchkiss, T.J. Burr, A. Collmer // Applied and environmental microbiology. - 1997. - V.63, №1. - P. 338-346.

15. Szegedi, E. Detection of Agrobacterium vitis by polymerase chain reaction in grapevine bleeding sap after isolation on a semiselective medium / E. Szegedi, S. Bottka // Vitis-Journal of Grapevine Research. - 2002. - V. 41, №. 1. - P. 37-42.

16. Suzaki, K. Detection of tumorigenic Agrobacterium strains from infected apple saplings by colony PCR with improved PCR primers / K. Suzaki, K. Yoshida, H. Sawada // Journal of General Plant Pathology. - 2004. - V. 70, №. 6. - P. 342-347.

17. Bini, F. Novel pathogen-specific primers for the detection of Agrobacterium vitis and Agrobacterium tumefaciens / F. Bini, A. Kuczmog, P. Putnoky // Vitis Journal of Grapevine Research. - 2008. - V.47, №3. - P.181-190.

18. Puіawska, J. Development of a semi nested PCR based method for sensitive detection of tumorigenic Agrobacterium in soil / J. Puіawska, P. Sobiczewski // Journal of Applied Microbiology. - 2005. - V. 98, №.3. - P. 710-721.

19. Lim, S.H. Novel SCAR primers for specific and sensitive detection of Agrobacterium vitis strains / S.H. Lim, J.G. Kim, H.W. Kang // Microbiological research. - 2009. - V.164, №4. - P. 451-460.

20. Doyle, J.J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh tissue / J.J. Doyle, J.L. Doyle // Phytochem. Bull. - 1987. - V. 19. - P. 11-15.

21. Tamari, F. A comparison of DNA extraction methods using Petunia hybrida tissues / F. Tamari, C.S. Hinkley, N. Ramprashad // Journal of biomolecular techniques. - 2013. - V. 24(3). - P. 113-118.

22. Шибата, Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов / Д.К. Шибата // Молекулярная клиническая диагностика.- М.: Мир, 1999.- С. 395-427.

23. Владимиров, И.А. ПЦР в реальном времени для изучения распространения агробактерий / И.А. Владимиров, Т.В. Матвеева, Л.А. Лутова. - СПб: Галаника, 2014. - 68 с.

24. Chebil, S. Occurrence of Agrobacterium Vitis Carrying Two Opine-Type Plasmids in Tunisian Vineyards / S. Chebil, R. Fersi, S. Chenenaoui, E. Abdellatif, G. Durante, E. Zacchi, A. Mliki // Journal J Plant Pathol. Microbiol. - V. 4, №4. - P. 1-4

25. Матвеева, Т.В. Способ диагностики биоматериалов на наличие в них агробактерий / Т.В. Матвеева, Д.И. Богомаз, Л.А. Лутова // Бюллетень «Изобретение. Полезные модели» Роспатент РФ. - 2012. - №22/12.

Аннотация

В работе представлены результаты молекулярно-генетической идентификации патогенных агробактерий, выявленных на виноградниках Краснодарского края. Определена принадлежность возбудителя бактериального рака винограда к виду A. vitis.

Ключевые слова: виноград, бактериальный рак, патогенные агробактерии, ПЦР, гены вирулентности.

The results of the molecular-genetic identification of pathogenic Agrobacterium in the vineyards of the Krasnodar Region are presented. The belonging of the pathogenic agent of crown gall of grape to the species Agrobacterium vitis is determined.

Key words: grape, crown gall, pathogenic Agrobacterium, PCR, vir genes.

Размещено на Allbest.ru