Лабораторная диагностика африканской чумы свиней

Размещено на http://www.allbest.ru/

Лабораторная диагностика африканской чумы свиней

Латкина Д.А.

ФГБОУ ВО Башкирский ГАУ

Уфа, Россия

Для лабораторных исследований при подозрении на африканскую чуму свиней ветеринарный врач осуществляет отбор проб от свиней любой половозрастной группы, в зависимости от эпизоотологических данных и клинических показаний (неожиданная гибель нескольких животных неустановленной этиологии или превышающих технологическую норму). Количество проб берут от всех павших (заболевших), но не менее, чем от 3-х животных при массовой гибели. Структура проб: «полный набор», включая пробы крови, лимфатических узлов, паренхиматозных органов, костной ткани, трубчатую кость с мозгом (в случае отсутствия органов или их аутолиза).

Отбор проб для вирусологических исследований. Для обнаружения вируса африканской чумы свиней, антигена или генома от павших или убитых с диагностической целью свиней отбирают массой 5-10 г - селезёнку (1/3 часть), портальные, желудочные и подчелюстные (или мезентериальные) лимфоузлы (целиком), лёгкое (5х5 см) и почку (1/3 часть), 3-5 мл крови (или сгусток). Кроме того, рекомендуется в случае аутолизиса трупа отбирать грудинную или трубчатую кость.

Отбор проб для серологических исследований. Минимальное количество проб, которые должны быть отобраны для серологических исследований, рассчитывают с учётом 10%-ой серопревалентности заболевших с 95%ой достоверностью для обследования каждого помещения.

Пробы крови отбирают их полой вены не менее 10 мл от каждой свиньи[3].

Для лабораторных исследований применяют следующие методы: реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток, реакцию прямой иммунофлюоресценции (РПИФ), полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в формате электофорезной детекции, ПЦР в формате реального времени, применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ - ИФА) (сэндвичвариант). В сомнительных случаях окончательный диагноз устанавливают заражением подозрительным материалом (кровь, суспензия селезенки и лимфатических узлов) свиней, вакцинированных против классической чумы. Заражение свиней (биопроба) проводят в специализированной лаборатории с соблюдением особых мер предосторожности. Серологические типы вируса определяют в реакции преципитации (РП), реакции связывания комплемента (РСК), реакции задержки геамадсорбции (РЗГАд) и другими методами. [2]

Для обнаружения антигена африканской чумы свиней применяют реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток костного мозга (ККМС) или лейкоцитов свиней (ЛС), содержащих эритроциты и последующем обнаружении гемадсорбции ставят в вирусологических лабораториях. Для этого культуру клеток ЛС или ККМС 2-3 суточного возраста, выращенную на стеклянных пластинках из покровных стекол в пробирках (чашках Карреля), заражают экстрактами суспензий органов и кровью и через 24, 48, 72, 96 и 192 часа после инокуляции культуру клеток просматривают под световым микроскопом на наличие гемадсорбции. В положительных случаях наблюдают гемадсорбцию эритроцитов на пораженных вирусом клетках в виде ягоды «малины» [4]. чума свинья антиген мозг

Реакция прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) ставят в вирусологических лабораториях для прямого обнаружения вирусного антигена в клетках органов свиней, подозреваемых в заражении вирусом африканской чумы свиней. Внутриклеточный антиген обнаруживают люминесцентной микроскопией препаратов мазков-отпечатков, окрашенных ФИТЦиммуноглобулинами (специфические антитела к вирусу африканской чумы свиней, меченные флуоресцеинизотиацианатом). Лучшими органами для РПИФ являются селезёнка и лимфоузлы. Исследование может быть выполнено в течение 2-4 час [2].

Для выполнения реакции используют «Набор препаратов для дифференциальной иммунофлуоресцентной диагностики африканской чумы свиней (АЧС), классической чумы свиней (КЧС) и болезни Ауески (БА)» или сертифицированные коньюгаты ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС, произведённые отдельно во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ), г. Покров Владимирская область.

Оценку результатов микроскопии проводят по условной четырех крестовой шкале при окуляре 10х20-объективе 10. В положительных случаях наблюдают сверкающую, желто-зеленого цвета флуоресценцию клеток с включениями или очаговыми флуоресцирующими комплексами диффузного и гранулярного антигена, в одном из 10-50 полей зрения.

Для обнаружения антигена и антител против вируса африканской чумы свиней применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ - ИФА) (сэндвич-вариант) основанный на взаимодействии иммобилизированных на поверхности лунок планшет специфических к вирусу АЧС иммуноглобулинов со специфическими антигенами АЧС и последующим выявлением комплекса «антиген-антитело» специфическим к вирусу АЧС конъюгатом антител, меченным пероксидазой хрена (коньюгат ПХ-АЧС). Пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена, в результате чего в лунках развивается окраска субстрата, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антигена в определяемой пробе. В случае отсутствия антигена, коньюгат ПХАЧС (т.е. ПХ) удаляется отмывочным раствором и окраска отсутствует.[3]

При визуальном учёте реакцию считают положительной при окрашивании хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые и специфический антиген в синезеленый цвет и отсутствии окрашивания субстрата в лунках, в которых предварительно инкубировали нормальный антиген.

Для обнаружения генома вируса африканской чумы свиней применяют ПЦР в формате электофорезной детекции. Для выполнения используют «Тестсистему для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР» (производство ГНУ ВНИИВВиМ). Принцип реакции заключается в многократном повторении циклов денатурации исследуемой ДНК при температуре 94°С, гибридизации ДНК со специфическими праймерами при температуре 53°С и синтеза с них комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 72°С. В результате амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле [1].

Анализ по выявлению вируса АЧС включает выделение ДНК и амплификации специфического фрагмента в полимеразной цепной реакции и электрофорез в агарозном геле [3].

Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результаты реакции выявляются в виде светящихся полос оранжевого цвета.

Реакция считается положительной, если полоса в соответствующем треке располагается в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля амплификации. Размер апликонов после проведения ПЦР- 485 п.н.

Реакция считается отрицательной, если в соответствующих треках полос не обнаружено или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом расстоянии от старта) [4].

Для обнаружения антигена вируса африканской чумы свиней применяют ПЦР в формате реального времени. Реакции заключается в использовании специфического флюоресцентно-меченного зонда, сайт гибридизации которого лежит между сайтами связывания основных диагностических праймеров. В случае присутствия в исследуемом образце генома возбудителя, зонд будет связываться с его ДНК и прибор регистрирует накопление флуоресцентного сигнала в ходе реакции. Регистрация сигнала происходит через стенки пробирки в режиме реального времени [1].

Учёт результатов проводят по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM с помощью программного обеспечения используемого прибора.

Положительными считают результаты реакции при значениях Ct, не превышающих 35.

Образцы, для которых не определено значение Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию) - результаты считают отрицательными [4].

Библиографический список

1.Белоусова Л.В., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. М.: КолосС, 2006. -- 248 с [Текст] с.131-140.

2.Госманов Р.Г., Колычев Н.М. Ветеринарная вирусология М.: KoлoсC, 2006. -- З04 c. [Текст] с.151-153.

3.Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, А.А., Е.С. Воронин и др.; Под ред. А.А. Сидорчука. - М.: Колосс, 2007.-671с [Текст] с.206275.

4.Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Черных О.Ю., Шевкопляс В.Н. Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных. Учебное пособие. Краснодар. - 2009. - 575 С. [Текст] с.340-402

Размещено на Allbest.ru