Ветеринарная радиобиология

Для количественного описания скорости, с которой организм освобождается от радионуклидов, используют специальный показатель - период полувыведения (Т). Различают биологический период полувыведения (Тбиол) - время, в течение которого концентрация нуклида снижается вдвое в результате процессов метаболизма, и эффективный период полувыведения - время, за которое из организма выбывает 50% первоначального количества нуклидов как за счет метаболического выведения, так и за счет физического распада.

Быстрее всего организм освобождается от радионуклидов, накапливающихся в мягких тканях, таких, как цезий, йод, молибден. Остеотропные радионуклиды, такие, как стронций, выводятся гораздо медленнее. Так, у крупного рогатого скота для 137 Cs Т1=3 сут., Т2=46 сут., в то время, как для 90 Sr Т1 превышает 3000 сут. (Т - период полувыведения).

Так как содержание радионуклидов в продукции животноводства находится в прямой зависимости от содержания их в растениях и почвах, то для составления прогноза вероятностного поступления радионуклидов в рацион животных необходимо располагать данными о количественном переходе разных радионуклидов из почв в корма и продукцию животноводства. Это осуществляется с помощью коэффициентов перехода - отношение содержания радионуклида в каждом последующем звене пищевой цепи к предыдущему.

Тема 5. ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ

Лекция 13: Прямое и косвенное действие ионизирующих излучений

1. Общие аспекты действия ионизирующего излучения

Ионизирующие излучения обладают высокой биологической активностью. Они способны вызывать ионизацию любых химических соединений биосубстратов, образование активных радикалов и этим индуцировать длительно протекающие реакции в живых тканях. Поэтому результатом биологического действия радиации является, как правило, нарушение нормальных биохимических процессов с последующими функциональными и морфологическими изменениями в клетках и тканях животного и человека.

В механизме биологического действия ИИ на живые объекты условно можно выделить два основных этапа.

Первый этап - первичное (непосредственное) действие излучения на биохимические процессы, функции и структуры органов и тканей.

Второй этап - опосредованное действие, которое обусловливается нейрогенными и гуморальными сдвигами, возникающими в организме под влиянием радиации.

В настоящее время признаны две теории механизма первичного (непосредственного) действия ионизирующей радиации - теории прямого и косвенного действия излучений на составляющие молекулы вещества.

2. Прямое и косвенное действие ионизирующих излучений

Прямое действие ионизирующих излучений - такие изменения, которые возникают в результате поглощения энергии излучения самими молекулами, а поражающее действие связано с актом возбуждения и ионизации атомов и макромолекул (т.е. с утерей или приобретением электрона самими рассматриваемыми молекулами («мишенями»)).

Косвенное (непрямое) действие ионизирующих излучений - изменения молекул клеток и тканей, вызванные продуктами радиационного разложения (радиолиза) окружающей эти молекулы воды и растворенных в ней низкомолекулярных соединений, а не энергией излучения, поглощенной самими исследуемыми молекулами.

На основе представления о прямом действии ИИ возникла теория мишени и попаданий. Эта теория объясняла наличие в клетке жизненно важного центра (гена или ансамбля генов) - мишени, попадание в которую одной или нескольких высокоэнергетических частиц атомной радиации достаточно для разрушения и гибели клетки. Попадание в мишень - вероятностное событие. Дальнейшим развитием теории прямого действия излучений явилась стохастическая (вероятностная) теория. Она, так же как и теория мишени учитывает вероятностный характер попадания излучения в чувствительный объем клетки, но в отличие от нее она еще учитывает и состояние клетки как биологического объекта, лабильной динамической системы [Радиобиология / Белов А.Д. и др., 1999].

При косвенном действии ИИ наиболее важен процесс радиолиза (радиационного разрушения) воды, потому что вода составляет основу важнейших структур клетки (80-90%). Именно в воде растворены белки, нуклеиновые кислоты, ферменты, гормоны и другие жизненно важные вещества, являющиеся основными компонентами клетки, которым легко может быть передана энергия, первоначально поглощенная водой [Радиобиология / Белов А.Д. и др., 1999].

Под действием ионизирующего излучения в клетке начинаются физико-химические процессы, в результате которых образуются химически высокоактивные соединения, радикалы и ионы, повреждающие биологические структуры организма и вызывающие рассогласование его функций [Симак С.В. и др., 1998].

Воздействие ионизирующей радиации на живое вещество проходит в три фазы: в физическую - длится 10-13 - 10-16с; в фазу первичных физико-химических превращений - 10-6 - 10-9с; в фазу химических реакций - 10-5 - 10-6с.

Физическая фаза по существу - один из моментов прямого действия ИИ на молекулярные и биологические структуры клетки. При взаимодействии ИИ (гамма-кванты, заряженные частицы, и т.д.) с электронными оболочками атомов происходит возбуждение и ионизация атомов или молекул вещества, через которые излучения проходят. При этом на один акт ионизации приходится 10 - 100 возбужденных атомов, которые в процессе рекомбинации излучают избыток энергии в виде характеристического рентгеновского излучения.

В физическую фазу происходит взаимодействие ИИ с молекулой воды, в результате чего выбивается электрон с внешней орбиты атома и образуется положительно заряженный ион воды:

г > Н2О > е- + Н2О+.

«Вбитый» электрон присоединяется к нейтральной молекуле воды, образуя отрицательный ион воды:

е- + Н2О > Н2О-.

При эффекте возбуждения образуется нейтрально заряженная молекула воды с избытком энергии, привнесенной ИИ:

г > Н2О > Н2О*.

Физико-химические свойства ионизированных и возбужденных молекул воды будут отличаться от молекул воды электрически нейтральных. Продолжительность существования таких молекул очень короткая; они распадаются (диссоциируют), образуя высокореактивные свободные радикалы водорода и гидроксила (Н* и ОН*); наступает вторая фаза радиолиза воды.

