Генетико-біохімічні аспекти зв’язку алельного складу локусу Ppd-D1 і стійкості озимої м’якої пшениці до низької температури

Дослідження особливостей експресії антиоксидантних ензимів (неспецифічних і специфічних пероксидаз, каталази, супероксиддисмутази) у рослин за нормальних умов та за дії низької позитивної температури. Різниця між сортами за всіма показниками експресії.

Рубрика Сельское, лесное хозяйство и землепользование
Вид статья
Язык украинский
Дата добавления 06.07.2020
Размер файла 3,9 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генетико-біохімічні аспекти зв'язку алельного складу локусу Ppd-D1 і стійкості озимої м'якої пшениці до низької температури

В.А. Топтіков, к. б. н., доцент

С.В. Чеботар, д. б. н., професор

Анотація

антиоксидантний ензим рослина сорт

Досліджували особливості експресії антиоксидантних ензимів (неспецифічних і специфічних пероксидаз, каталази, супероксиддисмутази) у рослин за нормальних умов та за дії низької позитивної температури. Досліджували два сорти з різними алелями локусу фотоперіодичної чутливості Ppd-D1 та контрастних за стійкістю до гіпотермії. Показана різниця між досліджуваними сортами практично за всіма показниками експресії антиоксидантних ензимів (активності, частки у спектрі окремих форм, ступеню зв'язку з мембранними структурами, ступеню і напряму змін, співвідношенню активності різних ензимів) як у контрольних умовах, так і за умов досліду.

Озимі форми пшениці мають значно більшу врожайність, ніж ярі. Однак, успішне використання озимих форм може суттєво обмежуватись, особливо в зонах ризикованого землеробства. Однією з властивостей, що лімітує у несприятливі роки продуктивність деяких озимих сортів є незначна холодо- і зимостійкість. Крім спеціальних генів f wcs120, cbf, tacr7 та ін.), велике значення щодо формування резистентності до низьких температур мають генні системи, відповідальні за розвиток рослин, в тому числі гени фотоперіодичної чутливості - Ppd [4; 5; 11; 13; 17; 20; 25; 27]. Гени індивідуального розвитку взаємодіють як між собою, так й з множиною інших генів, виконуючи роль тригерів, що ініціюють ланцюг наступних подій в житті рослини та реалізації їх властивостей [16; 19; 29; 39; 41].

Механізми плейотропної дії генів Ppd практично не вивчені. Для з'ясування генетико-біохімічних механізмів впливу генів фотоперіодичної чутливості на фізіологічні властивості рослин важливо, на нашу думку, дослідження особливостей експресії ензимів у різних за алельним складом цієї генетичної системи.

Зі складного комплексу ензимів живих організмів великий інтерес викликають ензими антиоксидантної системи, функціонування яких забезпечує адаптивність організмів за впливу будь-яких факторів довкілля [2]. Антиоксидантні ензими грають ключову роль у регуляції вмісту та балансу в клітинах активних форм кисню (АФК). АФК, як відомо, крім негативної дії виконують функції посередників та сигнальних молекул в реакції у відповідь на вплив різних факторів середовища, низьких температур зокрема [3; 8; 16; 23; 24; 34; 35; 43]. Робіт, які б свідчили про вплив генів фотоперіодичної чутливості на експресію антиоксидантних ензимів, ми не знайшли. В зв'язку з цим, метою роботи було вивчити експресивність деяких ензимів за впливу несприятливих температурних умов на рослини, що відрізняються за алельним складом генів Рpd. В межах поставленої мети виконували такі завдання: 1) провести якісний та кількісний аналіз електрофореграм множинних форм антиоксидантних ензимів (каталаз, пероксидаз, супероксиддисмутаз); 2) встановити чи є зв'язок між показниками спектрів досліджуваних ензимів і толерантністю до низьких температур та алельним складом гену Ррё-Р1.

Матеріали та методи дослідження

Дослідження проводили на етіольованих паростках двох сортів озимої м'якої пшениці, які відрізняються за алельним складом генів фотоперіодичної чутливості - Миронівська 808 і Тіра. У Миронівської 808 усі алелі цієї системи рецесивні (PpD-A1b, PpD-Bb, PpD-D1b) тоді, як у сорту Тіра присутній домінантний алель PpD-D1а [11].

Експеримент здійснювали за такою схемою. Насіння пророщували у пластмасових кюветах у багатошаровому фільтрувальному папері в темряві при 26-27 °С протягом чотирьох діб. Потім одну половину рослин продовжували вирощувати за тих ж умов - «контроль». Другу половину паростків переносили у холодильник (2-4 °С) - «дослід». Для подальших досліджень через 2, 8, 24 і 72 години відбирали для кожного варіанту пагони з 10-15 рослин.

