Лабораторна діагностика аутоімунної гемолітичної анемії у собак і котів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний університет біоресурсів і природокористування Украіни

ННІ ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва

Факультет ветеринарної медицини

Кафедра біохімії і фізіології тварин

імені акад. М. Ф. Гулого

Ян Анастасія Артурівна

Курсова робота

З дисципліни «Клінічна біохімія»

на тему: «Лабораторна діагностика аутоімунної гемолітичної анемії у собак і котів»

студентка 3 групи, IV курсу

спеціальність: 6.110101- ветеринарна медицина

Науковий керівник: проф. В. А. Грищенко

Київ 2018



План

Вступ

Розділ 1. Поняття про аутоімунну гемолітичну анемію

1.1 Визначення аутоімунної гемолітичної анемії

1.2 Етіологія

1.3 Патогенез

1.4 Симптоми

Розділ 2. Лабораторна діагностика аутоімунної гемолітичної анемії

2.1 Діагностичний алгоритм

2.2 Куумбс-тест на визначення АГА

2.3 Мікроскопічна діагностика АГА

Висновок

Список використанної літератури



Вступ

аутоімунний гемолітичний анемія патогенез

Актуальність теми. Аутоімунна гемолітична анемія найбільш часто зустрічається серед всіх захворювань імунної системи у собак і кішок. При цьому захворюванні імунна система атакує і руйнує червоні клітини крові власного організму. Така реакція може бути спровокована вірусами, лікарськими препаратами, можливо, вакцинацією і навіть рак. Захворювання може розвинутися раптово і швидко перейти в гостру стадію, але може протікати хронічно. Чим інтенсивніше руйнуються червоні клітини крові, тим гірше прогноз.

Мета. Систематизувати дані про діагностику різних типів аутоімунної гемолітичної анемії у свійських тварин, а також визначити методи диференціації цього захворювання.

Об'єкт дослідження. Аутоімунна гемолітична анемія у свійських тварин, її класифікація та діагностика

Предмет дослідження. Лабораторна діагностика аутоімунної гемолітичної анемії у собак і котів, її класифікація та диференціація.



Розділ 1. Поняття про аутоімунну гемолітичну анемію

1.1 Визначення аутоімунної гемолітичної анемії

Анемія - це не захворювання, а лише синдром, етіологія якого повинна служити предметом досліджень. Термін «анемія» означає зниження концентрації циркулюючого в крові гемоглобіну. [2]

Найчастіше при цьому спостерігають зменшення кількості еритроцитів, однак це зовсім не обов'язково. Нормальний вміст загального гемоглобіну в крові собак коливається в межах 12-18 г на 100 мл крові. Ми говоримо про анемію, якщо цей показник падає нижче 12 г на 100 мл. У кішок поріг концентрації гемоглобіну в нормі нижче 10 г / 100 мл крові.

Зазвичай анемії поділяють на регенеративні і арегенеративні. Це залежить від здатності кісткового мозку підтримувати чисельність циркулюючих в периферичної крові еритроцитів. [5]

* Регенеративна анемія

Регенеративна анемія характеризується появою в периферичній крові ретикулоцитів, що дають картину поліхроматофілії, яка асоціюється в мазках з анизоцитозом. Регенеративні анемії, в свою чергу, поділяються на регенеративні анемії внаслідок крововтрати та анемії в результаті гемолізу.

* Гемолітична анемія

Гемолітичні анемії характеризуються зменшенням тривалості життя еритроцитів. Про наявність подібної анемії можна судити по продуктам деградації гемоглобіну. Гемоліз може бути як внутрішньо-, так і позасудинним. За походженням гемолітичні анемії можуть бути різними. Інтракорпускулярні викликані аномалією по типу інтрансек власне еритроцитів (як правило, мають спадковий характер). Екстракорпускулярні: інфекційної або паразитарної природи, внаслідок інтоксикації, порушення імунітету, в силу інших причин (синдром ДВС - дисемінованої внутрішньосудинної коагуляції).

Аутоімунна гемолітична анемія (АГА autoimmune hemolytic anemia) - це надзвичайно серйозне захворювання людини і тварин, що характеризується запуском аутоімунних механізмів, спрямованих на знищення клітин організму, зокрема, нормальних еритроцитів. У 60-70% випадків етіологія даного захворювання залишається невстановленою. [2]

Хвороба носить широке поширення, зустрічаючись повсюди. Аутоімунна гемолітична анемія реєструється у собак всіх порід. При цьому у кокер-спанієлів, пуделів, староанглійський вівчарок і ірландських сеттерів ймовірність її виявлення вище. Також ряд дослідників відзначає, що найбільш часто дана патологія має місце у молодих особин жіночої статі і самок середнього віку. Вираженої сезонності не встановлено. Часто виявляється і важко протікає вторинна АГА нетравматичної природи.

АГА є одним з найбільш характерних класичних прикладів аутоімунних захворювань. АГА у людини була вперше відкрита в 1945 році за допомогою анти-глобулінового тесту, який отримав назву методу Кумбса. Miller G. et al. (1957) вперше повідомили про АГА у собаки. АГА була також виявлена ??у мишей, морських свинок, коней (Miller G. et al., 1957; Taylor FG.R., Cooke BJ, 1990), великої рогатої худоби (Dixon PM etal. 1978; FengerC.K., Et al ., 1992), овець, свиней, собак і кішок (Halliwel REW, 1982).