Фаза первичных физико-химических реакций:

Н2О+ > Н+ + ОН*

Н2О- > Н* + ОН-

Н2О* > Н* + ОН*

Гидроксильные радикалы (ОН*) - сильные окислители, а радикал водорода (Н*) - восстановитель. Образование свободных радикалов может идти и другим путем. Выбитый из молекулы воды под действием излучения электрон может присоединиться к положительно заряженному иону воды с образованием возбужденной молекулы:

Н2О+ + е- > Н2О*.

Избыточная энергия этой молекулы расходуется на ее расщепление с образованием свободных радикалов водорода и гидроксила:

Н2О* > Н* + ОН*.

Ионизированная молекула воды (Н2О+) может реагировать с другой нейтральной молекулой воды (Н2О), в результате чего образуется высокореактивный радикал гидроксила (ОН*):

Н2О+ + Н2О > Н3О+ + ОН*.

На этом заканчивается физико-химическая фаза и развивается третья фаза действия ионизирующего излучения.

Фаза химических реакций. Обладая очень высокой химической активностью за счет наличия неспаренного электрона, свободные радикалы взаимодействуют друг с другом или с растворенными в воде веществами. Реакции могут идти следующими путями:

Н* + ОН* > Н2О (рекомбинация, восстановление воды);

Н* + Н* > Н2О + О (образование молекул воды и выделение кислорода, который является сильным окислителем);

ОН* +ОН* > Н2О2 (образование пероксида водорода).

При наличии в среде растворенного кислорода О2 возможна реакция образования гидропероксидов:

Н* + О2 > НО2* (гидропероксидный радикал).

Эта реакция указывает на роль кислорода в повреждающем эффекте ИИ.

Гидропероксиды могут взаимодействовать между собой, образуя пероксиды водорода и высшие пероксиды, которые обладают высокой токсичностью, но они очень быстро разлагаются в организме ферментом каталазой на воду и кислород:

НО2* + НО2* > Н2О2 + О2;

НО2* + Н* > Н2О2 (пероксид водорода);

НО2* + НО2* > Н2О4 (высший пероксид).

Появление свободных радикалов и их взаимодействие составляют этап первичных химических реакций воды и растворенных в ней веществ, а в случаях облучения животных и растений - и биологических молекул.

Энергия излучения может поглощаться и непосредственно молекулами органических соединений. При этом также образуются возбужденные молекулы, ионы, радикалы и перекиси, при реакциях типа:

a) hv > RH > RH* > R* + H*;

R* + O2 > RO2*;

RO2* + H* > HRO2

b) hv > RH >RH+ + e-

c) hv > RH > R- + H+

d) RH + H* > R* + H2

e) RH + OH- > R* + Н2О

Возможна также диссоциация органических молекул или присоединение к ним радикала. В результате они либо разрушаются, либо инактивируются, теряя свои биологические свойства.

Энергия излучения, поглощенная молекулой белка или нуклеиновой кислоты, может передаваться ее структурами, разрушая молекулу в определенных, наиболее уязвимых местах по вышеприведенной схеме.

Таким образом, первичные процессы, происходящие в организме непосредственно в момент действия изучения, заключаются в образовании возбужденных молекул, ионов, радикалов и перекисей.



Рис. 13.1. Продукты радиолиза воды.

На биологической стадии воздействия эти высокоактивные в химическом отношении соединения вступают в реакции с компонентами сложных биохимических систем живого организма, что приводит к нарушениям химических процессов и структур клеток и, как следствие - к нарушению функций на уровне целостного организма.

Величина прямого и непрямого действия в первичных радиобиологических эффектах различных систем неодинаковая. В абсолютно чистых сухих веществах будет преобладать прямое, а в слаборастворенных - косвенное действие радиации. У животных, по данным М.А. Кузина, примерно 45% поглощенной энергии излучения действует непосредственно на молекулярные структуры - прямое действие, а остальные 55% энергии непрямое действие.

3. Эффект разведения и кислородный эффект

О различии прямого и косвенного действия радиации на биологические объекты и величине их влияния на развитие лучевого поражения можно судить по двум феноменам - эффекту разведения и кислородному эффекту.

Эффект разведения

При косвенном действии радиации, независимо от разведения раствора, абсолютное число поврежденных молекул остается постоянным, а доля их от общего числа изменяется обратно пропорционально их концентрации.

При прямом действии радиации число инактивированных молекул при заданной дозе увеличивается пропорционально концентрации раствора, а их доля от общего числа молекул остается постоянной.

Кислородный эффект

В развитии первичных реакций при облучении биообъектов большое значение имеет концентрация кислорода в среде. С повышением его концентрации в окружающей среде и объекте облучения усиливается эффект лучевого поражения, и, наоборот, при понижении концентрации кислорода наблюдается уменьшение степени лучевого поражения. Выраженность кислородного эффекта у разных видов излучений неодинаковая и зависит от их линейной передачи энергии (ЛПЭ); с повышением ее эффект уменьшается. При действии излучений с малой плотностью ЛПЭ наблюдается наибольший эффект, а при воздействии излучений с высокой ЛПЭ он полностью отсутствует.

В присутствии кислорода происходит значительное усиление косвенного действия продуктов радиолиза воды и низкомолекулярных органических соединений. Свободные радикалы, взаимодействуя с кислородом, образуют гидропероксиды, пероксиды и высшие пероксиды, которые оказывают токсическое действие на организм. Наличие кислорода в облучаемой среде усиливает также прямое действие радиации. При попадании гамма-кванта в молекулу органического вещества, так же как и в случае с водой, образуются активные радикалы в результате ионизации и возбуждения молекул. Эти радикалы, взаимодействуя с кислородом, образуют гидропероксиды и пероксиды (RОО*), которые приводят к глубокому изменению молекул [Белов А.Д. и др., 1999].

Лекция 14: Радиационные повреждения ДНК и проявления лучевого поражения на уровне клетки

При облучении клетки поражаются все ее структуры. Вероятность поражения тех или иных молекул определяется их размером: чем крупнее молекула, тем, естественно, больше вероятность ее повреждения. Именно поэтому в качестве основной мишени радиационного поражения клетки рассматривается ДНК.