Визначали сиру масу, а також масу паростків, зневоднену після триразової обробки ацетоном при 2-4 °С. Отримання тканинних гомогенатів для електрофоретичного аналізу ензимів та електрофорез проводили, як описані раніше [9]. Препарати розчинних форм ензимів одержували за допомогою буферу без додавання детергенту, препарати мембранозв'язанних та інших міцно зв'язаних форм - після наступного екстрагування препаратів буфером з Тритоном Х-100 (далі в тексті - «зв'язані форми»).

Ензими в гелях детектували відповідно рекомендацій [30]. Неспецифічну пероксидазну активність (КФ. 1.11.1.7) виявляли з використанням бензидину як субстрат ензиму, аскорбінатпероксидазну (КФ. 1.11.1.11) і супероксид- дисмутазну (КФ 1.15.1.1) - проявляли по відновленню нітротетразолієвого синього. Каталазну активність (КФ. 1.11.1.6) виявляли за забарвленням крохмалю відновленим йодом. Специфічність множинних форм пероксидази до ферулової кислоти виявляли за допомогою підходу, запропонованого у роботі [40]. Принцип методу ґрунтується на конкуренції між різними субстратами пероксидаз. Ферулова кислота на відміну від бензидину не дає забарвленого продукту окислення. Порівнюючи спектри неспецифічної пероксидази, отримані при використанні суміші субстратів бензидин + ферулова кислота зі спектром після фарбування бензидином, можна визначити ензим, специфічний до конкурентного субстрату (в даному випадку - до ферулової кислоти) і розрахувати його активність.

Електрофореграми документували за допомогою сканувальної приставки до комп'ютера і провадили кількісний аналіз отриманих денситограм за комп'ютерною програмою АнаИС (М.А. Поджарский, Д.Г. Рибалка). Визначали кількість множинних форм ферментів, їх відносну електрофоретичну рухливість (Rf) та питому вагу (частку) у відсотках у загальному спектрі. Ферментативну активність оцінювали за площею піків на денситограмах відповідних множинних форм, і розраховували в умовних одиницях (пікселях) на 1 мг сухої тканини (далі в тексті - «од/мг»). Зазначений спосіб не показує істинний рівень ферментативної активності, але є інформативним для порівняльних досліджень.

Ступінь інгібування росту рослин та змін показників спектрів ензимів (А) за впливу низьких температур розраховували за формулою:

А = (К - Д)/К х 100%,

де К і Д - значення показників у контролі та досліді відповідно.

Результати досліджень опрацьовували з використанням пакету програм Microsoft Excel. Достовірність різниці між порівнюваними варіантами розраховували за допомогою парного двохвибіркового t-тесту.

Результати та їх обговорення

Зниження температури в дослідних варіантах призводило до гальмування росту рослин обох сортів. Однак, як видно з рис. 1, зменшення маси паростків у порівнянні з контролем більш суттєвим було у сорту Тіра. Це добре узгоджується з відомим фактом про максимальний у порівнянні з іншими гомеологічними генами негативний вплив домінантного алелю PpD-D1a на зимо-морозостійкість [11].

Для з'ясування ролі ензимів в адаптації рослин важливо, з одного боку, оцінити їх початковий стан, що свідчить про «готовність» рослини до захисту від пошкоджувальної дії стресового чинника. З іншого боку, важливим показником пристосувальних можливостей є особливості змін, що виникають у відповідь на несприятливі умови.

Одним з перших етапів адаптації до дії низьких температур є детоксикація активних форм кисню [44]. Відомо, що провідними ензимами, що виконують зазначену функцію, є різні пероксидази і каталази, які руйнують пероксиди, та супероксиддисмутази (СОД), що нейтралізують супероксидні радикали. На рис. 2 показані спектри досліджуваних ензимів у нормальних умовах культивування.

Рис. 1. Інгібування росту пагонів (%) під впливом низької температури за час експозиції (години): а - сира маса, б - маса зневоднених ацетоном паростків, суцільна лінія - сорт Миронівська 808, переривчата лінія - сорт Тіра

Неспецифічна пероксидаза (гваякол-пероксидаза, пероксидаза ІІІ, класична пероксидаза) виявлена як серед розчинних, так і серед зв'язаних форм білків. Всього в спектрах обох сортів було до десяті множинних форм (рис. 2 а, б). За кількісного аналізу електрофоретичних спектрів виявлені форми ензиму об'єднали у три фракції: малорухливу (значення Rf 0,04, 0,06 і 0,08), зі середньою рухливістю (Rf 0,11, 0,14, 0,16 та 0,20) та швидко рухливу (Rf0,40, 0,42 і 0,45). Як видно з табл. 1, у розподілі форм пероксидази по спектрах суттєвих, достовірних розбіжностей між сортами не встановлено. Проте, експресивність пероксидаз, що визначалась за їх активністю, значно вище в сорту Миронівська 808. Зазначена різниця торкалась в першу чергу малорухливих і швидко- рухливих форм ензиму.

