Можливості використання електрофорезу запасних білків насіння в насінництві льону олійного

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут олійних культур НААН

Можливості використання електрофорезу запасних білків насіння в насінництві льону олійного

Ю.О. Махно

Льон олійний є однією з найперспективніших технічних культур, яка знаходить своє застосування в багатьох галузях промисловості, медицині та продовольства. Посівні площі під льоном олійним у світі постійно зростають і на сьогодні вони займають понад 7 мільйонів гектарів. Площі льону в Україні також характеризуються значною динамікою росту (Shevchenko et al. 2017).

Ця культура є унікальною завдяки високому вмісту а-ліноленової поліненасиченої жирної кислоти, яка є структурним компонентом клітинних мембран і необхідна в раціоні людини (Ipatova et al. 2004). Рівень вмісту даної кислоти в насінні льону визначає напрями його використання - технічне і харчове (FAOstat). Інститут олійних культур НААНУ (ІОК НААН м. Запоріжжя) є провідною науковою установою з селекції льону олійного в Україні. Співвідношення сортів, створених Інститутом олійних культур і сортів інших селекційних установ, внесених до Реєстру сортів рослин України в 2018 році, становить: 50,0% - селекції ІОК НААН, 41,7% - інші установи, 8,3% - іноземна селекція (State Register 2018).

В процесі селекції, насінництва та виробництва льону важливо підтримувати генетичну чистоту сортів і ліній. Причинами нестабільності генетичних систем можуть бути перезапилення, мутації, механічне засмічення, прояв окремих ознак при розщепленні в поколіннях та ін. Типова класифікація та сертифікація сортів льону здійснюється виключно за морфологічними характеристиками.

Таким чином, оцінка сортової чистоти посівів шляхом апробації і контроля ґрунту не завжди може гарантувати сортову чистоту насіння на заключних етапах виробництва. У випадках порушення технологічної дисципліни на етапах збирання, транспортування, зберігання, сушіння та сортування можливі сортові забруднення або перемішування партій насіння різних сортів. В результаті дані апробації та фактична чистота партій насіння можуть значно відрізнятися.

По суті, інші можливості здійснення контролю за чистотою сортів льону олійного забезпечують методи біохімічної ідентифікації, засновані на виявленні запасних білків в якості генетичних маркерів. Різноманітність запасних білків насіння визначається електрофорезом, результатом якого є унікальний «білковий паспорт», характерний тільки для певного сорту (Konarev et al. 1993). У даний час метод електрофорезу запасних білків насіння залишається простим і надійним способом ідентифікації сортів при сортових випробуваннях, в селекції, виробництві насіння і контролем за насінням багатьох сільськогосподарських культур.

Беручи до уваги зацікавленість держави в збільшенні площ під льоном олійним, проведення селекційних досліджень і наявність досить великої кількості сортів льону олійного в Реєстрі сортів рослин України (State Register 2018), питання біохімічної ідентифікації генотипів та створення банку даних за електрофоретичними спектрами є вкрай актуальним.

Метою проведених досліджень є визначення критеріїв внутрішньовидової диференціації шляхом оцінки сортів льону олійного методом електрофорезу запасних білків насіння.

Матеріали та методи досліджень

Електрофорез запасних білків льону олійного в поліакриламідному гелі виконували в лабораторії масових аналізів і приборовимірювальних комплексів Інституту олійних культур НААН за розробленим способом для цієї культури (Makhno et al 2007). Електрофорез проводили на приладі PROTEIN II XI (Bio rad, США) в однакових умовах. Аналізу піддавалися білки (глобуліни) з індивідуальних насінин. Електрофореграми знімали в трьох повтореннях для кожного варіанту досліду. Для розподілу запасних білків використовували поліакриламідний гель із концентрацією 11,8%. Джерело струму 0,08 А, напруга 400 V. Гелеві пластини фарбували в попередньо приготовленій фарбі, яка містила 0,2 г Соомаssi Brilliant Blue R-250 (Sigma-Aldrich, США).