С позиций радиобиологии важен факт теснейшего пространственного расположения различных частей одной и той же молекулы ДНК в интерфазной клетке и в хромосоме и, кроме того, близкое расположение молекул ДНК, принадлежащих разным хромосомам.

1. Виды радиационных повреждений ДНК

В результате прямой ионизации самой молекулы ДНК и ее атаки радикалами ОН происходит разрыв химических связей между атомами. Разрыв связей в сахаро-фосфатном скелете нарушает непрерывность нити ДНК. Если разорвана одна из нитей, говорят об однонитевом или одиночном разрыве. Совпадение разрывов противоположных нитей ДНК в одной точке приводит к появлению двойных (двунитевых) разрывов.

Известно, что одиночные разрывы постоянно возникают в клетке и без всякой связи с облучением, просто вследствие тепловой нестабильности ДНК, а также в результате некоторых окислительных и ферментативных процессов. Более того, одиночные разрывы даже необходимы: при репликации ДНК молекула должна быть расплетена на участке синтеза, для чего одна нить должна иметь возможность вращаться относительно другой, чего невозможно достичь без ее разрыва. Предполагается, однако, что при облучении возникают не только одиночные разрывы, аналогичные возникающим спонтанно, но еще появляются «комплексные», при которых в скелете ДНК рядом находится сразу несколько разорванных связей; такие разрывы репарируются хуже, чем возникающие в нормальных условиях.

Двойные разрывы образуются как при случайном пространственном совпадении одиночных разрывов в противоположных нитях ДНК (вероятность которого возрастает с увеличением накопленной дозы редкоионизирующего излучения), так и вследствие одномоментного повреждения обеих нитей при выделении в данном микрообъеме клетки большого количества энергии. Даже при действии редкоионизирующих излучений выделение энергии по объему клетки происходит не абсолютно равномерно, а дискретными порциями разной величины, так что в примерно равном объеме атомам может быть передано от нескольких электрон-вольт до нескольких сот электрон-вольт. При действии плотноионизирующих излучений общее число разорванных межатомных связей будет таким же, однако они будут менее равномерно распределены по длине молекулы ДНК. Общее число очагов поражения будет меньшим, зато «тяжесть» (концентрация разорванных межатомных связей на единицу микрообъема) каждого из них будет больше. Таким образом, при действии плотноионизирующих излучений число двойных разрывов на единицу дозы оказывается выше, чем при действии редкоионизирующих видов радиации. Так как одиночные разрывы репарируются гораздо лучше, чем двойные, тяжесть поражения клетки с увеличением доли двойных разрывов возрастает. Именно это и служит причиной более высокой относительной биологической эффективности плотноионизирующих излучений.

Нарушение непрерывности молекулы ДНК препятствует считыванию с нее генетической информации (если разрыв приходится на транскрибируемый участок генома), а также нормальной репликации ДНК и последующему распределению генетического материала между клетками. Разрыв скелета может сопровождаться разрывом связей в той части молекулы дезоксирибозы, которая не участвует в построении скелета ДНК. Такое повреждение рассматривается одновременно и как разрыв, и как повреждение нуклеотида.

Разрывы скелета ДНК частично элиминируются самостоятельно, частично с помощью систем ферментативной репарации. Репарация не всегда заканчивается восстановлением исходной молекулы. Вместо воссоединения разорванной связи может возникнуть связь между свободными концами двух противоположных нитей молекулы ДНК, между свободными концами в местах разных разрывов одной и той же нити ДНК и даже между свободными концами разных молекул ДНК. Такое разнообразие новых связей является следствием того, что нити ДНК в ядре упакованы весьма плотно. Неправильное воссоединение разрывов приводит к возникновению хромосомных перестроек (аберраций).

2. Восстановительные процессы в облученной клетке

За миллионы лет эволюции живые организмы выработали специальные механизмы исправления поврежденных в результате действия ионизирующей радиации клеточных элементов. Такой процесс называется репарация (восстановление).

Принято выделять два вида репараций - от сублетальных и от потенциально летальных повреждений.

Сублетальные повреждения - нарушения, которые сами по себе не вызывают гибель организма (клетки), но увеличивают ее вероятность. Примером сублетальных повреждений может служить поражение клеточных мембран или органелл (кроме ядра).

Потенциально летальные повреждения - нарушения, которые сами по себе способны вызывать гибель организма или клетки, но в определенных условиях могут быть отрепарированы. Например, двойные разрывы ДНК являются абсолютно летальными повреждениями, если клетка вступила в митотическое деление. Однако они могут быть репарированы за время, оставшееся до деления клетки. Если этот период (интерфазу) искусственно удлинять, то вероятность успешной репарации увеличивается. Замедление темпов клеточного деления можно достичь, например, понижением температуры или введением специальных химических веществ - ингибиторов деления.

Первичные повреждения в молекулах ДНК удаляются и замещаются нормальными структурами в результате трех процессов:

1. возвращения молекулы ДНК к исходному состоянию;

2. вырезания поврежденного участка и замещение его нормальным;

3. рекомбинированного восстановления - в обход поврежденного участка.

Репарация от радиационных повреждений ДНК осуществляется ферментами, постоянно участвующими в метаболизме клетки, в том числе в восстановлении от повреждений нерадиационной природы (химической, термической, стрессовой, ошибок считывания и тд.).

Известно несколько различных по своим механизмам репарационных систем.

Фотореактивация заключается в устранении одного из типов повреждений ДНК - пиримидиновых димеров. После попадания кванта радиации в молекулу пиримидинового основания (тимина, цитозина или урацила) в ней разрывается двойная связь между 5-м и 6-м атомами углерода. Если два разрыва происходят в двух соседних молекулах тимина, то разорванные связи могут замкнуться друг на друге, образуя прочную ковалентную связь между двумя основаниями - димер тимина. Аналогично возникают димеры цитозина или тимин-цитозин и т.д. После этого расхождение нитей ДНК и, следовательно, самоудвоение ДНК или считывание закодированной в ней информации становится невозможным.

У растений такие дефекты устраняет фермент фотолиаза, названный так из-за того, что он использует энергию видимого света или ближней ультрафиолетовой радиации (300-600 нм).