Для з'ясування адаптивної значущості ензиму важливо визначити не тільки його загальну активність (загальну експресивність) та кількість, активність і питому вагу окремих множинних форм (кількість генів і алелів ензиму та їх індивідуальну експресію). Також важливо визначити внутрішньоклітинну локалізацію окремих форм ензиму [1; 10; 12; 28]. В зв'язку з цим окремо досліджували зв'язані форми пероксидази та їх частку від загальної активності ензиму. Ці форми ензиму екстрагуються тільки за допомогою неіонних детергентів, оскільки знаходяться у міцному зв'язку з мембранними структурами клітин, або всередині субклітинних органел. Зв'язані пероксидази можуть виконувати інші функції у порівнянні з цитозольними (розчинними) формами [7; 31].

Рис. 2. Електрофоретичні спектри досліджуваних ензимів у контрольних рослин: а - пероксидаза неспецифічна розчинна, б - пероксидаза неспецифічна зв'язана, в - каталаза розчинна, г - каталаза зв'язана, д, е - спектри пероксидази при забарвленні сумішшю бензидин + ферулова кислота, д - розчинна форма, е - зв'язана форма, ж - аскорбінатпероксидаза, з - СОД; зображення спектрів аскорбінатпероксидази і СОД інвертовано;1-4-Миронівська 808,5-6-Ті-; ра; 1,5- експозиція 2 годин, 2, 6- експозиція 8 годин, 3, 7- експозиція 24 години, 4,8- експозиція 72 години

Таблиця 1. Експресивність неспецифічної пероксидази досліджуваних сортів у контролі та їх зміни у досліді

АКТИВНІСТЬ у контролі (од/мг)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракція

Загальна актив-ність

Фракція

Загаль-на ак-тив-ність

І

ІІ

ІІІ

І

ІІ

ІІІ

2

182,81

40,05

546,47

769,34

94,41

6,00

63,44

163,85

8

257,08

58,59

461,28

776,95

110,78

18,03

116,00

244,81

24

323,38

45,80

636,32

1005,49

175,68

40,16

248,04

463,88

72

556,20

36,45

205,30

797,95

215,96

68,77

170,58

455,30

Р

0,02

=

0,03

0,01

РОЗПОДІЛ ОКРЕМИХ ФРАКЦІЙ ПО СПЕКТРУ В КОНТРОЛІ

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракція

Фракція

І

ІІ

ІІІ

І

ІІ

ІІІ

2

23,76

5,21

71,03

57,62

3,66

38,72

8

33,09

7,54

59,37

45,25

7,37

47,39

24

32,16

4,56

63,28

37,87

8,66

53,47

72

69,70

4,57

25,73

47,43

15,10

37,47

Р

=

=

=

СТУПІНЬ ЗМІНИ АКТИВНОСТІ В ДОСЛІДІ У ПОРІВНЯННІ З КОНТРОЛЕМ (%)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракція

Загальна актив-ність

Фракція

Загаль-на ак-тив-ність

І

ІІ

ІІІ

І

ІІ

ІІІ

2

33,62

68,65

33,84

35,60

-61,81

-726,04

41,20

-46,25

8

38,88

63,80

20,47

29,83

-25,42

-109,12

82,93

19,75

24

65,81

81,60

51,30

57,35

44,86

29,46

86,70

65,90

72

75,07

62,40

0,94

55,42

61,12

74,22

95,16

75,85

Р

0,05

=

0,02

=

СТУПІНЬ ЗМІНИ РОЗПОДІЛУ ОКРЕМИХ ФРАКЦІЙ В ДОСЛІДІ У ПОРІВНЯННІ

З КОНТРОЛЕМ (%)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракція

Фракція

І

ІІ

ІІІ

І

ІІ

ІІІ

2

-3,07

51,32

-2,74

-10,64

-464,83

59,80

8

12,90

48,41

-13,34

-56,30

-160,60

78,72

24

19,84

56,87

-14,18

-61,69

-106,85

60,99

72

44,08

15,65

-122,20

-61,00

-6,74

79,95

Р

0,03

0,05

0,02

Примітка: тут і в наступних таблицях: Р - значення ^критерію; = достовірної різниці між сортами не встановлено.