Класифікаці АГА

АГА класифікують за імунологічними і клінічними ознаками.

Критерії:

Клінічна картина, результати лабораторних досліджень, патогенез, прогноз і лікування АГА багато в чому залежать від типу імунопаталогічного процесу.

Імунологічна класифікація АГА грунтується на класі антитіл (IgG або IgM) і їх функціях -аглютинуючих або іноді гемолітичних.

Класифікація АГА включає п'ять основних класів (табл. 1.1.). Холодові аглютиніни визначаються як аглютинуючі антитіла, які виявляються при температурі + 4 ° С. Вони завжди відносяться до класу IgM. [7]

1.2 Етіологія

Основною причиною у виникненні аутоімунної гемолітичної анемії, на думку багатьох дослідників, є генетична схильність індивідуума. Спадкова гемолітична анемія пов'язана з різними генетичними дефектами, зокрема з дефектом мембрани еритроцитів (спадковий мікросфероцитоз, овалоцитоз), дефіцитом деяких ферментів в еритроцитах (глюкозо-6-фосфат-дегідрогеназа, піруваткіназа і ін.), Порушенням синтезу ланцюгів глобіну (таласемія), наявністю нестабільних гемоглобінів. [9]Типи порід, які можуть мати схильність до цього захворювання, включають:

· ірландський сетер

· кокер-спанієль

· шотландський тер'єр

· староанглійська вівчарка

· мініатюрний шнауцер

· англійський спрінгер-спаніель

· пудель

· доберман

· такса

Руйнування еритроцитів в результаті аутоімунної відповіді може бути при:

- первинній ідіоматичній аутоімунній гемолітичний анемії (головним чином, собаки);

- ізоеритролізі у новонароджених (головним чином, кішки);

- системній червоній вовчанці (головним чином, собаки);

- переливанні несумісної крові;

- хворобі холодового агглютиніна (кішки, анемія в легкій формі);

- алергії на лікарські реагенти (собаки - цефалоспорини, левамізол, прімікарб (інсектицид); кішки - гризеофульвін, альбендазол).

Таблиця 1.1. Класифікація АГА (ПМК = прямий метод Кумбса)

Клас	Антитіла	Класс Ас	Комплемент	Основна ділянка пошкодження	Діагностика	Коментарі
I	аутоаглютиніни	IgG( IgM)	-	Всередині судин	Спонтанна аглютинація при 37 °C	Гостра танадгостра форма Прогноз - сумнівний
II	Гемо лізини	IgM (IgG)	С1 >С9	Всередині судин	ПМК при 37 °C	Гостра танадгостра форма Тяжка анемія Гемоглобінемія гемоглобінурія
III	Неповні антитіла	IgM (IgG)	С1 >C3b	Поза судиною	ПМК при 37 °C	Гостра танадгостра форма Найбільш поширена
IV	Холодові аглютиніни	IgM	С1 >C3b	Всередині судин	Спонтанна аглютинація при 37 °C	Хронічна форма Ціаноз Некроз пальців, носа, вух
V	Холодові гемолізини	IgM (IgG)	С >C3b	Поза судиною	ПМК при 37 °C	Хронічна форма Гемоліз на холоді

1.3 Патогенез

Патогенез аутоімунної гемолітичної анемії незалежно від етіологічного фактора представляється в такий спосіб. Під впливом на організм вищевказаних патогенних ендогенних або екзогенних факторів відбувається сенсибілізація еритроцитів зі зміною їх поверхневої антигенної структури, що, в свою чергу, веде до порушення комплексу гістосумісності в організмі і порушення толерантності до клітин власного організму. В результаті зазначених процесів, що відбуваються в організмі індивідуума починається вироблення специфічних аутоімунних антитіл, спрямованих проти власних нормальних сенсибілізованих еритроцитів. В результаті звичайної імунної реакції - антиген (нормальний сенсибілізований еритроцит) + комплемент + аутоантитіло - йде пошкодження еритроцита зі зміною його звичайної форми, обсягу і перетворенням в сфероцит. Трансформовані в сфероцити еритроцити розпізнаються макрофагами селезінки, печінки, кісткового мозку як ті, що представляють небезпеку для організму чужорідні клітини і знищуються за допомогою гемолізу. В результаті масованого інтравазального і позасудинного гемолізу еритроцитів в кров'яному руслі різко зростає кількість вільного гемоглобіну, нездатного бутиперетворенним в білірубін. [10]

При цьому, згідно з Ж. Пеллерену, К. Фурнель, Л. Шабану, у собак частіше зустрічається первинна аутоімунна гемолітична анемія, обумовлена ??дією аутоімунних імуноглобулінів класу G. Вторинна аутоімунна гемолітична анемія часто поєднується з системною червоною вовчанкою, аутоімунним дерматозом.

Іншим наслідком великого гемолізу є накопичення в крові вільного білірубіну, що утворюється внаслідок дисфункції печінки не може бути пов'язаний з глюкуроновою кислотою і тим самим бути знешкодженим. [1]

В результаті описаних процесів відбувається, з одного боку, втрата гемоглобіну з сечею, а з іншого боку, не пов'язані білірубін токсично впливає на центральну нервову систему, нирки, органи ендокринної системи, печінку, серце та ін. Крім того, факт руйнування еритроцита, що є форменим елементом крові , відповідальним за транспорт кисню до клітин органів і тканин організму, веде до розвитку анемії, гіпоксії та інших порушень.

