Разработка основ технологии микроклонального размножения Vacciniumcor Ymbosulm в культуре Invitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

10

РАЗРАБОТКА ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ VACCINIUMCORYMBOSUML В КУЛЬТУРЕ INVITRO

Черник Валентина Федоровна

Канд. биол. наук, доцент кафедры морфологии и физиологии человека и животных факультета естествознания БГПУ им. М. Танка, Минск, Республика Беларусь

УДК 634:737:581.16:631

Аннотация. Близкой к оптимальной для культивирования семян голубики (сорт Дикси) оказалась питательная среда Мурасиге-Скуга, содержащая БАП (0,5 мг/л) + ИУК (1 мг/л) + тиамин (0,1 мг/л) + аденин (1мг/л) + 2 % сахароза. Более высокие морфометрические показатели регенерантов наблюдались при добавлении в питательную среду 1,5 мг/г гиббереллина.

Экспериментальные исследования показали [1, 3], что регенерация растений Vacciniumcorymbosum (голубики высокой) в асептической культуре зависит от множества факторов: типа экспланта, его физиологического состояния, состава питательной среды (макро- и микросолей, витаминов, углеводов, гормональных добавок). На вегетативное и семенное размножение интродуцированных сортов голубики высокой уходит много времени, а выращенные растения нередко поражены болезнями. Быстрее этот процесс происходит при получении стерильных регенерантов в культуре invitro.Поэтому были предприняты научные исследования по клональному микроразмножению растений, которые проводились в отделе биотехнологии в Центральном ботаническом саду НАН Беларуси[1-4].

Цель исследования заключалась в разработке основ технологии клонального микроразмноженияV.сorymbosum в культуре invitro, в получении стерильного материала для его использования в производственных и селекционных целях. Исследование проводилось в следующих направлениях: 1) подбор экспланто в, обладающих высокими тотипотентными свойствами; 2) подбор состава питательных сред для культивирования изолированных эксплантов; 3) выявление оптимальных физических факторов, необходимых для клонального микроразмножения (температура, освещенность).

Материалы и методы

Материалом для исследования послужил интродуцированный сорт «Дикси». В качестве эксплантов использовались стерильные семена, верхушечные почки. Работа с ними проводилась на питательных средах в асептических условиях, в специальном ламинарном боксе. Способ стерилизации эксплантов подбирался экспериментально. В качестве питательных сред использованы агаризованные среды: Мурасиге-Скуга, Андерсена. Автоклавирование их проводили при 1 атм в течение 20 минут. Подбор оптимальной рН регулировали с помощью КОН и HCl в диапазоне от 4,0 до 5,8. Температура в ростовой климатокамере составляла в среднем 25^oC, при круглосуточном освещении 2000 лк. В среднем на

питательную среду помещалось по 10 эксплантов, эксперимент проводился в трехразовой повторности.

Результаты исследования.

Установлено, что в качестве стерилизующего агента для семян голубики сорта «Дикси» целесообразно использовать диоцид в сочетании с обработкой 70 %-этанолом (экспозиция: диоцид - 20 мин и затем 10 мин - этиловый спирт), обеспечивающих стерильность эксплантов.

Одним из основных факторов, влияющих на процесс клонального микроразмножения является правильный подбор питательной среды. Для выявления оптимального состава питательной среды были заложены опыты по следующей схеме (таблица 1).

Таблица 1. Культивирование семян голубики высокой в зависимости от добавок, вносимых в питательную средуМурасиге-Скуга (рН 5,8)

Как видно из таблицы 1, оптимальной для ускоренного получения проростков V.corymbosumоказалась среда в третьем варианте опыта (2 % сахароза+0,5 БАП +1,0 ИУК + 0,1 В1+1,0 аденин), в котором проросло 90 % семян.

Опыты по определению оптимального количества гиббереллина для быстрого прорастания семян были заложены, как на агаризованной среде Мурасиге-Скуга, так и на жидкой среде Андерсена (таблица 3) с 2 % сахарозой. Результаты опытов свидетельствуют о том, что максимальное количество проросших семян наблюдалось в первом варианте опытана обеих средах при добавлении 1,5 мг/л гиббереллина (таблицы 2, 3) в течение 3-х дней. В обычных же условиях проращивания семена голубики высокой обладают продолжительным периодом покоя и нуждаются в 4-х-месячной стратификации.