Як видно з табл. 2, активність у контролі зв'язаної форми ензиму, як і загальна пероксидазна активність, в рослин сорту Миронівська 808 значно вище, ніж у сорту Тіра. Крім того, сорти суттєво різняться за часткою зв'язаної форм від загальної активності та її динамікою. Спочатку у Миронівської 808 в зв'язаній формі містилось більше половини ензиму (61,89 %) і, відповідно, висока активність, особливо у середньо- і швидкорухливої фракціях. В сорті Тіра спостерігалась протилежна картина. В паростках Миронівської 808 зміни активності зв'язаної пероксидази та їх частки, що спостерігалися на кожному строку культивування в контролі, в основному мали характер вираженого хвилеподібного коливання. У сорту Тіра зміни були більш монотонні.

Таким чином, досліджувані сорти суттєво різнилися між собою початковим станом пероксидаз, що не могло не вплинути на реакцію рослин у відповідь на дію стресового чинника.

Для аналізу особливостей реакції рослин досліджуваних сортів на гіпотермію оцінювали ступінь змін в експресії ензимів. Порівнювали показники контрольних і дослідних варіантів відповідних строків культивування. Видно, що за змінами у дослідному варіанті різниця між сортами стає ще помітнішою (табл. 1, 2). Негативні значення ступеня змін означає збільшення значення відповідного показника, позитивні - зменшення. Загальна активність неспецифічної пероксидази в паростках обох сортів в цілому зменшувалась. Але у сорту Миронівська 808 це відбувалось односпрямоване і поступово, тоді як у сорту Тіра в різні строки дії гіпотермії спостерігалися різноспрямовані зміни. В перші години культивування паростків Тіри при гіпотермії суттєво збільшувалась активність мало- і середньорухливих форм ензиму, після чого активність всіх фракцій зменшувалась. Образно кажучи, рослини сорту Тіра здійснювали «пошук» оптимального режиму функціонування в стресових умовах, що не могло не позначитись на енергоємності адаптації.

Протилежні зміни відбувалися також й у розподілі фракцій пероксидази. В сорту Миронівська 808 питома вага мало- і середньорухливих форм поступово зменшувалась, а у сорту Тіра навпаки збільшувалась. Особливим для сорту Миронівська 808 було постійне зростання під час дії гіпотермії частки швид- корухливих форм ензиму (більше, ніж у два рази), які є мажорними у спектрі. У Тіри, навпаки, питома вага цих форм пероксидази неухильно знижувалась (табл. 1).

Неоднаковим чином змінювався в досліді також розподіл неспецифічної пероксидази між розчинною і зв'язаною фракціями (табл. 2). В Миронівській 808 мало- і швидкорухливі форми ензиму у всі строки культивування при гіпотермії поступово переходили в розчинний стан. Активність зв'язаної фракції зі середньою рухливістю суттєво змінювалась в різні періоди. У Тіри ж в залежності від тривалості культивування зміни мало- і швидкорухливі форми ензиму мали різноспрямований характер. Після двадцяти чотирьох годин витримування за низької температури активність мало- та середньорухливої зв'язаної форми пероксидази постійно збільшувалась.

Таблиця 2. Активність та питома вага зв'язаних форм пероксидази у досліджуваних сортів пшениці під час спостережень у контролі та їх зміни у досліді

АКТИВНІСТЬ У КОНТРОЛІ (од/мг)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракції

Фракції

І

ІІ

ІІІ

Всього

І

ІІ

ІІІ

Всього

2

45,00

32,54

398,63

476,16

0,66

0,00

9,78

10,44

8

25,51

14,98

285,13

325,62

4,13

4,25

22,78

31,15

24

87,31

19,78

400,50

507,59

26,99

4,95

114,88

146,81

72

65,33

1,17

85,08

151,57

40,08

30,83

84,46

155,38

Р

0,03

=

0,04

0,04

ЧАСТКА АКТИВНОСТІ ЗВ'ЯЗАНИХ ФОРМ ВІД ЗАГАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ У КОНТРОЛІ (%)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракції

Фракції

І

ІІ

ІІІ

Всього

І

ІІ

ІІІ

Всього

2

24,62

81,23

72,95

61,89

21,20

0,00

15,41

6,37

8

9,93

25,56

61,81

41,91

19,63

23,57

19,64

12,73

24

27,00

43,18

62,94

50,48

5,18

12,33

46,31

31,65

72

11,745

3,20

41,44

18,99

4,59

44,84

49,52

34,13

Р

=

=

0,05

0,04

СТУПІНЬ ЗМІНИ АКТИВНОСТІ В ДОСЛІДІ У ПОРІВНЯННІ З КОНТРОЛЕМ (%)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракція

Загальна активність

Фракція

Загальна активність

І

ІІ

ІІІ

І

ІІ

ІІІ

2

83,57

4,43

45,59

49,42

38,20

-100,00

-137,07

-319,81

8

69,97

-102,19

34,79

28,44

20,27

-194,94

-95,44

-122,26

24

82,61

2,76

27,43

30,59

-81,35

-527,18

10,83

10,87

72

-7,62

-2305,58

87,73

-68,58

-157,22

-78,67

28,18

27,90

Р

0,05

=

0,02

=

СТУПІНЬ ЗМІНИ РОЗПОДІЛУ ОКРЕМИХ ФРАКЦІЙ В ДОСЛІДІ У ПОРІВНЯННІ З КОНТРОЛЕМ (%)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракція

Фракція

І

ІІ

ІІІ

І

ІІ

ІІІ

2

-3,07

51,32

-2,74

-10,64

-464,83

59,80

8

12,90

48,41

-13,34

-56,30

-160,60

78,72

24

19,84

56,87

-14,18

-61,69

-106,85

60,99

72

44,08

15,65

-122,20

-61,00

-6,74

79,95

Р

0,03

0,05

0,02

Сорт Миронівську 808 можна вважати стандартом стійкості до низьких температур. Зіставляючи активності пероксидази в тканинах досліджуваних сортів наприкінці витримування в умовах гіпотермії і напрямком змін у дослідних варіантах, можна припустити, що рослини сорту Тіра «намагаються» досягнути необхідного для оптимальної адаптації стандартного рівня.

Таким чином, досліджувані сорти різняться не тільки початковим станом ген-ензимної системи неспецифічної пероксидази, але й особливостями її функціонування в стресових умовах.

Іншим ензимом, що руйнує пероксид водню, є каталаза. Каталазна активність досліджуваних сортів, як і неспецифічна пероксидазна, знайдена в обох типах екстрактів: розчинному і зв'язаному (рис. 2 в, г). В розчинній фракції виявлено дві множинні форми, у зв'язаній - одна. Відносна електрофоретична рухливість множинних форм каталази складала 0,01 і 0,02. На відміну від пероксидази, більша частина каталази виявлялась у розчинній формі. За розподілом у спектрі і часткою зв'язаної форм ензиму досліджувані сорти у контролі достовірно не відрізнялись. Проте паростки сорту Тіра мали більш високу загальну каталазну активність. Можливо, це компенсувало відносно низьку у порівнянні з Миронівській 808 активність неспецифічної пероксидази (табл. 3).

По змінах у експресії каталазної активності при гіпотермії досліджувані сорти реагували неоднаковим чином (табл. 3). Так, у паростках Миронівської 808 активність і питома частка малорухливої каталази наприкінці дії гіпотермії знижувались, а в швидкорухливій зоні спостерігався протилежний процес змін. При цьому загальна активність ензиму практично не змінювалась. У сорту Тіра на тлі підвищення загальної активності каталази за 72-годинного впливу низької температури зміни активності і питомої ваги окремих фракцій ензиму мали протилежний характер у порівнянні з Миронівській 808.

Слід мати на увазі, що пероксид водню є не тільки одною з активних форм кисню. Це важлива сигнальна молекула, що впливає на ініціацію та розвиток процесів, необхідних при адаптації [14; 37]. Відповідно до цього, ген-ензимні системи, що відповідальні за руйнацію пероксиду, повинні функціонувати таким чином, щоб підтримувати певну його концентрацію для виконання сигнальної функції. В зв'язку з цим, стають очевидними різні наслідки дії пероксидаз і каталаз. Вони пов'язані з різним механізмом нейтралізації пероксиду водню зазначеними ензимами [33; 42]. Каталаза з високою швидкістю самостійно відновлює обидва атоми водню, тобто повністю знищує пероксид. Пероксидаза ж один атом водню відновлює сама, а другий - за допомогою іншого донору протона шляхом окислювання якогось субстрату. Завдяки цьому пероксидаза може впливати на редокс-стан клітин та баланс різноманітних фізіологічно активних сполук [33; 42]. В зв'язку з вище сказаним, крім неспецифічної вивчали стан специфічних пероксидаз: пероксидази ферулової та аскорбінової кислот (рис. 2, д, е, ж).

Таблиця 3. Експресивність каталази в контролі та її зміни у досліді

ЗАГАЛЬНА АКТИВНІСТЬ В КОНТРОЛІ (ОД/МГ)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракція

Всього

Фракція

Всього

І

ІІ

І

ІІ

2

48,68

27,78

76,46

46,84

16,50

63,34

8

42,20

13,44

55,64

65,90

34,02

99,92

24

67,46

28,02

95,48

76,88

49,98

126,86

72

66,86

40,74

107,60

69,74

56,52

126,26

Р

=

=

0,05

РОЗПОДІЛ ОКРЕМИХ ФРАКЦІЙ В КОНТРОЛІ (%)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракція

Фракція

І

ІІ

І

ІІ

2

63,67

36,33

73,95

26,05

8

75,84

24,16

65,95

34,05

24

70,65

29,35

60,60

39,40

72

62,14

37,86

55,24

44,76

Р

=

=

ЧАСТКА ЗВ'ЯЗАНИХ ФОРМ ВІД ЗАГАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ КАТАЛАЗИ В КОНТРОЛІ (%)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

2

7,64

12,00

8

33,14

8,25

24

14,54

11,89

72

11,12

8,05

Р

=

СТУПІНЬ ЗМІН АКТИВНОСТІ КАТАЛАЗИ В ДОСЛІДІ У ПОРІВНЯНІ С КОНТРОЛЕМ (%)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракція

Загальна

Фракція

Загальна

І

ІІ

активність

І

ІІ

активність

2

-35,37

4,10

-21,03

-69,51

-29,45

-59,08

8

-14,27

-17,86

-39,29

-19,33

15,70

-7,41

24

54,79

18,20

44,05

1,38

36,37

15,17

72

37,96

-51,69

4,01

-8,35

69,53

26,52

Р

0,05

=

=

СТУПІНЬ ЗМІН РОЗПОДІЛУ ФРАКЦІЙ КАТАЛАЗИ В ДОСЛІДІ У ПОРІВНЯНІ С КОНТРОЛЕМ (%)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракція

Фракція

І

ІІ

І

ІІ

2

-11,85

20,77

-6,56

18,62

8

17,96

56,41

-11,10

21,51

24

19,19

-46,20

-16,25

25,00

72

35,36

-58,04

-47,44

58,54

Р

0,04

0,03

ЗМІНА ЧАСТКИ ЗВ'ЯЗАНИХ ФОРМ ВІД ЗАГАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ В ДОСЛІДІ (%)КАТАЛАЗИ

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

2

-328,34

13,98

8

31,42

-36,04

24

-148,09

-52,27

72

-107,35

-336,65

Р

=

Ферулова кислота виконує у рослині багато функцій та сприяє розвитку толерантності до стресових впливів [21]. Вона, зокрема, легко вступає у вільно радикальні реакції, забезпечує їх зупинку через формування стабільного феноксильного радикалу [21; 26].

Як видно з табл. 4, пероксидази мають дуже велику спорідненість до ферулової кислоти. Незважаючи на те, що в цілому рівень спорідненості однаковий в обох досліджуваних сортах, розподіл у спектрі специфічних до ферулової кислоти ензимів неоднаковий. Особливо суттєва різниця спостерігалась серед швидкорухливих форм ензиму: у сорту Миронівська 808 їх частка значно нижча.

Різним чином також змінювалась спорідненість пероксидаз у відповідь на гіпотермію (табл. 4). Так, у Миронівський 808 частка специфічних до ферулової кислоти форм пероксидаз у зоні середньої рухливості зменшувалась, а в швидкорухливій - збільшувалась майже у два рази. В паростках сорту Тіри спорідненість середньорухливих форм навпаки зростала (особливо у перші години дії гіпотермії), специфічність швидкорухливих форм ензиму практично не змінювалась. Вказані відмінності посилювались різною питомою активністю пероксидаз у досліджуваних сортів, яка в цілому була значно вище в сорту Миронівська 808 (табл. 5).

Неоднаковим у різних сортів був розподіл специфічних до ферулової кислоти пероксидаз між розчинною та зв'язаною фракціями (табл. 6). Як видно з таблиці в Миронівській 808 за контрольних умов в цілому у зв'язаній формі була більша кількість пероксидази, ніж у Тіри. Лише наприкінці спостережень частка зв'язаного ензиму у Тіри досягала значень для Миронівської. Розрізнявся також і розподіл зв'язаних і розчинних форм по окремих фракціях.

Ще контрастніше розрізнялися сорти за зміною розподілу у відповідь на гіпотермію. У рослин Миронівської 808 за дії низької температури швидко- і малорухливі форми ензиму переходили у розчинний стан. Лише у мінорній (із середньою рухливістю) зоні домінував зворотний процес. У сорту Тіра зміни мали інший характер. В цілому частка зв'язаних пероксидаз, специфічних до ферулової кислоти, суттєво збільшувалась. Це відбувалося за рахунок форм з малою та середньою рухливістю. У швидкорухливій зоні зміни мали коливальний характер: у перші 2 години їх частка збільшувалася вдвічі, після чого (як у Миронівській) почала зменшуватись.