1.4 Симптоми

Клінічний прояв аутоімунної гемолітичної анемії не має яскраво виражених ознак, притаманних суто цьому захворюванню. АГА проявляються в будь-якому віці, однак найчастіше їх спостерігають з 2 до 7 років. Також впливає пору року, оскільки 40% випадків АГА виявляють в травні-червні. Початок захворювання може бути прогресуючим або раптовим. Для АГА властиво поєднання п'яти патогномонічних симптомів:

1) занепад сил, млявість (86%)

2) блідість слизових (76%)

3) гіпертермія

4) тахіпное (70%)

5) тахікардія (33%).

Трьома основними причинами звернення до ветеринарного лікаря є: коричневий колір сечі, анорексія (90%) і занепад сил. Гепатомегалія і спленомегалія виявляються не завжди (25% випадків), аналогічну тенденцію відзначають і в відношенні лімфаденопатії. Також спостерігають прострацію і іноді летаргію. Жеовтяничність, незначна або відсутня (50% випадків). [8]

Петехии і екхімози (синці) спостерігають лише в тих випадках, коли має місце тромбоцитопенія. За даними Klag A.R. et al. середня або важка тромбоцитопенія спостерігалася у 28 собак з 42 (67%).

Інтенсивність анемії може варіювати і залежить від 2 факторів:

1) ступеня гемолізу

2) компенсаторною здатністю кісткового мозку.

Інтенсивність анемії при первинній АГА в порівнянні з вторинної більш виражена.

Досить рідко при виявленні холодових аглютинінінів (IgM), частіше при ідіопатичній АГА, анемія в цілому виражена помірно, з окремими епізодами посилення.

Ціаноз і некроз кінцевих частин тіла (вуха, пальці, хвіст, ніс) здатні еволюціонувати в гангрену, іноді з летальним результатом, є найбільш патогномонічнимі ознаками при даному захворюванні.

Всі ці ушкодження у собак і кішок пов'язані з порушенням кровообігу, що породжується агглютинацією еритроцитів в периферичних капілярах, де температура тіла значно нижче ніж в вісцеральній частині.



Розділ 2. Лабораторна діагностика аутоімунної гемолітичної анемії

2.1 Діагностичний алгоритм

Всі анемії є вторинними і зазвичай являють собою прояв основного захворювання. Тому диференціальну діагностику анемії можна умовно розділити на 2 етапи. На початковому етапі діагностичного пошуку основною метою є визначення так званого патогенетичного варіанту анемії, тобто основного механізму, який зумовив зниження рівня гемоглобіну в даному конкретному випадку. Фактично мова йде про синдромну діагностику, так як кожен з патогенетичних варіантів анемії є лише окремий синдром (залізодефіцитної анемії, гемолітичної анемії і т.д.). Цей етап діагностики здійснює лабораторія.

Наступний етап діагностичного пошуку - прерогатива лікаря. Після визначення патогенетичного варіанту анемії завданням лікаря є діагностика патологічного процесу, що лежить в основі даного анемічного синдрому, тобто виявлення причини анемії у конкретного хворого. [10]

Розпізнавання патогенетичного варіанту, як ми вже зазначили, базується на даних лабораторного дослідження і залежить багато в чому від рівня і якості цих досліджень, так і від правильного трактування отриманих даних.

У більшості випадків визначення патогенетичного варіанту анемії можливо на підставі комплексу рутинних лабораторних досліджень, які вважаються обов'язковими для проведення диференціального діагнозу при анемії.

До таких досліджень відносяться такі:

* визначення параметрів гемограми з використанням гематологічного аналізатора (табл. 2.1)

* аналіз мазка крові з метою підрахунку кількості ретикулоцитів і лейкоцитарної формули;

* біохімічне дослідження сироватки крові на предмет вміст заліза загальної залізозв'язувальної здатності сироватки, а також рівня феритину;

* мікроскопічне дослідження пунктату кісткового мозку.

Таблиця 2.1. Гемограма з гематологічного аналізатора

Норми показників у дорослих тварин	Кішки	Собаки
Лейкоцити (WBC)	5,5 - 18,5	4,5-11,0*109/л
Еритроцити(RBC)	5,3 - 10,0	5,26-6,57
Гемоглобін(HGB)	8 - 15 г/дл	14-18 г/дл
Гематокрит(HCT)	28 - 49%	39 - 56%
Средний объем эритроцита (MCV)	39-55 фл	60-77фл
Середній вміст гемоглобіну в еритроциті (МСН)	13-17пг	19-24,5пг
Середня концентрація гемоглобіну в еритроциті (MCHC)	30,0-36,0г/дл	32,0-36,0г/дл
Показник розподілу еритроцитів в об'ємі (RDW)	6,6 - 9,4%	5,2 - 8,4 %
Тромбоцити (PLT)	300 - 630	130-400*109/л

При діагностиці аутоімунної анемії необхідно виключити інші чинники, що сприяють виникненню вищевказаної патології, до них можна віднести:

· Паразити еритроцитів (присутній імунний компонент):

- Mycoplasma spp .;

- Babesia canis, Babesia gipsoni, Babesia vogeli (собаки);

- Cytauxzoon felis (кішки);

- Ehrlichia canis (собаки).

· Інфекційні агенти, здатні гемолізовати і \ або скорочувати тривалість життя еритроцитів:

- лептоспіри (Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira canicola);

- стрептококи (Streptococcus canis, Streptococcus zooepidermicus, Streptococcus equisimilis);

- патогенні стафілококи (Staphylococcus intermedius);

- клостридії (Clostridium perfringens, Cl.nivyi, Cl.septicum, Cl.sordelli, Cl.chauvoei).

