Главная Коллекция "Revolution" Сельское, лесное хозяйство и землепользование Агробактеріальна трансформація ярого ріпаку без етапу регенерації in vitro

Агробактеріальна трансформація ярого ріпаку без етапу регенерації in vitro

Процес трансформації ярого ріпаку за допомогою Agrobacterium tumefaciens методом in planta. Проведення оцінки резистентності отриманих форм ріпаку до гербіциду із діючою речовиною фосфінотріцин. Відбір форми, які успадкували стійкість до гербіциду.

Рубрика Сельское, лесное хозяйство и землепользование
Вид статья
Язык украинский
Дата добавления 09.01.2019
Размер файла 14,9 K
рефераты на заказ со скидкой

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

158

Уманський національний університет садівництва

Агробактеріальна трансформація ярого ріпаку без етапу регенерації in vitro

C.В. Богульська, аспірант

Анотація

Оптимізовано процес трансформації ярого ріпаку за допомогою Agrobacterium tumefaciens методом in planta. Проведено оцінку резистентності отриманих форм ріпаку до гербіциду із діючою речовиною фосфінотріцин. Відібрано форми, які успадкували стійкість до гербіциду.

Ключові слова: ярий ріпак, агробактерії, трансформація, метод in planta, фосфінотріцин.

Основний зміст дослідження

Постановка проблеми. Ярий ріпак успішно культивують у зонах ризикованого вирощування озимого ріпаку. Він є доброю страховою культурою. У несприятливі роки при вимерзанні озимого ріпаку площі можна пересіяти ріпаком ярим. Для отримання високих врожаїв ярого ріпаку потрібні ефективні засоби боротьби із бур'янами. Використання гербіцидів суцільної дії майже повністю вирішує цю проблему.

Аналіз останніх досліджень та публікацій. На сьогодні створено багато генетично модифікованих сортів та гібридів різних сільськогосподарських культур: сої, кукурудзи, люцерни, буряка та ін. Починаючи з середини 1990-х років, американська компанія Monsanto та німецька компанія Bayer Crop Science створили генетично модифікований ріпак, стійкий до гербіцидів гліфосату (Monsanto) та глюфозинату (Bayer Crop Science) [2].

Для створення трансгенних рослин використовують природну систему трансформації Ті-плазмід (від англ. Tumor inducing plasmid) ґрунтових агробактерій Agrobacterium tumefaciens [1]. Унікальні біологічні властивості Ті-плазміди роблять її ідеальним природним вектором для переносу генів. Ті-плазміда має широке коло господарів, вона вбудовує Т-ДНК (від англ. Transforming DNA - трансформуюча ДНК) в хромосоми рослин, де може реплікуватися, а її гени транслюються з утворенням білка. Границі Т-ДНК визначені прямими послідовностями, які повторюються довжиною 25 нуклеотид - них пар, будь-який фрагмент чужорідної ДНК, вставлений між цими повторами, буде перенесений в рослинну клітину. Однак маніпуляції з Ті-плазмідою ускладнені через великі розміри, вставити ген в плазміду традиційним шляхом не можливо. Тому, Ті-плазміда була модифікована генно-інженерними методами та на її основі були отримані вектори для трансформації рослин [3].

Вектор повинен містити послідовність гена, який потрібно ввести в геном рослини, та знаходитися під контролем промотора, що здатен експресуватися в рослинній клітині. Окрім функціональних генів вектор повинен мати маркерні гени трансформації. В якості маркера використовують гени стійкості до антибіотиків та гербіцидів [6].

Чужорідні гени в рослини ріпаку можна вводити прямими методами (біобалістичний, електропорація мікроін'єкція ДНК та ін.) та непрямими за допомогою агробактерій [3]. Для непрямого введення Т-ДНК використовують метод, який називається in planta і запропонований Bechtold зі співавторами у 1993 році. Ефективність подібної трансформації залежить від вибору рослини реципієнта, тому універсальної методики агробактеріальної трансформації ріпаку не існує і розробка методів трансформації лишається актуальною [7].

Мета і завдання. Метою дослідження була апробація трансформації рослин ярого ріпаку методом in planta, отримати форми ярого ріпаку резистентні до гербіциду із діючою речовиною фосфінотріцин.

Для досягнення мети були поставлені завдання:

1) оптимізувати умови агробактеріальної трансформації in planta;

2) провести аналіз стійкості до гербіциду отриманих форм ярого ріпаку.