Таблиця 4. Спорідненість до ферулової кислоти форм неспецифічної пероксидази

ЧАСТКА ВІД ЗАГАЛЬНОЇ ПЕРОКСИДАЗНОЇ АКТИВНОСТІ (%) АКТИВНОСТІ, СПЕЦИФІЧНОЇ ДО ФЕРУЛОВОЇ КИСЛОТИ, У КОНТРОЛІ

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракції

Фракції

І

ІІ

ІІІ

В цілому

І

ІІ

ІІІ

В цілому

2

100,00

97,39

5,23

96,15

84,72

0,00

92,91

88,45

8

100,00

74,05

13,60

89,97

100,00

0,00

93,25

96,80

24

100,00

90,50

5,56

96,05

100,00

98,42

94,92

97,15

72

100,00

80,20

4,23

98,01

100,00

94,57

95,95

97,66

Р

=

=

0,00

=

ЗМІНА СПОРІДНЕНОСТІ (%) ДО ФЕРУЛОВОЇ КИСЛОТИ В ДОСЛІДІ У ПОРІВНЯННІ

З КОНТРОЛЕМ

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракції

Фракції

І

ІІ

ІІІ

В цілому

І

ІІ

ІІІ

В цілому

2

0,00

100,0

-53,12

2,07

35,05

-100,00

-6,07

19,61

8

0,00

-26,93

30,53

-3,82

15,53

-100,00

-7,23

8,05

24

66,35

100,00

-59,51

20,36

19,55

-1,60

-5,35

9,38

72

61,95

100,00

-102,41

27,60

11,16

-5,74

-4,22

6,33

Р

=

0,02

=

=

Таблиця 5. Питома активність (од/мг) пероксидаз, специфічних до ферулової кислоти

КОНТРОЛЬ

Час спостережень,

Миронівська 808

Тіра

Фракції

Фракції

І

ІІ

ІІІ

В цілому

І

ІІ

ІІІ

В цілому

2

182,81

39,01

517,88

739,70

79,99

6,00

58,94

144,92

8

257,08

43,38

398,53

698,99

110,78

18,03

108,18

236,98

24

323,38

41,45

600,95

965,78

175,68

39,53

235,44

450,64

72

556,20

29,23

196,62

782,05

215,96

65,03

163,68

444,67

Р

0,04

=

0,05

0,03

ДОСЛІД

Час спостережень,

Миронівська 808

Тіра

Фракції

Фракції

І

ІІ

ІІІ

В цілому

І

ІІ

ІІІ

В цілому

2

121,35

12,56

332,59

466,50

84,06

49,56

36,76

170,38

8

157,12

19,93

332,21

509,26

117,36

37,71

19,80

174,87

24

37,21

8,43

282,42

328,06

77,94

28,33

32,99

139,26

72

52,75

13,71

185,96

252,41

74,59

17,73

8,26

100,58

Р

=

0,05

0,00

0,01

Неоднаковим чином змінювався в досліді також розподіл неспецифічної пероксидази між розчинним і зв'язаним фракціями (табл. 4, 6). В Миронівській 808 мало- і швидкорухливі форми ензиму у всі строки культивування при гіпотермії поступово переходили в розчинний стан. Активність зв'язаної фракції зі середньою рухливістю суттєво змінювалась в різні періоди. У Тіри ж в залежності від тривалості культивування зміни мало- і швидкорухливі форми ензиму мали різноспрямований характер. Після двадцяти чотирьох годин витримування за низької температури активність мало- та середньорухливої зв'язаної форми пероксидази постійно збільшувалась.

Таблиця 6. Частка від всього специфічного ензиму і розподіл зв'язаної пероксидази, специфічної до ферулової кислоти, (%)

КОНТРОЛЬ

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракції

Фракції

І

ІІ

ІІІ

В цілому

І

ІІ

ІІІ

В цілому

2

5,33

5,53

65,84

76,70

0,40

0,00

3,64

4,04

8

0,59

3,37

57,11

61,07

3,08

3,26

13,33

19,67

24

4,42

2,94

55,59

62,95

3,59

1,74

36,60

41,92

72

13,86

0,44

29,95

44,25

0,00

13,48

35,12

48,60

Р

0,05

=

=

0,04

ЗМІНА РОЗПОДІЛУ ЗВ'ЯЗАНОЇ ПЕРОКСИДАЗИ, СПЕЦИФІЧНОЇ ДО ФЕРУЛОВОЇ КИСЛОТИ, У ДОСЛІДІ ЗА ПОРІВНЯННЯ З КОНТРОЛЕМ (%)