· Вплив на мембрани еритроцитів або гемоглобін медикаментів, хімічних речовин, отрут, речовин рослинного походження:

- адетомінофен (парацетамол);

- метиленовий синій;

- бензокаїн;

- феназопірідин (кішки);

- метіонін (кішки);

- вітамін К (собаки);

- пропіленгліколь (кішки);

- нафталін (собаки);

- надлишок Zn, Cu (собаки);

- менадіон (собаки);

- переїдання лука (від 15 г \ кг) і деяких різновидів капусти;

- отруєння свинцем;

- отрути змій.

· Фрагментація крові

- ДВС-синдром (головним чином, собаки);

- дирофіляріоз (венокавальний синдром у собак);

- гемангіосаркома (собаки);

- васкуліти;

- синдром гемолітичної уремії.

· Гіпоосмомолярність - введення гіпотонічної рідини.

· Гіпофосфатемія

- тварини з діабетом і кетоацидозом після інсулінотерапії;

- печінковий ліпідоз (кішки);

- перегодовування (собаки дрібних порід).

· Спадкові дефекти еритроцитів

- дефіцит піруваткінази (кішки, собаки - у биглей і басенджи);

- дефіцит фосфофруктокінази (собаки - у спанієлів);

- спадковий стоматоцитоз (слабка анемія у собак);

- еритропоетична порфірія (кішки);

- спадкові несфероцитарні гемолітичні анемії невідомої етіології (пуделі, біглі);

- ідіопатичне підвищення осмотичної стійкості еритроцитів (кішки - абисинські і сомалійські);

- спадковий сфероцитоз (собаки);

- пов'язаний з хондродисплазія дефект еритроцитів у аляскинских маламутов.

· Інші причини

- гіперспленізм (руйнування в селезінці не тільки змінених, а й нормальних еритроцитів - буває пов'язано зі спленомегалією і викликано ноепластичними або запальними процесами, лінійними порушеннями кровообігу або ідіопатачними факторами);

- перекрут селезінки (собаки);

- злоякісний гістіоцитоз (собаки - відбувається підвищений фагоцитоз еритроцитів);

- гемофагоцитарний синдром;

- гемолітична анемія невідомої етіології (кішки).

Діагностичний алгоритм:

- Не-імунологічні тести: Загальний підрахунок крові (CBC), підрахунок ретикулоцитів, морфологія крові, біохімія крові та уріналізис.

Попередній діагноз часто можна поставити, коли мазок крові показує відповідну морфологія еритроцитів і інші причини анемії вже виключені.

- імунологічні тести: прямий антиглобуліновий тест (відомий і під назвою прямий Куумбс-тест (direct Coomb's test). Ним визначають антитіла або комплемент на еритроцити. Тест позитивний в 60-70% випадків для собак з АГА.

Використовуються і тести з поліспецифічними агентами, за допомогою яких визначають IgG, IgM і C3 на поверхні еритроцитів. Спектр їх активності набагато ширше, ніж прямий Куумбс-тест:

- Coomb's test, використовуючи окремі, специфічні реагенти для IgG, IgM і C3;

- Прямий ензим-зв'язуючий антиглобулін тест (Direct enzime-linked antiglobulin test) який визначає кількісно рівень IgG, IgM і C3 на поверхні еритроцитів;

- Папаін-тест (Papain test), який модифікує мембрани еритроцитів таким чином, що робить її більш чутливою до аглютинації і таким чином дозволяє легше визначити неповні антитіла (incomplete antibodies);

- радіоіммуноаналіз (radioimmunoassays), який визначає кількісно рівень IgG, пов'язані з еритроцитами. [11]

Диференціальну діагностику аутоімунної гемолітичної анемії у собак слід проводити від інших типів анемії, а також хвороб, що протікають з клінічно схожою картиною - гепатитів різної природи, лептоспірозу, лістеріозу та ін.

Діагноз ставлять на підставі анемії, характерних виявляються сфероцитів і позитивної реакції на лікування преднізолоном.

У більшості випадків дослідження крові показує ознаки еритроїдної регенерації, як наприклад поліхромазія і ретикулоцитоз, але в деяких випадків у собак вони відсутні, стан, відомий під назвою арегенератівна анемія.

Клінічний аналіз крові

При наявності АГА число еритроцитів падає нижче 5000000 / мл. Гематокрит сильно знижений (до 8-10%), аналогічну картину спостерігають відносно гемоглобіну (до 4 г / 100 мл). Відзначають нормоцитарну, нормохромну і іноді макроцитарну анемію. Звертає на себе увагу наявність дрібних забарвлених сфероцитів.

Часом ми констатуємо фагоцитоз еритроцитів моноцитами. АГА у собак частіше має регенеративну форму. Загальна кількість ретикулоцитів варіює від 20 до 60%. У 30% собак відзначають слабо виражений ретикулоцитоз (1-3% ретикулоцитів), у 60% він помірний або важкий (більше 3% ретикулоцитів). У собак були описані слабо регенеративна і арегенеративна АГА. В даний час ці форми захворювання виявляються все частіше. [15]

Біохімічний аналіз крові

У всіх собак відзначають виражену білірубінурію (коричневе забарвлення сечі) з уробілінурією, а також гіпербілірубінемію (не прямий білірубін). При цьому помітне зниження гаптоглобіну і сироваткового заліза, тоді як урикемія (сечова кислота в крові) зростає в 50% випадків. При розвитку захворювання показники варіюють, іноді зміни тривалі або перериваються з подальшими рецидивами.