Отримані білкові фракції, виявлені на електрофореграмах, характеризувалися величиною відносної електрофоретичної рухливості (rf), розраховані відносно рухливості розчину обважнювача. Позиції білкових компонентів для формування в зони визначали за їх відносною рухливістю (Konarev et al. 1993). Вирощування матеріалу та підтримання генетичної чистоти проводилося відповідно до загальноприйнятих методик (Lyakh et al. 2008). Результати дослідження окремих білкових компонентів на електрофоретичних спектрах обробляли методом дисперсійного аналізу за Г. Ф. Лакіним (Lakin, 1990).

Матеріалом дослідження слугували сорти селекції Інституту олійних культур НААН України: Водограй, Орфей, Золотистий, Айсберг, Південна ніч (сорт-контроль).

Результати досліджень та їхнє обговорення

У ході вивчення запасних білків льону олійного нами була розроблена методика електрофоретичного розділення запасних білків насіння льону, яка надала можливість розрізняти генотипи льону олійного за білковим фенотипом і визначати генетичну однорідність насіннєвого матеріалу.

У результаті проведеного нами понасіннєвого аналізу електрофоретичного розподілення запасного білку сортів льону олійного був отриманий монотипний спектр. Порівняльний аналіз досліджуваних сортів проводили з використанням сорту-контролю Південна ніч. Даний сорт за попереднім аналізом був визначений як монотипний, що не давав розщеплення за спектром запасного білку насіння, і тому використовувався в якості контролю (рис.).

Також була розроблена ідентифікація електрофоретичних спектрів запасних білків льону олійного, заснована на їх детальній характеристиці за наявністю, станом, інтенсивністю прояву і кількістю білкових компонентів окремих генотипів льону. Слід зазначити, що досліджувані сорти льону олійного мають різне походження, відрізняються між собою за маркерними і господарсько-цінними ознаками. Також представлені сорти мають певні відмінності за спектром запасних білків насіння.

Рис. Електрофоретичні спектри запасних білків насіння льону олійного: I, II, III, Ша, IV, V - білкові зони

При електрофоретичному розподілі запасних білків з насіння льону спостерігається розподіл пептидів на зони, позначені нами як I, II, III, IV, V у порядку збільшення електрофоретичної рухливості. Білкові зони I, II, III визначені нами як стабільні, оскільки вони спостерігалися в усіх досліджуваних генотипів. Прояв даних зон в спектрі є характерним для роду Linum L. Тоді як варіабельний прояв компонентів у спектрах сортів спостерігався у білкових зонах IV, V, що говорить про ту чи іншу сортову приналежність. Додаткова зона білкових компонентів, що проявлялася на електрофореграмі сорту Водограй позначена як ІІІа і також віднесена до категорії варіабельних зон. льон електрофорез білок насіння

У цілому сорти, що досліджувалися, розрізнялися за спектром запасних білків насіння, але деякі з них мали близькі електрофоретичні спектри. Так, при порівнянні з сортом-контролем можна відзначити, що в спектрі сорту Золотистий відсутня IV зона білкових компонентів, а сорту Айсберг - V. У спектрі сорту Водограй спостерігається відсутність білкового компонента в IV зоні, але відмічена поява компонента в додатковій Ша зоні. Дана особливість відображає рівень і характер міжсортового поліморфізму.

При порівнянні білкових спектрів за окремими компонентами ми враховували кілька особливостей: унікальні компоненти, які зустрічаються тільки у певного сорту; компоненти з однаковою електрофоретичною рухливістю, але різним ступенем інтенсивності (відмінності по дозі гена) і компоненти з однаковою інтенсивністю і рухливістю, що зустрічаються у всіх досліджуваних генотипів (табл.).

Таблиця Міжсортове порівняння сортів льону олійного за відмінними позиціями білкових компонентів (2014-2016 рр.)