Темновая система репарации значительно сложнее. В процессе темновой репарации ДНК выделяют 2 этапа.

1. выщепление поврежденного участка (димера пиримидинового основания и олигонуклеотидного фермента) с помощью ферментов нуклеаз;

2. застройка образовавшегося пробела с помощью комплементарного участка противоположной нити ДНК при участии комплекса ферментов, основными из которых у эукариот являются в- и г-ДНК-полимеразы, а у прокариот - ДНК-полимераза-1 и полинуклеотидлигазы.

Существует еще целый ряд менее изученных репарационных систем, действующих в разные фазы клеточного цикла.

Поскольку постлучевая репарация - процесс ферментативный, ее интенсивность и судьба облученной клетки зависят от общего уровня клеточного метаболизма и активности ферментов. Следовательно, важную роль в поддержании эффективности систем репарации играет общий уровень метаболизма, в первую очередь - белкового обмена. Это связано с тем, что при недостаточном поступлении в организм незаменимых аминокислот нарушается синтез белков, в том числе и ферментов. Поэтому полноценное белковое питание играет важную роль в системе постлучевых терапевтических мероприятий. Для нормального обмена веществ важна также сбалансированность рациона по витаминам и минеральным элементам.

3. Задержка прохождения клеточного цикла

Жизненный цикл клетки, период от одного деления до другого, подразделяется на четыре фазы: предсинтетический период (G1), период синтеза ДНК (S-период), постсинтетический период (G2) между окончанием синтеза ДНК и вступлением клетки в митозмитоз (М). Схема генерационного цикла представлена на рисунке.

Схема митотического цикла:

Сверочная точка Сверочная точка

M ----------------------1-------------------1---------- M

G1 S G2

G0

М - митоз; С, - предсинтетический (по отношению к синтезу ДНК) период; 5 -стадия синтеза ДНК; С2 - постсинтетический период; С0 - период покоя

Общая длительность цикла культивируемых in vitro опухолевых клеток человека, с которыми проводится основная масса радиобиологических экспериментов, составляет около 24 ч, при длительности периода G1 10 ч Клетки опухолей человека лимфоидного происхождения могут иметь цикл короче 10 ч.

Быстро делящиеся клетки, особенно стволовые, имеют укороченный период G1, в то время как дифференцированные клетки имеют столь длинный период G1, что его обозначают как G0 и называют стадией покоя.

В медленно обновляющихся тканях большинство клеток находится в G0 периоде, т.е. периоде покоя; его длительность составляет недели, месяцы и даже годы (например, клеток ЦНС). «Покоящиеся» клетки - это резерв репопуляции, они переходят к синтезу ДНК и делению в случае гибели от различных причин части клеточного пула. Таков, например, механизм посттравматиче-ской регенерации тканей или возобновления роста опухоли после ее облучения.

В клеточном цикле имеется несколько так называемых контрольных точек, «чекпойнтов» (англ. check point -- пост контроля на границе), при прохождении которых ферментативные системы проверяют ДНК на повреждения, и в случае их выявления активируют ингибиторы циклинзависимых киназ, что замедляет переход клеток из одной фазы в другую. Вероятно, замедление перехода дает больше возможности для репарации повреждений ДНК, возникающих в процессе нормальной жизнедеятельности клетки. При нанесении клетке значительного количества повреждений эта система также приводит к задержке прохождения цикла, но, по-видимому, не может обеспечить необходимый уровень восстановления. Блок в прохождении цикла нагляднее всего проявляется в виде задержки наступления первого постлучевого митоза. Фиксация поведения облученных клеток с помощью специальных видов видеосъемки показывает, однако, что при одной и той же дозе облучения клетки с длительной задержкой продвижения по циклу (более поздним наступлением митоза) впоследствии погибают с большей вероятностью, чем клетки с меньшей задержкой.

4. Радиационная задержка клеточного деления

Снижение числа делящихся клеток после облучения было замечено уже вскоре после открытия рентгеновских лучей, что послужило одним из оснований к их применению для подавления опухолевого роста. Задержка в наступлении очередного деления наблюдается почти у всех клеток облучаемой популяции, причем ее длительность зависит от дозы ионизирующего излучения.

В ходе многочисленных исследований было установлено, что длительность задержки деления у некоторых видов клеток меняется в зависимости от стадии клеточного цикла, в которой они находились при облучении, у других она относительно постоянна при облучении во время всей интерфазы.

Например, при наблюдении за клетками рака мочевого пузыря человека в течение нескольких генерационных циклов были получены следующие данные. При облучении этой популяции клеток из 231 клетки сохранили способность к делению в ряду нескольких поколений всего 12 клеток, потомство которых образовало колонии, состоящие из более чем 50 клеток каждая. В этой группе клеток задержка в прохождении цикла была относительно небольшая, они вошли в деление через 17 - 22 ч после предыдущего (19±2,5 ч). У остальных клеток, которые в дальнейшем погибли, облучение привело к значительной задержке наступления первого митоза. У клеток, облученных в период G1, задержка митоза составила около 7 ч, в поздней S- и G2-фазе она достигла 20-25 ч; наибольшую задержку испытывали клетки, подвергшиеся облучению в середине S-периода - в среднем она была равна 35 ч. Часть клеток погибла в интерфазе, причем не по апоптотическому пути, а по некротическому.

Различным видам клеток свойственны разные реакции на облучение.

Пока известны только отдельные факты, ответственные за задержку в прохождении клеточного цикла. Существенная роль в этом отводится системе обнаружения дефектов ДНК в контрольных точках цикла во время прохождения клеткой периодов G1 и G2. Раньше считалось, что задержка в продвижении по циклу дает клетке больше времени для репарации ДНК перед S-фазой или митозом, когда целостность молекулы ДНК особенно значима для нормальной жизнедеятельности. Однако данные о более длительной задержке в наступлении митоза у погибающих в последствии клеток по сравнению с сохраняющими клоногенный потенциал указывают, по-видимому, на более глубокое повреждение ДНК данной клетки.

