Особливості реалізації етапу ініціації експлантів культиварів роду Picea in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Культивування тканин хвойних порід in vitro було об'єктом досліджень протягом тривалого періоду. У світовій практиці технологію мікроклонального розмноження розроблено більш ніж для 25 видів хвойних рослин [6]. Одним з основних факторів, що впливає на успіх мікроклонального розмноження є склад живильного середовища, який відіграє домінуючу роль в ініціації калюсу з бруньок хвойних порід [2, 4, 10]. Існує велика кількість середовищ для культивування представників роду Picea in vitro. Питання росту і морфогенезу ізольованих бруньок видів цього роду у різних поживних речовинах у поєднанні з агаром в асептичних умовах і за однакових умов навколишнього середовища, світла, температури та аерації розглянуто у роботах V. Chalupa та ін. (1973, 1985). Низку інших середовищ при введенні в культуру in vitro Picea engelmannii рекомендує використовувати K.R. Patel (1986) [13]. Так, автор рекомендує культивувати експланти на середовищі MS з додаванням кінетину 0,5-4,0 мг/л; 6-БАП 0,053,0; 2,4-D 0,01-1,5; ІОК 0,01-10,0; НОК 0,01-10,0; ІМК 0,01-10,0 мг/л. Максимальний приріст біомаси калюсу було досягнуто у середовищі У MS з додаванням 2,4-D (2 мг/л) і 6-БАП (1 мг/л). Встановлено, що зниження концентрації мікроелементів, розведенням їх 1:1 збільшує частку експлантів Picea obovata, що утворюють калюс в 1,5-2,0 рази [9], а процес калюсогенезу знаходиться у прямій залежності від концентрації 2,4-D у живильному середовищі [1]. Рекомендована кислотність середовища знаходиться в межах рН 5,7±0,1 [12, 13].

У зв'язку із складністю культивування хвойних порід in vitro, на сьогодні існує обмежена кількість джерел, які стосуються мікроклонального розмноження видів роду Picea, а особливо їх культиварів та декоративних форм. Тому метою наших досліджень було виявлення оптимального складу живильних середовищ та максимально ефективних типів і концентрацій фітогормонів для росту та калюсогенезу експлантів Picea abies 'Nidiformis', Picea pungens 'Glauca' та Picea glauca 'Conica' на стадії ініціації in vitro.

Експерименти з мікроклонального розмноження культиварів роду проводили у лабораторії культури тканин кафедри лісових культур і лісової селекції НЛТУ України. Роботи виконували у ламінарних боксах, де постійно циркулює потік стерильного повітря. Кімнату ламінар-боксу попередньо стерилізували ультрафіолетовою лампою. Стіл ламінару ретельно протирали етиловим спиртом. Технічні засоби та інструменти піддавали стерилізації сухим жаром у сушильній шафі за температури 160-180°С протягом 1,5-2 год.

У ході досліджень використано середовища MS (Murashige and Skoog medium), RW (Risser and White medium), LM (Litvay medium) [4, 8, 14], які характеризуються різним вмістом макро-, мікроелементів та вітамінів і можуть бути використаними для культивування хвойних порід [4, 8, 13], доповнені різними концентраціями та комбінаціями фітогормонів (2,4-D (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота), НОК (а-нафтилоцтова кислота), 6-БАП (6-бензоламінопурин) та КТ (кінетин)). Як джерело вуглеводів використовували сахарозу.

Підготовку живильних середовищ проводили з використанням рекомендацій Ф.Л. Калинина та ін. (1992), Р.Г. Бутенко (1999) та ін., стерилізацію шляхом автоклавування за температури 120°С під тиском 0,75-1,0 кг/см2 впродовж 20 хв [2, 5, 6]. Як експланти використовували бруньки, які нарізали з бічних пагонів у верхній частині крони з шматком деревини. У лабораторних умовах бруньки піддавали стерилізації за відповідними методиками [3].

Культивування експлантів проводили у культуральній кімнаті за температури 23°С, відносної вологості повітря 65-70 %, освітлення в межах 1500-2000 люкс/м2 і світлового режиму 16 год день / 8 год ніч. Заміну середовища культивування проводили кожних 20 днів. Через кожні 10-12 днів культивування візуально оцінювали життєздатність експлантів та вираховували кількість експлантів, які утворюють калюс [7-9, 15].

Значний вплив на процес мікророзмноження має склад живильного середовища, з допомогою якого створюється вплив на реалізацію морфогенетичного потенціалу експлантів. Так, у разі використання середовища MS життєздатність експлантів культиварів роду була найнижчою (рис. 1).

Рис. 1

У цьому випадку обліковано 13,3 % експлантів Picea pungens 'Glauca' та 53,3 % Picea abies 'Nidiformis' і Picea glauca 'Conica', що знаходилися у задовільному стані (мали зелене забарвлення та продовжували накопичувати біомасу). Використання середовища LM дозволило отримати значно вищі результати життєздатності від 40 до 60 %. Проте активного росту експлантів не відбувалося. Кількість живих експлантів при застосуванні середовища за прописом RW була найбільшою (від 53,3 до 60 %). На цьому середовищі експланти характеризувалися добрим ростом та мали темно-зелений колір. У частині випадків спостерігали проліферацію щільного калюсу. Наведене середовище виявилося найефективнішим, тому його використання продовжили у подальших експериментах введення в культуру in vitro культиварів роду Picea.

Рис. 2

хвойний калюсоутворення мікроклональний

Для росту та стимуляції калюсоутворення та органогенезу при введенні в культуру in vitro на стадії ініціації важливим є використання екзогенних стимуляторів фітогормонів ауксинної та цитокінінної природи. Для виявлення впливу фітогормонів на ініціацію експлантів досліджуваних культиварів використано базове середовище RW у поєднанні з різними концентраціями та комбінаціями ауксинів та цитокінінів. При цьому застосовували десять варіантів їх поєднань. У ході наших досліджень диференціації клітин та індукції клітинного поділу, до складу живильних середовищ додавали різні концентрації фітогормонів, відбір яких проводили на основі їх найефективнішого використання у дослідженнях, наведених в опрацьованих літературних джерелах [7-9, 11, 12].

У ході експерименту успішно ініційовано більшість висаджених на середовище експлантів, які продовжували рости чи утворювали щільний калюс. У поодиноких випадках, не залежно від доповнення живильного середовища, спостерігали контамінацію ініційованих експлантів, що зумовлено наявністю внутрішніх інфекцій. Такі експланти зараховували до неініційованих та видаляли з культуральної кімнати.

Облік ініційованих експлантів (N, %) проводили на 20-й день культивування. Паралельно визначали відсоток ініційованих експлантів, на яких утворився калюс (n, %). Результати ініціації експлантів роду Picea залежно від вмісту фітогормонів представлено у табл. 1

Табл. 1. Ініціація та калюсогенез експлантів культиварів роду Picea на модифікованому живильному середовищі RW, %