Час спостережень, години

Миронівська 808

Тіра

Фракції

Фракції

І

ІІ

ІІІ

В цілому

І

ІІ

ІІІ

В цілому

2

84,64

56,38

32,67

38,00

-2815,29

0,00

-110,97

-821,88

8

-57,56

-4,22

34,31

31,29

-304,40

-359,27

67,39

-61,57

24

89,06

77,15

59,01

61,96

-82,04

-806,08

73,27

23,56

72

90,46

-331,67

100,00

92,68

0,00

-4,72

91,68

44,65

Р

=

=

0,05

0,05

Специфічною пероксидазой, яка виконує важливі функції, є аскорбінатпероксидаза [38]. Аскорбінатпероксидазна активність спостерігалась лише у розчинній формі (рис. 2, ж). Всього виявлено 15 множинних форм цього ензиму. Для кількісного аналізу різні електрофоретичні форми об'єднали у п'ять фракцій. У малорухливу фракцію І включили чотири форми з електрофоретичною рухливістю від 0,04 до 0,10, до малорухливій фракції ІІ - п'ять форм з Rf від 0,11 до 0,20. Середньорухливі форми об'єднали в дві фракції: ІІІ - з двома формами (Rf 0,24 і 0,27), ІУ - з двома формами (Rf 0,30 і 0,37). У швидкорухливій фракції У була одна форма з відносною електрофоретичною рухливістю 0,74.

В обох сортах за вирощування в контрольних умовах зі збільшенням строку експозиції спостерігалося постійне зниження питомої активності аскорбіна- тпероксидази (табл. 7). Але досліджувані сорти розрізнялися початковим станом ензиму, як за активністю, так і за розподілом окремих фракцій у спектрі. Рослини сорту Миронівська 808 мали більш високу активність цієї специфічної пероксидази, як за сумарним показником, так і по окремих фракціях, крім швидкорухливої. Зазначена різниця зберігалась до кінця спостережень. Відносно розподілу фракції у спектрі можна відмітити таке: найбільш малорухлива (фракція І) і швидкорухлива фракція у Тіри мали вищі значення порівняно з Миронівською, частка решти фракцій форм ензиму - менші.

Таблиця 7. Показники ген-ензимної системи аскорбінатпероксидази у контрольних рослин

ПИТОМА АКТИВНІСТЬ (ОД/МГ)

Миронівська 808

Час спостережень, години

Фракції

Всього

І

ІІ

ІІІ

ТУ

V

2

42,82

32,82

10,62

9,41

1,50

98,07

8

27,16

23,29

7,34

6,65

1,10

66,54

24

9,11

14,51

4,32

3,84

0,21

33,29

72

2,88

8,87

2,03

1,58

0,09

16,32

Тіра

2

21,91

6,90

0,70

0,39

2,23

32,12

8

17,87

6,75

0,48

0,64

2,32

28,06

24

9,37

6,84

0,97

0,62

0,58

18,37

72

5,39

2,55

0,53

0,39

0,86

9,71

Р

=

0,05

0,05

0,05

0,01

0,05

РОЗПОДІЛ ОКРЕМИХ ФРАКЦІЙ ПО СПЕКТРУ (%)

Миронівська 808

Час спостережень, години

Фракції

І

ІІ

ІІІ

ТУ

V

2

43,66

33,47

10,83

9,60

1,54

8

40,81

35,00

11,03

10,00

1,68

24

27,38

43,60

12,98

11,54

0,66

72

17,66

54,34

12,44

9,68

0,58

Тіра

2

68,20

21,47

2,18

1,21

6,93

8

63,70

24,05

1,72

2,27

8,26

24

50,99

37,21

5,29

3,35

3,16

72

55,52

26,22

5,44

4,02

8,80

Р

0,01

0,05

0,01

0,01

0,01

За дії гіпотермії стан ген-ензимної системи аскорбінатпероксидази в досліджуваних сортів суттєво розрізнявся (табл. 8). В Миронівської 808 з самого початку впливу низької температури активність ензиму знижувалась і лише на пізніх строках експозиції збільшувалась у порівнянні з контролем активність малорухливої фракції І. У рослин сорту Тіра навпаки активність аскорбінатпе- роксидази одразу різко підвищувалася і досягала такої у Миронівської. Різним чином у досліджуваних сортів змінювався при гіпотермії розподіл окремих множинних форм ензиму. У Миронівської за рахунок усіх інших форм збільшувалася частка у спектрі малорухливої фракції І. У Тіри навпаки частка цієї фракції зменшувалась, а питома вага у спектрі форм з середньою рухливістю і швидкорухливих - збільшувалась.

Таблиця 8. Зміни в експресії аскорбінатпероксидази за дії гіпотермії

СТУПІНЬ ЗМІН АКТИВНОСТІ У ДОСЛІДІ ЗА ПОРІВНЯННЯ З КОНТРОЛЕМ (%)

Миронівська 808

Час спостережень години

Фракції

Всього

І

ІІ

ІІІ

ТУ

V

2

58,15

78,70

75,85

64,54

72,00

67,86

8

30,37

86,94

93,38

89,48

72,73

64,24

24

-137,04

62,28

82,92

86,37

23,81

10,94


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.