Причины значительной задержки деления у клеток, облученных в середине S-фазы, неясны. Высказано лишь предположение, что она может быть связана с периодом клетки от репликации эухроматина к репликации гетерохроматина (эухроматин, составляющий около 90% ДНК клетки, транскрипционно активен и в интерфазе находится в деконденсированном состоянии; гетерохроматин транскрипционно неактивен и в интерфазном ядре находится в конденсированной форме., что различимо при световой микроскопии). Однако изучению дифференциальной чувствительности эу- и гетерохроматина к облучению еще только начинают уделять внимание, и данное предположение лишь указывает на то, что этот вопрос поднимается в литературе.

В практическом плане, например, при планировании экспериментов с определением хромосомных аберраций в облученных клетках и выборе времени их фиксации, упрощенно принимается, что для асинхронной популяции нелимфоидных клеток задержка в наступлении митозов составляет 1 ч на 1 Гр дозы излучения.

5. Мутации и хромосомные аберрации

Формирование под влиянием радиации разрывов ДНК является первым шагом формирования ХА. Именно «пропущенные» репарационными системами или неправильно восстановленные разрывы реализуются в форме различных типов ХА. Некоторые из них могут быть летальными и будут успешно «отфильтрованы» на протяжении нескольких клеточных делений, а другие же оказываются нелетальными и могут запускать каскад генетических явлений, в число которых входит и малигнизация клеток.

Повышенный выход частоты ХА может быть связан не столько с индукцией мутагенеза, сколько с ослаблением репарационных механизмов. Предполагается, что ряд заболеваний, в том числе и эндокринные патологии (сахарный диабет, (онко)патологии щитовидной железы, аутоиммунный тиреоидит и др.), сопряжены с возникновением нарушений на молекулярном уровне и их фенотипической реализацией в многокомпонентной системе ферментативных механизмов, обеспечивающих репарацию ДНК, уровень эффективности которой является определяющим критерием для сохранения генетической стабильности клетки.

Возникающие в клетке аберрации подразделяют на хромосомные и хроматидные. Хромосомные аберрации возникают в случае, когда клетка подверглась облучению на предсинтетической стадии цикла или в S-период, но до начала удвоения определенного участка своего генома. При неверном воссоединении оторванных друг от друга фрагментов ДНК такое нарушение воспроизводится во время репликации (удвоения). Итогом является образование дицентрических, кольцевых хромосом и ацентрических колец, что может сопровождаться появлением ацентрических фрагментов (парных фрагментов).

Хроматидные аберрации возникают в клетке, облученной уже после завершения репликации всей ДНК или того ее участка, разрыв которого и приведет к формированию аберрации. Разрыв одной из хроматид проявляется в виде ее укорочения и образования одиночного ацентрического фрагмента. Разрыв обеих хроматид может проявиться различным образом - образованием двух фрагментов, их слиянием в один или соединением сестринских хроматид.

Аберрации, сопровождающиеся образованием ацентрических фрагментов, дицентрических и кольцевых хромосом, получили название нестабильных, так как приводят к гибели самой облученной клетки или ее ближайших потомков из-за невозможности равномерного распределения генетического материала между дочерними клетками. Перестройки, сопровождающиеся только перемещением участков пораженных хромосом, когда весь генетический материал остается связанным с центромерой и может распределяться между дочерними клетками, относят к стабильным аберрациям, так как они могут передаваться в ряду клеточных поколений, сохраняясь в организме в течение многих лет. Примером являются транслокации, когда участок генома перемещается в новое для него место, но продолжает функционировать. Такие транслокации возникают при неверном соединении участков как одной и той же хромосомы, так и нескольких хромосом вследствие трех и большего числа разрывов в геноме одной клетки.

Изучение транслокаций стало возможным благодаря разработке методов дифференцированной окраски отдельных участков хромосом (метод G-дифференциальной окраски). В настоящее время одним из наиболее современных методов анализа хромосомных перестроек является использование флуоресцентной метки, присоединенной к фрагментам ДНК, комплементарным для ДНК определенных участков генома. Для него обычно используют английское название - FISH.

Наиболее широко хромосомные аберрации используют в биодозиметрии для оценки поглощенных доз при облучении человека. Тест проводят в культуре лимфоцитов периферической крови. Первостепенную роль при биодозиметрических исследованиях играет учет именно дицентрических и кольцевых хромосом, возникновение которых специфически сопряжено с воздействием радиации или очень небольшой группы радиомиметиков. При этом необходимо учитывать наличие парных фрагментов (при их отсутствии в клетках первого митоза можно говорить о наличии указанных аберраций в стволовой клетке, так как в процессе дифференциации вероятность потери фрагментов выше, чем центрических маркеров). Количество маркеров радиационного воздействия возрастает в зависимости от дозы согласно линейно-квадратичному закону (Y = бD + вD2). По мере увеличения дозы возрастает число разрывов ДНК и соответственно вероятность их взаимодействия между собой, которая зависит от квадрата дозы. При смертельной для человека дозе редкоионизирующих излучений 4,5-5 Гр на каждый делящийся лимфоцит приходится в среднем одна аберрация. Метод дает возможность оценить полученную дозу, начиная с 0,25 Гр.

Особую трудность для анализа представляют клетки с множественными аберрациями. Частота их растет пропорционально дозе и зависит от типа излучения. Высокоэнергетические б и в-частицы вызывают существенно более значимое увеличение частоты таких клеток по сравнению с г-квантами. Существует предположение, что на основании указанного различия, возможно провести биологическую идентификацию источника излучения.

Из ацентрических фрагментов хромосом, которые из-за отсутствия центромер не были распределены по ядрам дочерних клеток и остались в цитоплазме, образуются так называемые микроядра, представляющие собой глыбки хроматина, располагающиеся в цитоплазме интерфазной клетки. Количество микроядер на клетку коррелирует с дозой излучения и также как хромосомные аберрации используется в качестве показателя для целей биодозиметрии.