2.2 Куумбс-тест на визначення АГА

Прямий тест Кумбса

Цей метод в діагностиці АГА є пріоритетним. Тест Кумбса - це імунологічний метод, за допомогою якого визначають наявність не аглютинуючих антитіл завдяки дії ксеногенної (від іншого виду) антііммуноглобулінової сироватки, що провокує аглютинацію. За допомогою одного лише прямого тесту Кумбса ставлять діагноз на дане захворювання. У клінічній практиці цей метод використовують для людини, собаки і кішки.

Принцип роботи прямого тесту Кумбса, або так званого спеціального видового антиглобулінового тесту, заснований на ефекті сенсибілізації еритроцитів за допомогою імуноглобуліну або комплементу, що фіксуються на їх мембрані, або за рахунок і одного і іншого разом.

Механізм пропонованого методу полягає в тому, щоб за допомогою видоспецифічних «анти-антитіл» або специфічних антиглобулінів створити містки між антитілами, які покривають поверхню еритроцитів.

На першому етапі використовують полівалентні антиглобуліни, спрямовані проти всіх сироваткових глобулінів.



Класифікація

Для собак в діагностиці використовують один полівалентний антиглобулін, іноді три антиглобуліна: один полівалентний і два специфічних - анти-lgG і анти-СЗ.

* За допомогою специфічних реагентів встановлено, що найчастіше еритроцити сенсибілізуються тільки одними IgG (АГА типу IgG), або IgG в поєднанні з комплементом (АГА змішаного типу), зокрема з C3d, експресуватися (присутнім) на мембрані еритроцитів.

* Іноді причиною сенсибілізації еритроцитів служить один лише комплемент (АГА комплементного типу). Цей тип анемії пов'язаний виключно з дією IgM, оскільки IgM при постановці тесту Кумбса зазвичай елюються спонтанно в процесі промивки. В даному випадку після промивання при 37 °C на поверхні еритроцитів залишається тільки C3d.

IgM можна виявити через антикомплемент при використанні методу Кумбса, або за допомогою цього ж методу, але проведеного на холоді, при якому елюювання IgM в процесі промивки не відбувається. При цьому ми говоримо про холодові аглютиніни IgM, коли при + 4°С у собак можна спостерігати спонтанну аглютинацію. Антитіла класу IgA зустрічаються вкрай рідко.

Кожен антиглобулін володіє видоспецифічними властивостями. Постановка реакції Кумбса з котячими еритроцитами означає необхідність своєчасного приготування або придбання антиглобулінового реагенту для цього виду тварини. Набори, призначені для проведення даного тесту у людини або собаки, для кішок непридатні.

У домашніх м'ясоїдних АГА, які виявляються за холодовими антитілами, зустрічаються набагато рідше, ніж з тепловими.

Техніка виконання

Кров для аналізу необхідно брати з антикоагулянтом (цитрат або ЕДТК - етилендіамінотетраоцтова кислота). Вкрай важливо, щоб в середовищі, яке перебуває пробірці, містився агент, що викликає хелатування кальцію. У зразку крові він провокує неспецифічну фіксацію комплементу на еритроцитах в умовах in vitro і призводить до помилково позитивної реакції. Саме тому гепарин не використовують в якості антикоагулянту.

Після ретельної відмивання (трьох або п'ятикратне центрифугування від 15 хв при 800Д до 5 хв при 1500д) тестований зразок суспензії доводять до 2% концентрації. Пряму реакцію Кумбса рекомендується проводити якомога раніше з моменту взяття матеріалу, бажано протягом 2 годин. Зразок крові варто зберігати при температурі 37 °С. Після інкубації протягом однієї години при 37 °С з різними серійним розведеннями трьох антисироваток зразок витримують в умовах кімнатної температури (1-1,5 години). Результати реакції враховувати візуально в лунках мікроплашок, поміщених на дзеркало Кана, або за допомогою мікроскопа (х100).

Паралельно необхідно проводити негативні контролі:

1. 2% суспензія еритроцитів хворого в присутності ізотонічного розчину NaCI з метою перевірки здатності тестованих еритроцитів на спонтанну аглютинацію за відсутності антиглобулінов. Аутоаглютиніни відповідають за спонтанну ауто аглютинацію як при 37 °С (клас I), так і при 4 °С (клас IV). У кішок аутоаглютинація еритроцитів зустрічається часто. Розведення крові в еквівалентному обсязі ізотонічного розчину NaCI дозволяє виключити вказаний факт за рахунок дисоціації еритроцитів, що мають форму трубочок, не надаючи при цьому негативного ефекту на справжні аутоагглютініни.

2. Змішування 2% суспензії еритроцитів здорового собаки (контрольна тварина) з видоспецифічною сироваткою антиглобулінів дозволяє перевірити якість антисироватки.

Цей тест не прийнятний для кішок. Справа в тому, що у багатьох нормальних кішок є неаглютінуючі антитіла, які стають активними в умовах більш низької температури і виявляються за допомогою прямого тесту Кумбса при 4 °С. У даного виду тварин слід використовувати метод непрямої гемаглютинації при 4 ° С.