Виходячи з даних таблиці, міжсортова диференціація досліджуваних сортів обумовлена наступними критеріями - унікальні, мають одиничну представленість за певними генотипами - величиною відносної рухливості, ступеня інтенсивності, присутності-відсутності компонентів. Дані критерії оцінки відносилися до варіабельних і додаткових варіабельних зон. У цілому сорти Айсберг і Золотистий мали однакові частоти прояву маркерних сортових компонентів у кількості: унікальні - 28,6%, відсутність компонента - 42,9 %. Найбільше число таких компонентів ідентифіковано у сорту Водограй (80% від загальної кількості компонентів електрофоретичного спектра), а найменше число (14,3%) - у сорту Орфей.

Висновки

У результаті досліджень встановлено характер міжсортового поліморфізму за електрофоретичними спектрами запасного білку насіння льону і виявлений ряд стабільних та варіабельних білкових зон. Встановлено критерії міжсортової диференціації льону олійного, що дозволило ідентифікувати загальні, сортоспецифічні й унікальні компоненти. Виявлені нами відмінності сортів за електрофоретичними спектрами є основою для проведення їх ідентифікації та паспортизації з метою подальшого впровадження в насінництво льону олійного.

Література

1. Shevchenko IA, Lyakh VO, Polyakov OI et al. (2017) Strategy of production of oilseeds in Ukraine (rare crops). (Стратегія виробництва олійної сировини в Україні (малопоширені культури) Part I - linseed oil, mustard. Institute of Oilseed Crops of Ukraine, Zaporozhye.

2. Ipatova OM, Prozorovskaya NN, Baranova VS, Guseva DA (2004) Biological activity of flaxseed oil as a source of omega-3 alpha-linolenic acid.Biomedical chemistry (Биологическая активность льняного масла как источника омега-3 альфа-линоленовой кислоты) 50 (1): 25-27.

3. Linseed (2019) State Register of Plant Varieties, Applicable to Distribution in Ukraine (Державний реєстр сортів рослин, придатних для поширення в Україні) . http://sops.gov.ua/reestr-sortiv-roslin. Accessed 16 January 2018

4. Konarev VG, Gavrilyuk IG, Gubarev NK, et al. (1993) Molecular biological aspects of applied botany, genetics and breeding (Молекулярно-биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции). Kolos, Moscow.

5. Lakin GF (1990) Biometrics (Биометрия) High School, Moscow.

6. Makhno YuO et al (2007) Method of electrophoretic distribution of flax seed proteins (Спосіб електрофоретичного розподілення запасних білків насіння льону). Patent № U 2007 072 99, September 12, 2007

7. Lyakh VO, Polyakova IO (2008). Breeding of Linseed (Селекція льону олійного). Guidelines. Zaporizhzhya National University, Zaporizhzhya

Анотація

Представлена оцінка сортів льону олійного (Водограй, Орфей, Айсберг, Південна ніч, Золотистий) методом електрофорезу запасних білків насіння. Виявлений прояв I, II, III - стабільних зон, Ilia, IV, V - варіабельних білкових зон в електрофоретичному спектрі зразків, що досліджувалися. Визначено критерії внутрішньовидової диференціації льону олійного, що дозволило виявити загальні, гетерогенні та унікальні компоненти. Рекомендується використовувати представлену ідентифікацію та сертифікацію з використанням методу електрофорезу запасних білків у виробництві насіння льону.

Ключові слова: льон олійний, електрофорез, електрофоретичний спектр, стабільна зона, варіабельна зона, унікальний компонент.

Представлена оценка сортов льна масличного (Водограй, Орфей, Айсберг, Пивденна нич, Золотистый) методом электрофореза запасных белков семян. Обнаружено проявление I, II, III - стабильных зон, П^, IV,

Ключевые слова: лен масличный, электрофорез, электрофоретический спектр, стабильная зона, вариабельная зона, уникальный компонент.

In the process of breeding, seed production and flax production, it is necessary to maintain the genetic purity of varieties, lines. Instability of genetic systems can be over-burning, mutation, mechanical clogging, the manifestation of individual features in splitting in generations. Classification and certification of flax varieties are carried out exclusively by morphological characteristics.

Keywords: linseed, electrophoresis, electrophoretic spectrum, stable zone, variable zone, unique component.

Размещено на Allbest.ru