6. Индукция и реализация программируемой смерти клетки (апоптоза)

Еще одним следствием повреждения молекул ДНК является включение процесса программируемой клеточной смерти -- апоптоза. Многие виды клеток после облучения погибают как по апоптотическому, так и по некротическому пути, но ряд клеток, прежде всего лимфоидного происхождения, погибает в основном путем апоптоза. Клетки лимфоидного происхождения значительно более радиочувствительны, чем клетки любого другого происхождения. Их более ранняя гибель и высокая радиочувствительность объясняются запуском механизма программируемой смерти при таком уровне поражения ДНК, который сам по себе приводит клетку к гибели с гораздо меньшей вероятностью.

Апоптотическая смерть клетки в принципе является нормальным для организма процессом, участвующим в онтогенезе, дифференцировке, реакции на генотоксические внешние воздействия. Апоптотическая смерть -- один из наиболее важных способов сохранения организмом своего гомеостаза, роль которого особенно велика в противодействии злокачественному перерождению. Именно путем апоптоза происходит удаление трансформированных клеток. В клетке существует механизм выявления нарушений в структуре ДНК, сопряженный с выдачей сигнала на систему ее разрушения. Так работает опухолевый супрессор, белок р53, продукт гена р53, который воспринимает информацию о повреждении молекулы ДНК и затем активирует каскад ферментативных реакций внутриклеточной трансдукции сигналов апоптоза, запускающих ферменты, разрушающие определенные (но не все) клеточные структуры.

На молекулярном уровне выделяют три стадии апоптоза - стадию выявления нарушений в структуре клеточных компонентов и индукции сигнала к апоптотической смерти, стадию «принятия решения» и стадию «исполнения приговора». Сигналом к индукции апоптоза служит либо повреждение ДНК (обнаруживаемое с участием белка р53), либо повреждение митохондриальных мембран, ведущее к выходу из митохондрий в цитоплазму цитохрома С.

На второй стадии процесса действует несколько про- и анти-апоптотических модуляторов, и сигнал к апоптозу может быть заблокирован. Если трансдукция сигнала не прервана, то инициируется третья, завершающая стадия апоптотической гибели клетки - активируются эффекторные («киллерные», «казнящие») каспазы. Каспазы - это цистеиновые протеиназы, расщепляющие белки по остаткам аспарагиновой кислоты.

Клеточная мембрана в процессе развития апоптоза образует быстро возникающие и исчезающие выпячивания, так называемые блебы (от англ. bleb -- волдырь). Затем клетка округляется, а через некоторое время распадается на «апоптозные тела», которые содержат хроматин, митохондрии и лизосомы и окружены остатками клеточной мембраны.

Считается, что утеря клеткой апоптотического потенциала является одной из предпосылок злокачественного перерождения. Наиболее часто этому способствует выключение гена р53.

Предполагается, что гибель по апоптотическому пути может происходить при повреждениях ДНК, не являющихся препятствием к жизнедеятельности клетки. Основанием к такому выводу служит судьба лимфоидных клеток, погибающих по апоптотическому пути при более низких дозах, чем клетки, в основном погибающие по некротическому пути. Некротический путь гибели реализуется при уровне поражений, несовместимых с жизнедеятельностью клетки. Пока не ясно, связана ли разная эффективность выявления повреждений ДНК с различием в индукции или в осуществлении апоптоза.

При апоптозе ДНК распадается на строго определенные фрагменты, при некрозе - на участки различной длины. При некрозе ядерная и клеточная мембраны разрушаются на самых ранних этапах гибели, при апоптозе даже апоптозные тела окружены мембранами. Внутриклеточные органеллы сохраняются и видны в апоптотических телах, при некрозе они полностью разрушаются. Ингибирование синтеза АТФ, т. е. лишение клетки энергетического потенциала, препятствует развитию апоптоза, но не влияет на некротические процессы.

7. Генетическая и геномная нестабильность

Неправильная репарация ДНР сопряжена также с формированием феномена генетической нестабильности вследствие формирования репликационно ошибочного генотипа. Механизмы формирования этого явления достаточно многочисленны. Так, причинами генетической нестабильности могут быть неправильно репарированные повреждения ДНК: измененная последовательность оснований; микроделеции теломерных участков хромосом; активация генов, связанная с факторами роста, протеинкиназы К, интерлейкина-2, белка р-53, фактора некроза опухолей, протоонкогенов. Продукты этих генов влияют на отдаленные события в поврежденных клетках - мутагенез, канцерогенез, репарацию - и на отдаленную гибель [Хрисанфова Е.Н. и др., 2002].

РИНГ - это форма нестабильности генома, возникающая в результате воздействия ИИ. К ее проявлениям относят отсроченную репродуктивную гибель клеток (отдаленные летальные мутации), дестабилизацию хромосом, соматические мутации, амплификацию генов и изменение радиочувствительности [Мазурик В.К. и др., 2001; Пелевина И.И. и др., 2003]. В работе C. Mothersill и др. (1998) были выделены два признака РИНГ, как общие свойства пролиферирующих клеток. Один из них характеризует явление в целом, как долговременное понижение вероятности роста и деление облученных клеток без возникновения мутаций в генетическом материале (иными словами, нестабильность генома - это возрастание вероятности мутационных изменений). Другой подчеркивает, что клетки, обладающие после воздействия радиации геномной нестабильностью, генерируются с высокой частотой, хотя и не образуют однородного клона, а повреждения генома, которые в них обнаруживаются, случайны, непредсказуемы по частоте, времени проявления и выраженности.

РИНГ может передаваться многим поколениям клеток, образующимся путем репликации, причем генетические изменения, наблюдаемые в клетках дочерних поколений, отличаются от возникших изменений в “родительской”, то есть в самой облученной клетке. Радиация, в сущности, увеличивает частоту, с которой в выживших облученных клетках, точнее, в образуемых ими клеточных популяциях при нормальном функционировании возникают спонтанные генетические изменения [Little J.B., 1998].