Лабораторна діагностика АГА майже повністю заснована на прямому методі Кумбса в поєднанні із загальним аналізом крові. Інтерпретація позитивної реакції в тесті Кумбса не викликає складності.

* Якщо виявлені антитіла відносяться до класу IgG, то досить імовірно, що виявлена анемія має аутоімунне походження.

* Значимість виявлення позитивного результату в пробі Кумбса типу «lgG + комплемент» при АГА змішаного типу вимагає обговорення, оскільки немає повної впевненості в тому, що фермент фіксується на комплексі, утвореному IgG з антигенами мембрани еритроцитів.

* Виявилося, що ще складніше встановити достовірність сенсибілізації еритроцитів при АГА, яка виникає за допомогою позитивного тесту Кумбса в постановці реакції на «чистий комплемент».

Можливо, частина тестів Кумбса типу «комплемент» відповідає тимчасовій фіксації комплексів антаген-антитіло, які швидко елюються з поверхні еритроцитів.

Іноді тест Кумбса дає хибно-позитивний або помилково-негативний результат (табл. 2.2.). Це буває досить рідко (приблизно в 2% випадків), але негативна реакція на тест Кумбса може проявлятися при істинній АГА, особливо якщо кількість фіксованих імуноглобулінів недостатньо (менше 500 на один еритроцит).

Таблиця 2.2. Облік результатів прямого теста Кумбса

Помилково-позитивні	1. Антитіла, що фіксовані на еритроцитах і специфічні к бактеріям, паразитам (Haemobartonella, Babesia) або лікарські засоби 2. Неспецифічна адсорбція сироваткових білків новонародженими еритроцитами 3. Неоплазії (адсорбовані імунні комплекси) 4. Антисироватки з антитрансфериновою активністю 5. Переливання крові (постттрансфузійні аллоантитіла) 6. Наявність вільних іонів Са в пробірці зі зразком крові (гепарин): не імунна( не специфічна) фіксація комплемента на еритроцитах
Помилково-негативні реакції · Технічні проблеми	1. Спонтанне елюювання антитіл при відмиванні або дуже довготривала затримка з додавання зразку крові 2. Антисироватки не адаптовані по титру або специфічності( відсутність видивої специфічності) 3. Антисироватка с занадто високим титром 4. Температура тестування відрізняється від температури активізуючої антитіла - холодові аглютиніни (IgM) виявляють винятково за температури 37 С
· Біологічні проблеми	1. Паціент знаходиться в фазі ремісії 2. Занадто мала кількість антитіл, які фіксуються на еритроцитах( нижче порога чутливості використованого метода): 100-500 IgM/еритроцит 3. Подавлення антитіл в процесі лікування

Клінічні симптоми АГА багато в чому схожі з піроплазмозом. Це вимагає від клініциста систематичного проведення тесту Кумбса в разі гемолітичної анемії при відсутності позитивної відповіді на класичне лікування, при захворюванні тварини піроплазмозом, навіть якщо встановлена персистенція піроплазм в крові, тому що це захворювання може одночасно супроводжуватися АГА.

Елюювання

Якщо за допомогою методу Кумбса можна визначити, до якого класу відносяться сенсибілізовані антитіла, то елюювання дозволяє визначити їх специфічність. Елюювання при високій температурі за допомогою ефіру або кислоти дозволяє зібрати пул антитіл і протестувати їх на панелі з еритроцитами відповідного виду за допомогою непрямого методу Кумбса.

Це в основному проводять в гуманій медицині, де є панелі з типова ними еритроцитами. [8]

У тварин елюювання кислотою має особливе значення при підозрі на помилково-позитивну реакцію специфічних антитіл до антигену, штучно фіксованому на поверхні еритроцитів. Якщо елюат, отриманий від еритроцитів собаки, підозрюваної на захворювання, не дає реакції аглютинації з пулом еритроцитів, отриманих від собак з різними групами крові, то мова йде про АГА.



Непрямий метод Кумбса

Принцип його полягає в тому, щоб виявити наявність вільних аутоантитіл в сироватці крові проти еритроцитів.

Кров хворого собаки потрібно зібрати в чисту суху пробірку і відцентрифуговувати. Тестовану сироватку інкубують в присутності еритроцитів, тричі відмитих і отриманих від здорової собаки тієї ж групи крові, що і хвора тварину. Рівень кількості вільних аутоантитіл в сироватці часто буває дуже низьким, оскільки всі присутні антитіла щільно зафіксовані на поверхні еритроцитів. У 40% випадків кількість вільних антитіл буває недостатнью, щоб отримати позитивну реакцію в непрямому методі Кумбса.

2.3 Мікроскопічна діагностика АГА

При анеміях, викликаних порушенням імунітету, ми, як правило, спостерігаємо регенеративну анемію. Гострий гемоліз, а також стимуляція еритропоезу проявляються на ранніх стадіях і інтенсивно.

Клінічний випадок захворювання собаки ілюструється аналізом крові (мазок, фото 1). На момент постановки діагнозу ми відзначаємо анизоцитоз і виражену поліхроматофілію.

Фото 1. Кров собаки. Об'єктив з імерсією х 100. May Grunwald Giemsa. 1 - Еритроцити великого діаметру з більш вираженим блакитним відтінком відрізняються від інших еритроцитів, що відносяться до ретикулоцитів. 2 - Еритроцити малого діаметра, дуже щільні, без світлого центру = Сфероцит. 3 - Еритроцити з незначно зміненої морфологією.

