Сахароза как ингибитор роста при хранении растений винограда в коллекции in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Сахароза как ингибитор роста при хранении растений винограда в коллекции in vitro

Сохранение генофонда растений - актуальнейшая задача нашего времени. Применяемые традиционные методы сохранения генофонда трудоемки, а иногда и очень дорогостоящи, неприемлемы для ряда видов растений. Ценность сохраняемых растений часто лимитируется возможными болезнями и прихотливостью растений к новым средам обитания.

Эффективность сохранения генофонда растений ex situ может быть резко повышена путем создания генетических банков растений.

Биотехнологические методы находят широкое применение во всём мире для долговременного сохранения коллекций растений, используемых в дальнейшем как для селекционных целей, производства оздоровленного посадочного материала, так и для сохранения генофонда и биоразнообразия растений в целом.

Один из методических подходов к депонированию - содержание биологических объектов в условиях замедленного метаболизма. Среди биотехнологических методов одним из условий замедления роста является применение осмотиков

Осмотики - вещества, имитирующие для растения недостаток влаги. Действие водного стресса на растения выражается в снижении скорости ростовых процессов, угнетении фотосинтеза и дыхания, снижается ферментативная активность, изменяется соотношение минеральных веществ [1].

Из различных публикаций известно, что в питательные среды для замедления роста и сохранения in vitro растительного материала добавляют различные органические вещества, обладающие высокой осмотической активностью: сахарозу, глюкозу, манит [2, 3] или сорбит [4].

Сахароза относится к группе дисахаридов (входит в класс олигосахаридов). Ингибирующее действие сахарозы основано на изменении осмотического давления жидкости в сторону экзосмоса.

Ингибирующее действие сахаров апробировано при исследовании многих видов растений в культуре in vitro: картофеля [5, 6, 8], льна [7], земляники [9], тополя [10], озимой мягкой пшеницы [11]. Начаты такие исследования в виноградарстве [12]. В целом исследователи отмечают, что повышенная концентрация сахарозы (4-5%) в питательной среде задерживает рост клеток, не вызывая токсического эффекта, и поэтому может быть использована для поддержания культур в состоянии покоя в течение длительного периода [12].

Цель исследования - выявить влияние концентраций сахарозы на ростовые процессы мериклонов винограда для продолжительного беспересадочного хранения растений в коллекции in vitro.

Методы исследования. Оздоровление растений винограда перед постановкой на хранение осуществляли методом культуры апикальных меристем при относительном размере эксплантов 0,1-0,2 мм. Для повышения регенерационной способности меристем, микроразмножения полученных растений, применяли схему и технологию клонального микроразмножения, разработанную в лаборатории биотехнологии [13].

Жизнеспособность растений оценивали с периодичностью один раз в месяц по количеству некрозов тканей листьев и побегов: 0 баллов - визуальная гибель растения, 1 балл - некроз более 50% тканей растения, 2 балла - некроз менее 50% тканей, 3 балла - растения без некроза.

Результаты исследований. Для поддержания культур в состоянии замедленного роста изучали концентрации сахарозы 10 - 90 г./л на сортах Кумшацкий, Крестовский, Сибирьковый, Варюшкин, Баклановский; реакцию различных сортов винограда (12) на содержание сахарозы в количестве 60-70 г./л в питательной среде.

Данные о состоянии пробирочных растений сорта Крестовский в течение 3-х месяцев культивирования приведены в таблице 1. Отмечена высокая приживаемость микрочеренков и сохранность растений в опыте. Только при максимальной концентрации сахарозы отмечено ухудшение развития микрочеренков. На протяжении всего периода культивирования оптимальное развитие растений происходило при концентрации сахарозы 30 г./л. При минимальной (10 г./л) и максимальной концентрациях (60,0 г/л) происходило ухудшение корнеобразования, уменьшение длины ризогенной зоны, скорости роста, снижение облиственности побегов.

виноград культивирование сахароза ингибитор

Таблица 1. Жизнеспособность пробирочных растений сорта Крестовский при различных концентрациях сахарозы, 2011-2012 гг.

Растения, перенесенные в культуральную комнату с пониженной температурой, сохранялись в течение 6 месяцев (табл. 2). В вариантах с минимальными концентрациями сахарозы у сохранившихся растений жизнеспособность составляла 2 балла. При концентрации сахарозы 40 г./л для растений характерна удовлетворительная жизнеспособность - 1,6 балла и вызревание побегов у единичных растений. При повышенных концентрациях сахарозы 50-60 г./л жизнеспособность и число сохранившихся растений снизилось, но зеленые листья ещё имелись, отмечено вызревание побегов.

Таблица 2. Состояние растений после хранения в течение 6 месяцев в культуральной комнате с пониженной температурой, Крестовский, 2011-2012 гг.

Нахождение растений в течение 3-х месяцев при температуре 25-27⁰С на питательной среде с повышенным содержанием сахарозы с последующим переносом в условия пониженной температуры обеспечило их сохранность без снижения жизнеспособности в течение 9 месяцев. Сохранились единичные растения, которые находились в удовлетворительном состоянии, их культивирование продолжалось.