Дестабилизация хромосом давно уже рассматривается как первый и прямой признак общей нестабильности генома. В силу различных причин общее число клеток с аберрациями хромосом с каждым митозом убывает. При этом клоны с хромосомной нестабильностью могут восстанавливать стабильность в следующей клеточной популяции, сохранять тот же уровень нестабильности или становиться еще более нестабильными [Ponnaija В., 1998].

Доля клеток с хромосомными аберрациями среди потомства клеток, подвергнутых воздействию г- или б-излучения в дозах 0,5, 1 или 3 Гр, после 30 удвоений была достоверно выше, чем в соответствующем контроле. Тип хромосомных аберраций (хроматидные разрывы, фрагменты и малые хромосомы) свидетельствовал о передаче хромосомной нестабильности в поколениях. Экспрессия нестабильности по этому показателю снижалась между 30-м и 72-м удвоениями популяции после облучения в дозах 0,5 и 3 Гр, и сохранялась до 72-го удвоения после облучения в дозе 1 Гр. При действии б-частиц экспрессия хромосомной нестабильности в потомстве клеток была более выраженной и почти не изменялась во времени. По мнению C. Mothersill и др. (2000), нестабильные хромосомные аберрации, характерные для РИНГ, могут приводить к апоптозу и вносить свой вклад в формирование отсроченной репродуктивной гибели/летальных мутаций в клетках HPV-G. По мнению авторов, не существует прямой корреляции и простых соотношений между двумя такими проявлениями РИНГ, как отсроченная репродуктивная гибель и хромосомные аберрации. В то же время корреляция отмечается между отсроченной репродуктивной гибелью и возрастанием числа клеток с микроядрами при РИНГ.

Лекция 15: Радиочувствительность животных

1. Видовая и популяционная радиочувствительность

Реакции животных на проникающее излучение весьма многообразны и определяются параметрами излучения и особенностями организма. Поэтому у животных разных видов, и даже у индивидуумов одного и того же вида, радиочувствительность будет неодинаковой. Она зависит от возраста, пола, упитанности, температуры, наличия или отсутствия кислорода и других факторов, существующих на момент облучения.

Для обозначения радиационной чувствительности животных используют величины летальных доз (ЛД). Это минимальные дозы облучения, которые вызывают смерть 50% (ЛД50/30) и 100% (ЛД100/30) облученных животных в течение 30 дней.

Противоположным радиочувствительности свойством организма является радиорезистентность - устойчивость к действию ионизирующих излучений

Причины различной радиочувствительности по видам животных пока объяснить не удается. Нет ни одной гипотезы, более или менее объясняющей этот феномен. Одно ясно, что млекопитающие - животные и человек - обладают наибольшей чувствительностью к облучению по сравнению с птицами, рыбами, земноводными и др [Белов А.Д. и др., 1999].

Таблица 15.1.

Видовая радиочувствительность: ЛД50/30, для различных систематических групп и видов организмов

Биологический вид	Доза ЛД50/30, Гр	Биологический вид	ДозаЛД50/30, Гр
Человек Обезьяна Собака Осел Кролик Хомяк Мыши разных линий Крысы разных линий	2,5 - 4 2,5 - 6 1,5 - 3 2,5 - 4 9 - 10 9 - 10 6 - 15 7 - 9	Птицы Рыбы Змеи Насекомые Растения	8 - 20 8 - 20 80 - 200 10 - 100 10 - 1500

Вероятно, большая радиочувствительность более высокоорганизованных организмов связана со сложностью их биохимической и физиологической организации, радиационные нарушения которой вызывают развитие различных патологий. Причем принцип большей устойчивости сложных систем за счет дублирования функций здесь не работает из-за того, что ионизирующая радиация действует одновременно на все, в том числе и регуляторные, системы организма на всех уровнях организации.

Кроме того, наиболее высокоорганизованные животные - птицы и млекопитающие - гомойотермны (гомойотермность - способность животных поддерживать постоянную температуру тела), а повышенная температура тела способствует интенсификации радиобиологических реакций и усиливает поражение [Симак С.В. и др., 1998].

В радиочувствительности организмов внутри одного вида и одной популяции имеются индивидуальные различия, обусловленные различиями в уровне обменных процессов, состоянием компенсаторных механизмов (репарационных систем), общей активностью животных во время лучевого воздействия [Симак С.В. и др., 1998]. В любой популяции 50% особей имеют средние значения показателя радиочувствительности. В популяции существует хоть малое количество сверх радиочувствительных и сверх радиорезистентных особей. Если на популяцию действуют малые дозы ионизирующих излучений, то к ней чувствительны самые радиочувствительные особи. С повышением дозы увеличивается число особей радиочувствительных к радиации.

Адаптация популяций к радиации возможна. Чем выше плодовитость и чем чаще смена поколений, тем легче адаптация. Но адаптация человеческой популяции к радиации неосуществима и недопустима. Для популяции гибель одной особи несущественна, а даже желательна, чем мутация, т.к. мутация несет с собой генетический груз.

2. Радиочувствительность органов и тканей

Различие радиочувствительности проявляется и в органах, составляющих организм как целое. Клетки одного органа также имеют неодинаковую степень чувствительности и способность к регенерации после лучевого поражения.

Степень радиочувствительности тканей характеризуют по функционально-биохимическим и морфологическим признакам. Органы по функционально-биохимическим признакам, определяющим сорбционный показатель тканей, выявляемый при их витальном окрашивании, можно распределить по радиочувствительности в следующей убывающей последовательности: большие полушария и ствол головного мозга, мозжечок, гипофиз, надпочечники, семенники, печень, селезенка, легкие, почки, сердце, мышцы, кожа и костная ткань.

По морфологическим признакам развивающихся пострадиационных изменений органы разделяются на три группы:

1) органы чувствительные к радиации: лимфоузлы, лимфатические фолликулы ЖКТ, красный костный мозг, ЖКТ, вилочковая железа, селезенка, половые железы. Морфологически регистрируемые изменения в них возникают уже при облучении дозой 0,25 Гр

2) органы, умеренно чувствительные к облучению: кожа, глаза;

3) органы, резистентные к действию ионизирующего излучения: печень, легкие, почки, сердце, кости, сухожилия, нервные стволы и др. Первичные морфологические изменения в них отмечаются при облучении дозой 1 Гр и более.