Матеріали і методика дослідження. Дослідження проводили в лабораторії і на дослідних ділянках кафедри генетики, селекції рослин та біотехнології Уманського національного університету садівництва впродовж 2010-2013 років.

Для трансформації використовували штам Agrobacterium tuimfaciens LBA4404 з плазмідою, яка містить bar-ген, що визначає стійкість до гербіциду із діючою речовиною фосфінотріцин - Баста. Плазміда має селективні гени стійкості до антибіотиків та поставлена під промотер 35S CaMV вірусу мозаїки цвітної капусти [4]. В якості реципієнта взято сорти ярого ріпаку Добробут, Айдар та ВНІС 100.

Агробактерії протягом двох діб нарощували в рідкому середовищі LB з додаванням антибіотиків (50 мг/л канаміцину, 50 мг/л рифампіцину та 25 мг/л гентоміцину). Культивування проводили на качалці (150-200 об/хв) в темноті при температурі 28°С. Перед інокуляцією рослин в бактеріальну суспензію додавали сахарозу та поверхнево-активну речовину Silwet L-77 [5].

Суцвіття ріпаку ізолювали пергаментними ізоляторами до розкриття квітів. Після розкриття більшості квітів рослини обробляли суспензією агробактеріальних клітин. Інокуляцію проводили шляхом занурення квіток у бактеріальну суспензію, час інокуляції складав 1 хв., після цього рослини залишали на 24 години в умовах підвищеної вологості. Потім ріпак ізолювали пергаментними ізоляторами до отримання насіння.

Результати досліджень. Бактеріальною суспензією було оброблено: 67 рослин сорту Айдар, 58 рослин сорту ВНІС 100 та 85 рослин сорту Добробут. Насіння з даних рослин висівали в грунт згідно зі строками посіву ярого ріпаку. Отримали сходи ярого ріпаку у такій кількості: сорт Айдар - 870 рослин, сорт ВНІС100 - 638 рослин, сорт Добробут - 1251 рослина.

Відбір фосфінотріцин-резистентних форм проведено по сходах ріпаку, у фазі розвитку 4-6 пар листків шляхом обприскування рослин гербіцидом Баста 7 мл/л. Після обприскування гербіцидом на четвертий день більшість рослин стали "білими" і загинули (табл.1).

Усього загинуло: 865 рослин сорту Айдар, 631 рослина сорту ВНІС 100 та 1242 рослини сорту Добробут, не стійкі до дії гербіциду. Рослини ріпаку Т0, які вижили після дії гербіциду, мали зелене забарвлення та подовжували розвиватися згідно з фазами онтогенезу. Вижили рослини у такій кількості: Айдар - п'ять рослин, ВНІС 100 - чотири рослини та Добробут - девять рослин. Таким чином, частота трансформації ярого ріпаку становила: у сорту Айдар - 0,6%, сорту ВНІС 100 - 1,1% та у сорту Добробут - 0,7%.

Таблиця 1. Частота трансформації Т0 форм ярого ріпаку, отриманих методом in planta (2012 р.)

Сорти ріпаку

Рослин

Отримано трансформантів к-ть

всього

загинуло

шт.

%

Айдар

870

865

5

0,6*±0,08**

ВНІС 100

638

631

4

0,6*±0,1**

Добробут

1251

1242

9

0,7*±0,05**

Примітка: * - достовірно за використання коефіцієнта Стьюдента (р = 0,05); ** - ± стандартна похибка.

З метою вивчення успадкування ознаки стійкості рослин ярого ріпаку до дії гербіциду одержали форми ріпаку у результаті самозапилення. Враховуючи гетерозиготність матеріалів за трансформованим геном, у результаті самозапилення теоретично ми одержали генотипи: нетрансгенний, гетерозиготний і гомозиготний за геном стійкості, у співвідношенні 1: 2:

1. За фенотипом нестійкі рослини виділили, провівши обприскування гербіцидом, при цьому вони загинули. Тому, співвідношення між кількістю нестійких і фосфінотрицин-резистентних особин має становити 3: 1 (табл.2).

Таблиця 2. Успадкування Т1 ярого ріпаку фосфінотріцин-резистентності (2012 р.)

Сорти

ріпаку

Всього рослин

Но*

c2*

до обробітку

загинуло

резистентний

шт.

%

шт.

%

шт.