Висновок: яскраво виражений анізацитоз і поліхроматофілія з наявністю сфероцитоз. Лейкоцит (вгорі праворуч) є моноцитом. З його лівого боку візуалізуються тромбоцити.

У даній ситуації ми маємо справу з молодими еритроцитами (ретикулоцитами) великого діаметра, центральна частина (зона росту) яких має сірувато-білуватий відтінок і часто знебарвлена.

Такий тип цитологічної картини можна спостерігати і в разі підвищеного гемолізу або вираженою геморагії. Одним з патогномонічних ознак, що свідчать про імунну природу порушення, є присутність в мазках більшої кількості еритроцитів малого діаметра в порівнянні з нормою.

В даному випадку мова йде про еритроцити, які втратили форму диска і стали сферичними. В цілому це обумовлено специфічним впливом імунологічних факторів. Такі еритроцити називають сфероцитами.

Про феномен опосередкованої імунної реакції свідчить їх кількість 20-30% від всіх еритроцитів у мазку крові, що досить легко виявляють у собак. Подібну цитологічну картину у кішки в зв'язку з малим діаметром еритроцитів і слабо вираженою блідістю їх центральній частині (видова особливість) ми не спостерігаємо.

Фото 2. Кров собаки. Об'єктив з імерсією х 100. May Grunwald Giemsa. 1 - ацидофільні еритробласт 2 - Еритроцити з тільцем Жолі

Ми спостерігаємо картину, як і на фото 1: виражений анізоцитоз, поліхроматофілію і сфероцитоз. Лейкоцит (вгорі праворуч) є нейтрофілом.

Мазок крові також необхідний для того, щоб виключити анемію паразитарної (бабезіоз) або інфекційної (гемобартонелльоз) природи. Анемії, що виникають внаслідок гострого гемолізу еритроцитів при аутоімунній реакції, часто супроводжуються інтенсивним еритропоезом. Про це свідчить наявність в крові ацидофільних еритробластів, поліхроматофільних еритроцитів, що містять нуклеарні фрагменти (тільця Жолі). Ці форми еритроцитів також можна виявити в крові у собаки і кішки при злоякісній гемопатіі, захворюваннях селезінки, отруєнні свинцем і т. д. Вони не відносяться до патогномонічних ознак. З іншого боку, коли аутоімунний гіпергемоліз еволюціонує в хронічний перебіг, то регенеративна анемія менш виражена. При тривалому захворюванні можна спостерігати розвиток мієлофіброза.

При АГА іноді макроскопічно візуалізується аглютинація в краплях крові, поміщених на предметне скло. Цей феномен спонтанної аутоагглютінаціі вказує на наявність антитіл на поверхні еритроцитів. Їх слід диференціювати від стовпчиків еритроцитів, що утворюються в результаті запальної реакції шляхом розведення краплі крові в краплі ізотонічного розчину. Згустки еритроцитів зникають при запальному процесі, якщо вони не повністю покриті антитілами (Ig G). Вони залипаються (фото 3), якщо мова йде про ізотипи антитіл IgМ (повноцінні Ас).



Фото 3. Кров собаки. Об'єктив х 20. Обстеження матеріалу на предметному склі з покривним склом без забарвлення після розведення в фізіологічному розчині. 1 - Аглютинація еритроцитів.

Еритроцити в формі згустків (аглютинуючі) у кішки спостерігають у разі гемолітичної імунної анемії. Ми також відзначаємо персистенцію еритроцитів великого діаметра блакитно-фіолетового забарвлення (ретикулоцитів). Формені елементи меншого діаметру з іррегулярним контуром червонувато-фіолетового кольору (азурофіли), тробоцити.

У кішки гемолітичні анемії супроводжуються анізоцитозом і поліхроматофілією, але сфероцитоз не піддається підрахунку. Як і у собаки, іноді ми спостерігаємо агглютинати. Їх можна легко сплутати в мазках крові зі стовпчиками еритроцитів, які часто спостерігають у представників даного виду в основному при запаленні (фото 4, 5).

Фото 4. Кров кішки. Об'єктив з иммерсией х 100. May Grunwald Giemsa.



Фото 5. Кров кішки. Об'єктив з иммерсией х 100. May Grunwald Giemsa. Наявність стовпчиків еритроцитів внаслідок запалення. Ми також відзначаємо пойкілоцитоз (еритроцити варіюється форми).

При гострій АГА ми часто відзначаємо виражений лейкоцитоз з появою в крові слабо диференційованих нейтрофілів (метамієлоцити і мієлоцити). Цитохимічний і цитоферментний аналізи (судан чорний, мієлопероксидаза і т.д.) підтверджують наявність клітин мієлоїдного ряду. Раптова поява вираженої регенеративної анемії, що супроводжується лейкемоїдною реакцією, свідчить про порушення імунної природи. Тим не менш, деякі анемії викликані порушенням імунітету, протікають при нормальній кількості лейкоцитів, іноді з лейкопенією.

Кількість тромбоцитів також сильно варіюється. Ми відзначаємо тромбоцитоз (реактивний, як і лейкоцитоз).

Диференціальну діагностику гемолітичних анемій імунної природи у кішок необхідно проводити з гемобартенелезом, який іноді супроводжується «реактивним» моноцитозом, звідки і реакція, що протікає по лейкомоїдному..



Фото 6. Кров собаки. Об'єктив з иммерсией х 100. May Grunwald Giemsa.

