Аналіз поліморфізму гену інсуліну в популяції м’ясо-яєчних курей методом ПЛР-ПДРФ

Размещено на http://www.allbest.ru/

Аналіз поліморфізму гену інсуліну в популяції м'ясо-яєчних курей методом ПЛР-ПДРФ

Шуліка Л.В., м. н. с.

Інститут тваринництва НААН

Представлено результати аналізу поліморфізму гену інсуліну за мутаціями Т+3737С і А +397Ю в популяції курей лінії Г2 породи Плімутрок білий. Генотипи курей визначали методом ПЛР-ПДРФ з використанням рестриктази MspI. Локус виявився поліморфним за обома маркерами. Показано низький рівень поліморфності для Т+3737С (пє=1,07) та високий - для А+397Ю (п=2,00). Частоти генотипів за мутацією Т+3737С становили: СС - 0; СГ - 0,07; ГГ - 0,93; за мутацією А+397Ю: АА - 0,25; ЛО - 0,54; 00 - 0,21. Частоти алелів склали:для мутації Т+3737С: С- 0,035 і Т- 0,965; для А+397Ю: А - 0,520 і G - 0,480. Дослідна популяція знаходилась у стані генетичної рівноваги за обома маркерами. Проведено порівняння генетичної структури дослідженої популяції з іншими по родами та лініями курей. Показано, що дослідна популяція за генетичною структурою дещо відрізняється від лінії 38 породи Род-айленд червоний.

Ключові слова: ген інсуліну, поліморфізм, рестрикція, ДНК-маркери, кури.

Наразі використання ДНК-технологій стало своєрідним «золотим стандартом» для вирішення низки питань у галузях генетики, розведення та селекції, збереження генофонду у тваринництві [1], птахівництві [2-3], рослинництві [4]. Аналіз ДНК-поліморфізму на теперішній час вважається підґрунтям для ефективної племінної та селекційної роботи на рівні світових стандартів. У ряді найбільш розвинених держав (США, країни ЄС тощо), є обов'язковою сертифікація племінного матеріалу з використанням ДНК-маркерів, а селекційні програми залучають досягнення молекулярної генетики для отримання найбільшої економічної вигоди [3, 5]. У країнах СНГ також ведеться інтенсивна робота у даних напрямках [6, 7].

В Україні в останнє десятиріччя стан племінної роботи у птахівництві не є задовільним через орієнтацію на імпортну продукцію та скорочення вітчизняних племінних ресурсів [8]. Необхідного підвищення ефективності комплексу селекційно-племінних заходів стосовно місцевих генофондних ресурсів можна досягти з використанням ДНК-маркерів, що дозволяють аналізувати безпосередньо спадковий матеріал птиці та підвищити інтенсивність процесу селекції [4, 6]. Незважаючи на очевидну перспективність даного напряму досліджень, на сьогодні генетичні ресурси вітчизняних ліній курей за ДНК-поліморфізмом ще недостатньо вивчені.

Останнім часом в Україні проводився аналіз генетичних ресурсів вітчизняних генофондних популяцій курей із застосуванням ДНК-маркерів [2, 9]. В той же час, зостається ціла низка локусів, не охоплених даними дослідженнями, проте функціональний поліморфізм яких представляє значну цікавість. Серед таких генів можна відмітити і ген інсуліну [10].

У курей ген інсуліну (INS) локалізований в межах хромосоми 5, складається з 3 екзонів і 2 інтронів, кодує пептидний гормон інсулін [11]. INS впливає на обмін вуглеводів, ліпідів і білків, виявляє стимулюючу дію на ріст і поділ клітин та супресивну - на апоптоз [12]. Показано наявність поліморфізму гену інсуліну у ряді порід курей закордонної селекції [13, 14]. Окрім того, виявлено асоціації між алельними варіантами локусу INS та м'ясною продуктивністю деяких порід. У літературі є свідчення про вплив точкових мутацій T+3737C і A+3971G, локалізованих у другому інтроні та 3'-UTR гену інсуліну, відповідно, на такі показники як жива маса та маса грудних м'язів в межах окремих порід курей [1 1]. Обидві мутації зручно типувати завдяки розташуванню в межах сайтів рестрикції для MspI, що дозволяє використовувати недорогий та високовідтворюваний метод ПЛР- ПДРФ. Досліджень щодо вивчення поліморфізму гену інсуліну за вищезазначеними мутаціями в лініях курей, що відносяться до українського генофонду, до цього часу не проводилось.

