Изменения гемостаза и функционального состояния почек у крыс при длительной интоксикации хлоридом никеля

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изменения гемостаза и функционального состояния почек у крыс при длительной интоксикации хлоридом никеля

Гаглоева Э.М., к.м.н., асс. ФГБОУ ВО СОГМА, г. Владикавказ

Брин В.Б., д.м.н. проф., ФГБОУ ВО СОГМА г. Владикавказ; ИБМИ ВНЦ РАН, г. Владикавказ

Боциева Н.В. к.м.н., доц., ФГБОУ ВО СОГМА, г. Владикавказ

Молдован Т.В. к.м.н., доц., ФГБОУ ВО СОГМА, г. Владикавказ

Введение

Антропогенное загрязнение окружающей среды приводит к избыточному поступлению и накоплению соединений тяжелых металлов в организме, повреждению и нарушению функций практически всех органов и систем. Ранее было показано, что никелевая интоксикация сопровождается активацией перекисного окисления липидов, формированием окислительного стресса и повреждением мембранных структур [1].

Данные многочисленных экспериментальных и клинических исследований позволяют считать, что изменение процессов внутрисосудистого свертывания крови может быть компонентом многих заболеваний, влиять на патогенез различных патологических процессов. Тромбин является физиологическим регулятором функциональной активности и жизнедеятельности клеток [4]. Изменения системы гемостаза сопровождают патологию сердечно-сосудистой системы, гипертоническую болезнь, нарушения мозгового кровообращения, сахарный диабет, патологию печени и почек [4]. Однако, состояние свертывающей системы при токсической нефропатии, вызванной хлоридом никеля, не описано.

Целью данной работы было изучение влияния никеля на состояние системы гемостаза и функциональное состояние почек у крыс при длительной интоксикации хлоридом никеля.

Материалы и методы

Опыты проводились на крысах самцах линии Вистар весом 200-300 гр. Раствор хлорида никеля в дозе 5 мг/кг массы животного вводили через зонд в желудок, каждый день в течение двух недель (n=10 особей), одного (n=10) и двух месяцев (n=10). Контролем служили интактные животные (n=10), содержащиеся в стандартных условиях вивария, с внутрижелудочным введением соответствующего количества питьевой воды.

По окончании сроков экспериментов у крыс исследовали показатели функционального состояния почек в условиях шестичасового спонтанного диуреза, активность процессов перекисного окисления липидов в тромбоцитах, а также показатели сосудисто-тромбоцитарного и плазменного гемостаза через 2 недели, один и два месяца.

Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных» (1985) и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 01.04.2016 г. № 199). Под тиопенталовым наркозом у крыс забирали кровь из печеночного синуса (0,4 г на 100 гр.). Стабилизацию и получение образцов плазмы крови осуществляли с учетом международных стандартов [4].

В моче и плазме крови определяли содержание креатинина, общего белка и кальция спектрофотометрически («Solar-300», Беларусь) с использованием диагностических наборов «Агат-Мед», Россия. В плазме крови определяли уровень ионизированного кальция методом прямой потенциометрии на ионоселективном анализаторе «Кверти-Мед», Россия.

Для оценки функционального состояния свертывающей системы крови, определяли: агрегацию тромбоцитов (агрегометр «Solar», индуктор - АDP, конечная концентрация 10,0 мкг/мл); активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ); протромбиновое время (ПВ); лебетоксовое время (ЛЕТ); тромбиновое время (ТВ); содержание фибриногена по методу Клаусса; активность антитромбина III (АТ III); активность протеина С; концентрацию растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) определяли количественным вариантом фенантролинового теста; ХIIа- калликреин зависимый фибринолиз (ХIIа-ЗЛ) и концентрацию плазминогена в плазме крови. Исследование гемокоагуляционных свойств крови проводилось по стандартным методикам [3,4] с применением диагностических наборов фирмы «Технология стандарт» и «Ренам» (Россия). Уровень D-димеров - набором реактивов «Innovance D-dimer”, Siemens на приборе Sysmex 1500.

Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли содержание: малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах, гидроперекисей (ГП) (диеновые конъюгаты и диеновые кетоны) в плазме крови, активность каталазы по методу E.Beutler. Тесты выполнялись на спектрофотометре «Solar-300», турбидиметрическом коагулометре «CGL-2110» Solar (Беларусь).

Анализ результатов проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.) и Microsoft Excel 2003. Для количественной оценки данных рассчитывали описательные статистические показатели с вычислением медианы (Me) и [25-75] процентили выборки. Для оценки достоверности отличий вычисляли непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Взаимосвязи переменных анализировали методом ранговой корреляции (rs) Спирмена. Различия считали достоверными при значениях р < 0.05.

Результаты и обсуждение

интоксикация хлорид никель почка

Проведенные исследования показали, что у крыс через один и два месяца экспериментов происходило достоверное увеличение диуреза, вследствие уменьшения канальцевой реабсорбции воды (Рис.1.). Через два месяца развивалась гипопротеинемия, которая сопровождалась выраженной протеинурией. Увеличивалась экскреция натрия, вследствие уменьшения канальцевой реабсорбции катиона. Экскреция калия также была выше фоновых значений, вследствие увеличения фильтрационного заряда катиона в условиях гиперкалиемии.

Экскреция кальция увеличивалась вследствие уменьшения канальцевой реабсорбции катиона и тенденции к увеличению его фильтрационного заряда. Уровень общего кальция в плазме крови имел тенденцию к снижению, однако его ионизированная фракция достоверно возрастала. Полученные данные возможно свидетельствуют о поступлении Са2+ из костной ткани, что вызывает увеличение его ионизированной фракции, однако прироста общего кальция не происходит в условиях гипопротеинемии.

Рисунок 1. Влияние хлорида никеля на основные процессы мочеобразования и содержание белка в моче у крыс в условиях спонтанного диуреза при хронической интоксикации.

Проведенные исследования показали, что при внутрижелудочном введении хлорида никеля в дозе 5 мг/кг через две недели повышается уровень фибриногена в плазме крови. Увеличивалась агрегационная активность тромбоцитов, и возникала тенденция к увеличению их количества в крови. Выявлялось укорочение АЧТВ. Вместе с тем выявлялась активация протеина С. Это согласуется с экспериментальными данными авторов, выявивших наличие прокоагулянтной активности никеля, обусловленной Хагеман-зависимой активацией свертывания крови [7]

Рисунок 2. Влияние хлорида никеля на показатели агрегации тромбоцитов у крыс при хронической интоксикации.

Через один месяц интоксикации гиперкоагуляционная направленность показателей гемостаза возрастала. Сохранялась тенденция к увеличению количества тромбоцитов, увеличение их агрегационной способности. Уместно отметить, что лишь единичные работы демонстрируют изменения адгезивной и агрегационной активности тромбоцитов, освобождение индукторов агрегации и вторичную активацию коагуляционного гемостаза при токсическом воздействии некоторых тяжелых металлов - ртути, кадмия и свинца на мембраны тромбоцитов [5,6]. В отношении никеля подобных сведений в литературе нет.

Выявлялось укорочение и АЧТВ и ПВ. Активация системы свертывания крови сопровождалась тенденцией к повышению в кровотоке концентрации специфических молекулярных маркеров активации коагуляционного каскада - РФМК и Д-димеров. При этом активность маркеров антикоагулянтного звена - антитромбина III и протеина С также увеличивалась. Время лизиса эуглобулиновой фракции XIIа-ЗЛ - укорачивалось, что указывает на развитие компенсаторных реакций, направленных на ограничение роста коагуляционного потенциала (Рис 3.).

Рисунок 3. Влияние хлорида никеля на показатели системы гемостаза у крыс при хронической интоксикации.

Через два месяца интоксикации выявлялось подавление активности клеточного звена гемостаза - имела место тромбоцитопения (Рис.2.). Наблюдалась тенденция к уменьшению концентрации фибриногена в плазме крови. На фоне укорочения АЧТВ и тромбинового времени происходило удлинение протромбинового времени, при этом лебетоксовое время статистически не отличалось от интактного контроля. Изолированное удлинение ПВ при нормальном ЛЕТ может свидетельствовать о снижении активности VII фактора свертывающей системы [3], вероятно вследствие нарушения синтетической функции печени при металлотоксикозе. Это подтверждает ранее полученные данные, где при разных дозах никеля и в разные сроки интоксикации выявлялись дистрофические и некробиотические изменения в тканях почек, печени и сердца при хронической никелевой интоксикации [1].