Таблица 2. Культивирование семян голубики высокой на агаризованнойпитательной среде МурасигеСкуга(рН 5,8) в зависимости от дозы гиббереллина

Таблица 3. Культивирование семян голубики высокой на жидкой питательной среде Андерсена (рН 4,8) в зависимости от дозы гиббереллина

Проблема клонального микроразмножения для голубики высокой может быть решена не только с помощью культивируемых семян, но и благодаря образованию каллюсной ткани. На искусственной питательной среде каллюсообразование происходит путем культивирования верхушечных почек, освобожденных от покровов (рисунок, фрагмент 1).Каллюс культивируется на среде Мурасиге-Скуга, с добавлением 1,5 мг/л гиббереллина, или на среде Андерсена с добавлением 2-iP. Процесс сопровождается регулярными пересадками эксплантов на эти же, но свежие среды через 30 дней. Из каллюсной ткани полученырегенеранты.

Наблюдение за развитием регенерантовиз семян показало, что сорт Дикси обладает морфогенетическим потенциалом, поскольку вычлененные из покровов семенана питательной среде проявляют способность к регенерации (рисунок, фрагмент 2).

Рисунок. Развитие регенерантов голубики высокой (сорт Дикси) на агаризованнойпитательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 1.5 мг/г гиббереллина: 1 - из каллюсной ткани; 2 - из семян, лишенных покровов

Оптимальной для морфогенетических показателей проростков голубики высокой оказалась агаризованная питательная среда Мурасиге-Скуга с добавлением 1,5 мг/г гиббереллина, о чем свидетельствуют морфометрические показатели (таблица 4).

Таблица 4. Морфометрические показатели регенерантов (проростков) голубики высокой в культуре invitro

Как показали экспериментальные данные, без гиббереллина на питательной среде МS процент прорастания семян самый низкий. Период прорастания семян длительный (составляет минимум 45 дней). Морфометрические показатели регенерантов (длина листа, стебля, корня) уступают таковым в вариантах опыта 2, 3 и 4 (таблица 4). Морфогенез замедлен и число листьев на проростке уступает их количеству в других вариантах опыта.

Оптимальными являются условия, создаваемые при введении в питательную средуМS гиббереллина (0,5-1,5 мг/л). Длительность прорастания семян резко сокращается и составляет не более 7 дней; процент прорастания семян значительно выше (50-56 %) в этом варианте опыта. Морфогенез протекает более активно (на проростке сформированы 3-4 листа). Морфометрические показатели регенерантовсвидетельствуют в пользу практического использования питательной средыМS, содержащей гиббереллин в концентрации 1,5 мг/л.

Повышение в питательной среде концентрации гиббереллина ведет к снижению морфометрических показателейрегенерантов, уменьшению процента прорастания семян, увеличению периода их прорастания и замедлению морфогенеза (таблица 4).

Выводы:

1. Процесс культивирования семян голубики высокой, изолированных от покровов, на питательных средах, показал возможность снятия у них периода покоя, поскольку на питательной среде семена прорастают в течение 3-7 дней.

2. Близкой к оптимальной для культивирования семян голубики (сорт Дикси) оказалась питательная среда Мурасиге-Скуга, содержащая БАП (0,5 мг/л) +ИУК (1 мг/л) + тиамин (0,1 мг/л) +аденин (1мг/л)+ 2 % сахароза.

3. Более высокие морфометрические показатели регенерантов наблюдались при добавлении в питательную среду 1,5 мг/г гиббереллина.

культивация семена питательная среда голубика

References

1. Кутас Е.Н., Веевник А.А., Горецкая А.А., Титок В.В. Морфогенез интродуцированных сортов голубики высокой, брусники обыкновенной и рододендрона желтого в зависимости от состава питательных сред// Весцi НАН Беларусi. Сер. бiялнавук, 2015, № 1. - С.12-15.

2. Черник В.Ф., Кутас Е.Н. Регенерация растений из эксплантов стерильных проростков у двух интродуцированных сортов VacciniumcorymbosumL. Весцi НАН Беларусi. Сер. бiялнавук, 1992, № 3-4. - С.6-9.

2. Кутас Е.Н. Научные основы клональногомикроразмножения растений на примере интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной. Автореферат дисс. … доктора биологических наук. М.: Московская сельскохозяйственная Академия имени К.А. Тимирязева. 1997.

3. Kutas E. Regeneration potential of different types of explants from introduced varieties of rhododendrons in aseptic culture/E. Kutas, A. Veyevnik, V. Titok, L. Ogorodnyk// Intarnational Journal of Advanced Research in Biological Sciences. 2016. 3 (6): 1-4.

Размещено на Allbest.ru