Аналогичные результаты получены в опытах по изучению повышенных концентраций сахарозы (4-6%) на сортах винограда Сибирьковый и Баклановский.

При введении в состав питательной среды сахарозы в количестве 70 г./л установлена возможность беспересадочного культивирования растений сортов Косоротовский, Кукановский, Сибирьковый, Цимлянский черный (клон 2-3) и Рупестрис дю Ло в течение 9 месяцев. При этом происходит вызревание растений и на хранении ещё остаются жизнеспособные растения.

Исследована возможность депонирования ряда сортов при концентрации сахарозы 60,0 г/л. Полученные результаты отражены в таблице 5. Возраст растений, отобранных для закладки опыта, составлял 6 месяцев. Состояние растений сортов Каберне Совиньон, Виерул 13. Сибирьковый оценивалось как хорошее. Растения имели зеленые листья и побеги.

При культивировании в течение 90 дней отмечен наиболее интенсивный рост у сорта Сибирьковый. Остальные сорта отличались умеренным развитием. Следует отметить, что у всех сортов отмечен высокий коэффициент полярности, что указывает на преимущественное развитие корневой системы растений по сравнению с развитием побегов.

Депонирование продолжалось в течение одного года (360 дней). При хранении сохранилось 12 (42,8%) растений сорта Виерул 3; 7 (25,0%) растений сортов Каберне Совиньон; и 2 растения (7,1%) сорта Сибирьковый. У всех сортов отмечено вызревание побегов.

Таким образом, при уменьшении содержания сахарозы в питательной среде с 70,0 г/л до 60,0 г/л продолжительность депонирования увеличивается.

Таблица 3. Реакция отдельных сортов винограда на повышенное содержание сахарозы в питательной среде (60 г./л), 2013-2014 гг.

Проведено дополнительное исследование реакции некоторых сортов на повышенное содержание сахарозы (табл. 4). Следует отметить, что при культивировании в течение первых двух месяцев отсутствовало угнетение растений. Менее интенсивно ростовые процессы происходили у сортов Мерло и Баклановский, более интенсивно у сорта Пино Фран.

Таблица 4. Реакция некоторых сортов винограда на повышенное содержание сахарозы в питательной среде (60 г./л), 2013-2014 гг.

Депонирование в течение 270 дней показало, более высокую адаптивность к таким условиям хранения у сорта Сыпун черный, Кумщацкий. Сохранилось в коллекции за это время 67,8% растений сорта Сыпун черный, коэффициент жизнеспособности которого составил 0,8. Сохранность сорта Кумщацкий составила 42,8% а жизнеспособность 0,7-0,8. Низкая сохранность (21,8%) и жизнеспособность растений (0,4) отмечены у сорта Баклановский. Полностью погибли в процессе хранения растения сорта Пино фран.

Таким образом, для большинства исследуемых сортов доказана возможность беспересадочного хранения растений до 90 и даже 270 дней на питательной среде с содержанием сахарозы 60,0 г/л.

В дополнение к оптимальной концентрации, применяемой в биотехнологии при приготовлении питательных сред, мы включили в изучение уже испытанные нами более высокие концентрации и впервые минимальные концентрации 5,0 и 10,0 г/л (табл. 5).

Таблица 5. Изучение различных концентраций сахарозы при культивировании винограда in vitro, сорт Пухляковский, 2015-2016 гг.

Как следует из приведенных данных, растения «ин витро» лучше развиваются при концентрации сахарозы 20,0 и 30,0 г/л. Преимущество этих концентраций видно уже через месяц культивирования и сохранилось при культивировании в течение 60 дней. В этих вариантах растения, как это видно из данных первого учета, образовали большую ризогенную зону, имели более высокий рост и облиственность. При пониженных и повышенных концентрациях отмечено снижение ростовых процессов, что представляет интерес для более продолжительного беспересадочного культивирования.

Однако, при культивировании в течение 60 дней, положение изменилось. При концентрациях 5,0 и 10 г./л у растений отставало развитие ризогенной зоны, но улучшился рост и облиственность побегов. При концентрациях сахарозы в составе питательной среды 40,0 и 60,0 г/л развитие ризогенной зоны и надземной части не отличалось от растений оптимальных концентраций.

Культивирование растений продолжалось в стандартных условиях течение 270 дней. За этот период сохранились жизнеспособными 8 растений из варианта с концентрацией сахарозы 5,0 г/л, 7 растений из варианта с концентрацией - 20,0 г/л и 11 растений из варианта с концентрацией 60,0г/л.

Таким образом, подтвердились результаты наших предыдущих исследований о применении для продолжительного хранения повышенных концентраций и выявлена возможность применения для этих целей пониженных концентраций сахарозы.

С увеличением концентрации сахарозы выше 30 г./л происходит замедление ростовых процессов: уменьшается корнеобразование, длина корней и длина ризогенной зоны, рост и облиственность растений. В процессе культивирования наблюдается вызревание побегов.