Вместе с тем регистрировалось угнетение противосвертывающего звена гемостаза (снижалась активность антитромбина III), истощение резервных возможностей фибринолитической системы (замедление фXIIа-зависимого эуглобулинового лизиса) и достоверное увеличение ключевых маркеров тромбинемии - РФМК и Д-димеров.

Рисунок 4. Влияние хлорида никеля на показатели системы ПОЛ-АОЗ у крыс при хронической интоксикации.

Изменения параметров системы гемостаза у животных при хронической интоксикации никелем коррелировали с изменениями активности процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантных ферментов.

Снижение активности каталазы сочеталось с увеличением концентрации малонового диальдегида, выявлялось истощение уровня гидроперекисей в плазме крови относительно фоновых значений, что свидетельствует об активации процессов липопероксидации у крыс (Рис. 4.).

Выявлена значимая положительная корреляция энзиматической активности каталазы с антитромбином III (rs=0,73;Р<0,05), а также высокая степень обратной корреляции с показателями XIIa-ЗЛ (rs=-0,69;Р<0,05). Изменения показателей РФМК и сдвиги МДА были ассоциированы тесно положительно (rs =0,77;Р<0,02). Это может свидетельствовать о роли свободнорадикального окисления в механизмах активации внутрисосудистого свертывания крови [2], угнетении противосвертывающего и фибринолитического звеньев гемостаза и развития тромбинемии при никелевой интоксикации.

Заключение

Опыты показали, что при внутрижелудочном введении хлорида никеля начальной реакцией системы гемостаза на токсическое воздействие является развитие прокоагулянтных тенденций с параллельной активацией противосвертывающей и фибринолитической систем гемостаза. По мере увеличения продолжительности и интенсивности токсического воздействия сбалансированность в реакциях свертывающей и фибринолитической систем постепенно сменяется нарастающей гиперкоагуляцией, снижением антикоагулянтной и фибринолитической активности, вплоть до появления в кровотоке признаков тромбинемии и угрозы развития внутрисосудистого свертывания крови. У крыс при хронической токсической нефропатии происходят достоверные изменения концентрации продуктов ПОЛ в крови, активности антиоксидантной системы и сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Изменение данных показателей и степень их выраженности, возможно, являются одним из звеньев развития патологии почек при хронической никелевой интоксикации.

Литература

1. Брин В.Б., Кокаев Р.И. Эффекты хлорида никеля на фоне кальцитонин-опосредованной гипокальциемии. Владикавказский медико-биологический вестник. 2015; 21(31): 19-24.

2. Бышевский А.Ш., Карпова И.А., Полякова В.А. Внутрисосудистое свертывание крови, коагулоактивность тромбоцитов и толерантность к тромбину. Москва; 2015. 96с.

3. Момот А.П., Цывкина Л.П., Тараненко И.А. Современные методы распознавания тромботической готовности. Барнаул, Изд-во Алт. ун-та; 2011. 138 с.

4. Петрищев Н. Н. Папаян Л.П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Санкт-Петербург; 1999. 120 с.

5. Подолян С.К. Вплив хлористого свинцю на систему регуляції агрегатного стану крові у білих щурів. Буковинський медичний вісник. 1998; 3: 131-136.

6. Arbi S, Oberholzer HM, Van Rooy MJ, Venter C, Bester MJ. Effects of chronic exposure to mercury and cadmium alone and in combination on the coagulation system of Sprague-Dawley rats. Ultrastruct Pathol. 2017; 15: 1-9. DOI:10.1080/01913123.2017.1327909).

7. Mutch NJ1, Waters EK, Morrissey JH. Immobilized transition metal ions stimulate contact activation and drive factor XII-mediated coagulation, J Thromb Haemost., 2012; 10(10): 2108-2115. DOI: 10.1111/j.1538-7836.2012.04890.x.

Размещено на Allbest.ru