Присутність лейкоцитів зі слабо диференційованим ядром (слабо виражені часточки і їх відсутність). Видається неможливим провести ідентифікацію за допомогою класичної забарвлення по May Grunwald Giemsa.

Візуалізується персистенція трьох лімфоцитів (округле ядро з вираженим нуклеоплазматичним індексом).

Фото 7. Кров кішки. Об'єктив х40. May Grunwald Giemsa. Лейкімоідная реакція внаслідок емобартенеллеза. Наявність великої кількості моноцитів.

Іноді ми спостерігаємо неправдиву поліхроматофілію, викликану дизеритропоезом. Вона проявляється вираженим макроцитозом на рівні еритроцитів, аномальних еритробластів і змін мієлограми, що дозволяє проводити диференційну діагностику.

Деякі цитологічні модифікації крові є реперами гемолітичної анемії імунної природи (зокрема сфероцитоз і персистенція аглютинації). Однак тільки тест Кумбса (прямий і непрямий) дозволить підтвердити й уточнити природу порушення.



Висновок

Вирішальне значення в діагностиці анемій з урахуванням клінічного стану тварини надається аналізу морфологічної картини червоної крові, включаючи визначення її кількісних і якісних показників, в тому числі вмісту гемоглобіну та еритроцитів. Також велику роль у встановленні характеру та патогенезу анемічного стану грають прижиттєві дослідження кісткового мозку та визначення функціонального стану еритроцитів, зокрема резистентності, термінів життя, типу гемоглобіну. Коли клінічна картина досить показова, то за допомогою тільки одного прямого методу Кумбса можна поставити діагноз на АГА. Але це стосується лише позитивної реакції тесту Кумбса в присутності IgG (як разом з комплементом, так і без нього). В цілому, позитивні реакції з одним лише комплементом часто зустрічаються у собак і рідко асоціюються з вираженим гемолізом. Якщо поставлений попередній діагноз, то необхідно проведення додаткових досліджень. Як і при всіх аутоімунних захворюваннях, неспецифічні порушення в імунній системі можуть бути викликані різними причинами.

І, нарешті, всі аутоімунні захворювання мають подібності, причому кожне представляє групу порушень, які в тій чи іншій мірі нашаровуються один на одного. Нерідко, можна спостерігати одночасний або послідовний прояв АГА і системнох червоної вовчанки, АГА і ревматоїдного поліартриту, або АГА і аутоімунної тромбоцитопенії. Якщо за допомогою постановки імунологічного діагнозу виявлено наявність одного з цих аутоімунних захворювань, то потрібно обов'язково шукати і інші навіть при відсутності характерних клінічних симптомів.



Список використанної літератури

1. Альбова Е.В. О морфологии эритроцитов при некоторых видах анемии, лейкозах, заболеваниях печени и влиянии на неё цианокобаламина (витамина Вп) // Сб. научн. гр. Крымского мед. Ин-та.: Эмбриология и морфология. Симферополь. 1970 -Т.44, №3. - с. 142-153.

2. Алмазов В.А., Рябов С.И. Методы функционального исследования системы крови.-JL: -1963.-с. 23-48.

3. Альперин П.Н. Клиника гемолитических анемий. Клинич. Медицина. -№11. -1951.-38 С.

4. Ахундова А. М., Тер-Мкртычева О. X. О взаимоотношении апластиче-ских состояний кроветворения с острым лейкозом. //Проблемы гематологии и переливания крови. 1961. - №10. - с. 31.

5. Белов А. Д., Данилов Е. П. и др. Болезни собак. Москва.: ВО «Агропромиздат», 1990. - с. 133-135. Дыгин В.П. Аутоиммунные заболевания системы крови. Л.: Медицина -1964.-222 С.

6. Мосягина E.H. Эритроцитарное равновесие в норме и патологии. Москва.: Гос. издат. мед. литератры, 1962.-270 С.

7. Петров В.А., Сазонова В.В., Тихонова A.A. Дифференциальная диагностика гемолитической анемии различной этиологии у собак // Ветеринария. Современные аспекты и перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции.- 4.1. - Орел, 2002. - с. 80.

8. Поляк А.И., Нетреба Г.К. Особенности моделирования анемии у некоторых лабораторных животных. /Моделирование, методы изучения и экспериментальная терапия патологических процессов. Москва, 1973. - с. 62-64.

9. Рябов С.И. Основы физиологии и патологии эритропоэза. Ленинград.: 1971.-255 С.

10. Сазонова В.В. Новое в диагностике анемии кошек. // Ветеринария, 2001. № 3. С. 54.

11. Сазонова В.В. Диагностическое значение СОЭ при анемиях различной этиологии мелких животных. // Ветеринария. Современные аспекты и перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции,- 4.1. - Орел, 2002. - с. 104.

12. Сазонова В.В. Гемолитическая анемия у собак, несущих службу в экстремальных условиях. // Актуальные проблемы ветеринарной медицины, посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии: Материалы международной научно-практической конференции. Т. 2. - Ульяновск, 2003. - с. 133.

13. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования (Под ред. Кост Е.А. Москва, 1975. - с. 25-31,75-84,228-231

14. Ужанский Я.Г. Физиология системы крови. Л.: Медицина, 1968. - 68 С.

15. Хазипов Н.З., Аскарова А.Н. Биохимия животных. ~ Казань, 1999. с. 251-261.

Размещено на Allbest.ru

...