Установлена возможность беспересадочного культивирования растений без снижения жизнеспособности в течение 9 месяцев на питательной среде с повышенным содержанием сахарозы при температуре 25-27⁰С с последующим переносом в условия пониженной температуры.

При введении в состав питательной среды сахарозы в количестве 70 г./л возможно беспересадочное культивирование растений в течение 9 месяцев при сохранившейся жизнеспособности растений.

При уменьшении содержания сахарозы в питательной среде с 70,0 г/л до 60,0 г/л продолжительность депонирования увеличилось до одного года (360 дней). При хранении сохранилось от 7,1 до 42,85 растений в зависимости от сортовых особенностей и от состояния растений перед постановкой на хранение.

При концентрациях 70 - 90 г./л, после хранения в течение 5 месяцев. отмечено явное торможение роста, но растения сохраняли свою жизнеспособность. Однако при депонировании в течение 8-10 месяцев в этих вариантах наблюдалось резкое снижение их жизнеспособности и интенсивное высыхание растений. Это не позволяет рекомендовать эти концентрации сахарозы для депонирования винограда in vitro.

Для увеличения продолжительности беспересадочного хранения растений в культуре in vitro до 1-2 лет следует совмещать применение повышенных концентрации сахарозы и культивирование растений при пониженной положительной температуре.

Литература

виноград культивирование сахароза ингибитор

1. Использование метода замедления роста для создания коллекции in vitro лекарственных растений / Г.К. Асанова, А.Ж. Куандыкова, А.Ш. Додонова С.М. Адекенов // Eurasian Journal Of Applied Biotechnology. -2007. - №2. - С 60-66.

2. Cassels A.S. Problems in Tissue Culture: Culture Contamination. P.31-44. In P.C. Debergh and R. Zimmerman (eds.). Micropropagation Technology and Application. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. Netherlands. 1991.

3. Reed. B.M. Bacteriology Handbook / B.M. Reed, P.M Buckley // NCGR. Corvallis, Or. USA. - 1999. - P. 39.

4. Kumar M.B. Genetic Stability of Micropropagated and in vitro cold-stored strawberries. MSc Thesis, Oregon State University, USA. 1995.

5. Дерябин, А.Н. Зависимость формирования холодоустойчивости у растений in vitro от концентрации сахарозы в среде выращивания / А.Н. Дерябин, А.П. Сабельникова, Е.А. Бураханова // Вестник Мордовского Университета. - 2011. - №4. - С 200-206.

6. Мякишева, Е.П. Влияние сахарозы на показатели развития растений-регенерантов картофеля (Solanumtuberosum L.) в культуре in vitro / Е.П. Мякишева // Ломоносовские чтения на Алтае: Фундаментальные проблемы науки и образования. - Алтай, 2014. - С. 1214-1216.

7. Виноградова, Е.Г. Использование сахарозы в качестве селективного агента в культуре in vitro льна, с целью получения засухоустойчивых генотипов/ Е.Г. Виноградова // Синергетика в общественных и естественных науках. - Тверь, 2015 - С. 64-66.

8. Гусева, И.Д. Влияние концентрации сахарозы на укоренение картофеля Solanum TuberosumL. в культуре in vitro / К.Ю. Гусева, И.Д. Бородулина // Молодежь - Барнаулу. - Барнаул, 2014. - С. 76-78.

9. Высоцкая, О.Н. 25 лет сохранения in vitro коллекции земляники (FragariaL.) / О.Н. Высоцкая // Плодоводство и ягодоводство России. - 2014. - Т 38. - С. 74-81.

10. Внукова, Н.И. Сохранение коллекции ценных генотипов тополя белого и сереющего на основе ее депонирования in vitro / Н.И. Внукова, Т.М. Табацкая, О.С. Машкина // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2016. - 28-35.

11. Калинина, А.В. Влияние растворов осмотиков на рост проростков озимой мягкой пшеницы / А.В. Калинина // Аграрный Вестник Юго-Востока. - Саратов, 2014. - С. 68-69

12. Дорошенко, Н.П. Создание и хранение коллекции винограда in vitro / Н.П. Дорошенко, Т.В. Жукова // Русский Виноград. - 2016. - Т 3. - С. 8-14.

13. Гаевский, Н.А. Избранные главы экологической физиологии растений / Н.А. Гаевский, Т.И. Голованова, В.М. Гольд. - Красноярск, 2012. - 91 с.

14. Reed B.M., Chang Y. Medium-and Long - term Storage of In Vitro Cultures of Temperate Fruit and Nut Crops. In: Conservation of Plant Genetic Resources In Vitro. Vol. 1: General Aspects. Eds. M.K. Razdan, E.C. Cocking, d. sc., M/S. Science Publishers, Inc. U.S. A - 1997, pp. 67-105

15. Дорошенко, Н.П. Клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа: рекомендации / Н.П. Дорошенко. - М., 1998. - 24 с

Размещено на Allbest.ru