Виходячи з цього, мета дослідження - проаналізувати наявність поліморфізму гену інсуліну за мутаціями T+3737C і A+3971G методом ПЛР-ПДРФ та оцінити його основні параметри статистичними методами в популяції м'ясо - яєчних курей лінії Г2 української селекції.

Матеріали та методи досліджень. Дослідження було проведено на популяції курей м'ясо-яєчного типу продуктивності породи плімутрок білий (лінія Г2). Дослідна група курей (n=100) утримувалась у віварії Державної дослідної станції птахівництва НААН.

Визначення генотипів курей проводили в лабораторії молекулярно-генетичних і фізіолого-біохімічних досліджень у тваринництві Інституту тваринництва НААН у 2016 році. У якості джерела ДНК використовували кров. Зразки біологічного матеріалу отримували індивідуально від кожної особини, ретельно маркували та пакували окремо.

ДНК виділяли комерційним набором «ДНК-сорб В» (Атрі^ем, ЯР). Метод ПЛР-ПДРФ, використаний для генотипування, включав у себе ампліфікацію з наступною обробкою отриманого ампліфікату рестриктазою MspI згідно рекомендацій виробника ^ЇЬЕ^уте, RF). Для постановки ПЛР використовували прай- мери: 5'-с1сса1§1§§сйсссї§1а-3' і 5'-§§сйс駧с1а§й§са§1-3' - для мутації Т+3737С; 5'- §§їаїсї§аааа§с§§§їсїс-3' і 5'-aatgctttgaaggtgcgatag-3' - для А+397Ш [11]. Кінцева концентрація праймерів становила 0,2 мкМ; об'єм реакційної суміші - 10 мкл. Програма ампліфікації: початкова денатурація - 94 °С/5 хв; 35 циклів - 94 °С/30 с, 58 °С/60 с, 72 °С/60 с; фінальна елонгація - 72 °С/10 хв. Рестрикційні фрагменти розподіляли в 3%-му агарозному гелі з додаванням бромистого етидію (200 V/ 30 хв). Для візуалізації результату використовували УФ-трансілюмінатор (довжина хвилі - 312 нм). Для мутації Т+3737С генотипу ТТ відповідає фрагмент 370 п.н., CC - 233 і 137 п.н., СТ - 370, 233 і 137 п.н. У випадку мутації А+397Ш гомозиготі АА відповідає фрагмент довжиною 281 п.н., GG - 232 і 49 п.н.; гетерозиготі AG - 281, 232 і 49 п.н.

Поліморфізм за обома ДНК-маркерами було оцінено шляхом аналізу кількості та частот генотипів і алелів, ступеня фактичної (НД та очікуваної (Нє) гетерозиготності, величин індексу фіксації Райта (Т^), ефективного числа алелів (пє), відповідності розподілу генотипів стану генетичної рівноваги (х2), розрахованих за загальноприйнятими методиками [15, 16].

Результати досліджень. За MspI-поліморфізмом у другому інтроні гену інсуліну (мутація T+3737C) виявлено патерни рестрикції, що відповідають генотипам СТ і ТТ; гомозиготи СС відсутні. Що стосується MspI-поліморфізму у 3'- UTR-області (мутація А+397Ш - в наявності особини з усіма можливими генотипами - AA, AG, GG.

На основі даних про індивідуальні генотипи курей досліджено розподіл їх частот у популяції за кожним маркером окремо (рисунок). У випадку мутації Т+3737С популяція майже цілком складається з особин з генотипом ТТ (93%). У разі мутації А+397Ш спостерігається переважання частоти гетерозигот AG (більше 50% особин в популяції). Слід відмітити значну різницю у профілях розподілу генотипів за двома дослідженими мутаціями, незважаючи на те, що обидві вони локалізовані у безпосередній близькості одна до одної в межах одного й того ж гену - відстань між ними не перевищує 250 п.н.

Рис. Розподіл генотипів за мутаціями T+3737C та A+3971G локусу інсуліну у популяції курей породи плімутрок білий (лінія Г2).

Щодо розподілу частот алелів, за мутацією Т+3737С показано істотне переважання частоти алеля Т, в той час як для А+397Ш частоти алелів А і G мали приблизно однакові значення (табл. 1). Оскільки в обох випадках частота найбільш розповсюдженого алеля не перевищує порогового значення 0,99, досліджені маркери можна вважати поліморфними для лінії Г2.

Таблиця 1. Основні генетико-популяційні показники дослідної лінії курей за мутаціями Т+3737С і А+397Ю гену інсуліну