%

Айдар

308

100

89

28,9

219

71,1

3: 1

2,4935

ВНІС 100

329

100

91

27,7

238

72,3

3: 1

1,2412

Добробут

383

100

104

27,2

279

72,8

3: 1

0,9707

Примітки:

1. Но* - теоретично очікуване співвідношення між нестійкими і толерантними рослинами;

2. Максимально допустиме значення С? *05 = 3,84; %2*0і = 6,63.

Усього у рослин сорту Айдар до обробітку гербіцидом було: 308 шт. рослин, що становить 100%, загинули 89 шт. рослин, що становить 28,9%, вижили 219 шт. рослин, що становить 71,1% відповідно. У рослин сорту ВНІС 100 до обробітку гербіцидом було: 329 шт. рослин, що становить 100%, загинули 91 шт. рослин, що становить 27,7%, вижили 238 шт. рослин, що становить 72,3% відповідно. У рослин сорту Добробут до обробітку гербіцидом було: 383 шт. рослин, що становить 100%, загинули 104 шт. рослин, що становить 27,2%, вижили 279 шт. рослин, що становить 72,8% відповідно.

Дані свідчать про експресію вбудованого гену bar та гетерозиготність вихідних трансгенних матеріалів за домінантним трансгеном. Відповідно до генетичних закономірностей у фертильних форм Т1 між рослинами, що загинули, і стійкими співвідношення становить 3:

1. Проведений статистичний аналіз одержаних результатів підтвердив його достовірність. Таким чином, трансген стабільно передається шляхом гібридизації і успадковується як домінантний. Рослини ярого ріпаку з перенесеними генами стійкості фенотипово не відрізнялися від звичайних, не трансгенних рослин.

ярий ріпак гербіцид фосфінотріцин

Висновки

Після обробки агробактаріальною суспензією ярого ріпаку методом in planta, отримано: п'ять стійких до гербіциду рослин сорту Айдар, сім стійких рослин сорту ВНІС 100 та дев'ять стійких до гербіциду рослин сорту Добробут. Відповідно, частота трансформації ярого ріпаку становила: у сорту Айдар - 0,6%, сорту ВНІС 100 - 1,1% та сорту Добробут - 0,7%.

Після самозапилення отриманих форм у поколінні ярого ріпаку Т1 відбулося розчеплення 3: 1, між не стійкими і стійкими рослинами, що вказує на експресію вбудованого гену стійкості та гетерозиготність вихідних матеріалів за домінантним трансгеном.

Список використаних джерел

1. Викторэк-Смагур А. Сравнение двух методов трансформации Arabidopsis thaliana: погружение цветочных почек и вакуумная инфильтрация / А. Викторэк-Смагур, К. Хнатушко-Конка, А.К. Кононович // Физиология растений. - 2009. - Т.56, № 4. - С.619-628.

2. Жиганова Л.П. Проблемы использования генетически модифицированных растений / Л.П. Жиганова // США, Канада: экономика - политика - культура. - 2001. - № 8. - С.105-127.

3. Агробактериальная трансформация ярового рапса (BRASSICA NAPUS L.) / [А.Н. Майсурян, В.Н. Овчинникова, Е.К. Серенко и др.]; Тезисы IX международная конференция "Биология клеток растений in vitro и биотехнология". - М., 2008. - С.112-224.

4. Ралдугина Т.Н. Стабильность и наследование трансгеннов в растениях рапса / Т.Н. Ралдугина, С.В. Горелова, А.В. Кожемякин. // Физиология растений. - 2000. - Т.47, № 3. - С.437-445.

5. Трагсгенез как способ повышения устойчивости растений к абиотическим стрессам / С.Е. Титов, A. B. Кочетов, B. C. Коваль [и др.] // Успехи соврем. биолог. - 2003. Т.123. - С.487-494.

6. Чумаков М.И. Агробактериальная трансформация неповрежденных растений / М.И. Чумаков, И.В. Курбанова Г.К. Соловова. // Физиология растений. - 2002. - Т.49, № 6. - С.898-903.

7. Bechtold D. In Planta Agrobacterium Mediated Gene Transfer by Infiltration of Adult Arabidopsis thaliana Plants / D. Bechtold, J. Ellis, G. Pelletier. // C. R. Acad. Sci., Life Sci. 1993. - V 316. - P.1194-1199.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

© 2000 — 2023, ООО «Олбест» Все права защищены