Из-за различной чувствительности органов для организма не безразлично, будет ли облучаться все тело равномерно либо часть его или организм получит общее, но неравномерное облучение. Общее равномерное облучение вызывает наибольший радиобиологический эффект. Экранирование при облучении даже небольшого участка тела повышает устойчивость организма к воздействию радиации. Выраженный защитный эффект проявляется при экранировании участка кости с красным костным мозгом, например головки одной из бедренных костей [Белов А.Д. и др., 1999].

3. Половые различия в радиочувствительности

Радиочувствительность кур заметно ниже, чем петухов (12 и 10 Гр соответственно). Вероятно, эта зависимость распространяется и на другие виды птиц. Представления о половых различиях в радиочувствительности млекопитающих до настоящего времени не устоялись. Имеются указания на то, что выживаемость быков выше, чем коров, однако в других работах эти различия не подтверждаются. Для свиней и ослов показано отсутствие различий в чувствительности самцов и самок. Правда, в период течки резистентность самок несколько повышается, что, вероятно, связано с защитным эффектом эстрогенов. Однако такие повышенные физиологические нагрузки, как беременность и роды значительно снижают радиорезистентность животных. Это связано с тем, что при беременности происходит угнетение всех звеньев иммунной системы.

4. Возрастная радиочувствительность

В ходе онтогенеза радиочувствительность организма млекопитающих и птиц значительно изменяется. Наиболее чувствительны молодые, растущие животные. Это связано с тем, что в их тканях преобладают активно делящиеся и потому радиочувствительные клетки. После окончания периода роста и созревания радиорезистентность значительно возрастает, а к старости опять снижается. Так для крупного рогатого скота в возрасте 3 дней летальная доза составляет 1,5 Гр, 3-5 месяцев - 4 Гр, для взрослых животных - 5,5 Гр и для старых - 2-4 Гр. Причиной этого является общее снижение уровня обменных процессов у старых животных и связанное с этим снижение эффективности систем постлучевой репарации [Симак С.В. и др., 1998].

Лекция 16: Основные эффекты облучения животных и человека

1. Непосредственные и опосредованные эффекты облучения

По механизмам развития последствий принято выделять непосредственные, опосредованные эффекты облучения.

Непосредственные эффекты облучения

Непосредственные эффекты облучения развиваются в период, следующий практически сразу за моментом облучения. Возникают они в результате прямого поражения молекулярно-клеточных структур и систем организма. К ним относятся острая и хроническая лучевая болезнь, поражения ключевых систем организма млекопитающих (система кроветворения, желудочно-кишечный тракт, ЦНС и др.).

Опосредованные эффекты облучения

Не все эффекты облучения связаны с изменениями происходящими непосредственно в клетках, оказавшихся мишенями электромагнитной волны или частицы высокой энергии. Непосредственно после облучения живой ткани в ней могут развиваться процессы, результатом которые является появление новых, опосредованных эффектов, непосредственно не вызванных лучом. К таким опосредованным эффектам облучения относятся: токсический эффект, иммунодефицит и инфекции, аутоиммунные процессы.

Токсический эффект

Все рассмотренные выше теории исходят из предположения, что лучевое поражение вызывается повреждением клеток и тканей, которые непосредственно подверглись действию радиации. Однако часть эффектов облучения не может быть объяснена таким образом и имеет более сложный механизм.

Так, в экспериментах по переливанию крови или даже одной кровяной сыворотки от облученного животного необлученному у последнего развиваются сглаженные симптомы лучевой болезни. При этом ни один орган, отвечающий за развитие лучевой болезни, воздействию ионизирующей радиации не подвергался. Объяснением наблюдаемых эффектов может служить появление в крови каких-то химических веществ, которые и вызывают лучевые симптомы. Специальные исследования показали, что этими веществами являются как продукты распада облученных и погибших клеток (свободные радикалы, освободившиеся внутриклеточные ферменты и др.), так и продукты извращенного облучением метаболизма. Фактически этот эффект является разновидностью интоксикации. Следует иметь в виду, что, хотя гуморальный (неклеточный) токсический эффект усиливает лучевое поражение, ведущую роль в развитии лучевой болезни играют поражения клеточных структур

Аутоиммунные процессы.

Одним из эффектов облучения является увеличение проницаемости тканевых барьеров. После гибели и лизиса пораженных клеток продукты их распада - радиотоксины, среди которых оказывается немало слабоизмененных или неизмененных белков, характерных для самого облученного организма - в значительных количествах оказываются в кровяном русле. Но в нормальной ситуации в крови их быть не должно. Иммунная система организма осуществляет постоянный контроль наличия в тканях чужеродных, измененных или отмерших компонентов - антигенов, отвечая на их появление образованием специфических антител. После облучения происходит выработка антител против собственных белков, оказавшихся в составе радиотоксинов - аутосенсибилизация. Ее последствия имеют двоякий характер. С одной стороны, дезактивация и удаление из организма радиотоксинов уменьшает токсический эффект и снижает степень поражения. С другой - появление в организме большого количества антител, специфичных к собственным клеткам на фоне увеличения проницаемости тканевых барьеров может приводить к серьезным повреждениям собственных тканей и органов организма.

Таким образом, за непосредственные эффекты облучения отвечают погибшие клетки, а за отдаленные - потомки видоизмененных выживших клеток.

2. Детерминированные (нестохастические) эффекты

По величине поглощенной дозы эффекты делятся на детерминированные и стохастические:

Детерминированные эффекты (нестохастические) - клинически значимые непосредственные лучевые реакции, связанные с клеточными утратами. Все детерминированные эффекты являются пороговыми, т.е. возникают только при достижении определенной дозы и усиливаются с ее увеличением.

Доза 0,2 - 0,5 Гр.

а) ранние, вскоре после облучения - проявляется в виде острой лучевой болезни (при общем облучении), либо при поражении отдельных органов, например кожи виде лучевых эритемы, ожогов и язв;

...