Новые подходы к исследованиям на сальмонеллез

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Сальмонеллёзы рассматриваются как одно из наиболее важных инфекционных заболеваний коммерческого птицеводства. Этот возбудитель вызывает гибель птицы и является причиной возникновения токсикоинфекций у человека. Причиной усиления опасности заболевания и возможности заражения человека может быть бессимптомное переболевание сальмонеллёзом и хроническое носительство возбудителей. Длительное проживание сальмонелл в организме больного может иметь врожденный характер.

Важным обстоятельством, усложняющим меры борьбы с сальмонеллёзом, является многообразие сероваров сальмонелл у птиц в различных странах и в различное время. Помимо основных возбудителей сальмонеллёза S. enteritidis, S. pullorum, S. gallinarum, а в настоящее время всё чаще ещё и S. typhimurium, от птиц выделяют около десяти различных сероваров этого микроорганизма.

Всё вышесказанное подчеркивает важность и сложность организации мер профилактики сальмонеллёза птиц, базирующихся, прежде всего, на создании высокочувствительных и специфических методов диагностики, создании активных иммунизирующих препаратов, изучении особенностей иммунной реакции при этом заболевании. Методологической базой таких работ всё больше становится использование иммуноферментных методов в микробиологических, иммунологических и иммуногистохимических исследованиях с применением поликлональных и моноклональных антител.

В настоящее время иммуноферментный сорбционный метод (ИФА) получил признание и применение при диагностике сальмонеллёза. Этот тест с использованием антилипополисахаридных и антифлагеллиновых антител оказался по сравнению с серологическим тестом более чувствительным и специфичным. Чувствительность этого теста при диагностике сальмонеллёза в ИФА составила 93,6%, а специфичность - 94,9%. Испытание теста ИФА с использованием липополисахаридов сальмонелл показало, что с его помощью можно выявлять 100% инфицированных поросят. Специфичность метода составила 94%, а чувствительность - 97% (Proux К. и др., 2000). Высокую активность показали при испытании в ИФА липополисахариды, О-полисахариды или мембранные седиментированные антигены, которые позволили идентифицировать антитела, связанные с естественной инфекцией птиц и антительным ответом на вакцину (Solano С. и др., 2000). Преимуществом метода ИФА является то, что он позволяет выявлять антитела при послеинфекционных осложнениях, когда невозможно выявить микроорганизмы (Isoniaki О. и др., 1989). Диагностику сальмонеллёза можно проводить путём применения в ИФА IgG антител к S. enteritidis, используя липополисахаридный и экстрагированный теплом антигены (Nicholas R. A. и др., 1991). ИФА тест позволил осуществлять скрининговые исследования при выполнении программ контроля и ирадикации сальмонеллёза в Голландии (van Zijederveld F. G. и др., 1992) и Дании (Feld N.C. и др., 2000).

Достаточно широкое применение получил метод ИФА при исследовании на обсеменённость мяса, молока и кормов (Sachsenweger О. и др., 1994; Brigmon R. L. и др., 1995). Заслуживает внимания программа контроля сальмонеллёза в свиноводстве (Германия, Дания), которая основывается на исследовании с помощью ИФА мясного сока (Steinbach G. и др., 2000). сальмонеллез инфекционный иммуноферментный

Общепризнано, что энзим-связанный иммуносорбентный тест (ИФА) с использованием липополисахаридного (ЛПС) антигена сальмонелл более чувствительный, чем капельный (пластинчатый) или агглютинационный тесты. Он позволяет выявлять большее количество птицы, которая давала отрицательные результаты в реакции на стекле или при постановке реакции агглютинации в пробирке, и обнаруживает высокие титры у части птицы, от которой после смерти не изолировали сальмонелл.

Почти одновременно с разработкой техники ИФА для детекции антигенов, сорбированных на полимерную твердофазную основу (плашки), начали проводиться исследования по разработке методов иммуноферментного анализа для выявления антигенов в клетках (и на их поверхности), а также в тканевых срезах и мазках больных животных. Здесь также нашли применение одноступенчатый, двухступенчатый и трехступенчатый методы иммунного окрашивания. Наиболее чувствительным и широко применяемым является метод, основанный на комплексе авидин-биотина, связанного с пероксидазой.

При изучении гистопрепаратов, обработанных иммунопероксидазой, следует учитывать, что эритроциты и гранулоциты обладают собственной эндогенной пероксидазой и это может приводить к появлению неспецифической окраски и затруднению их оценки. В этом случае применение вместо пероксидазы хрена щелочной фосфатазы может явиться хорошей альтернативой с применением в этом случае в качестве хромогена неофуксина и красного прочного.

Для энзимного маркирования антигенов в срезах были разработаны различные иммуногистохимические методы (Vandesande F., 1983). Простейшим методом является прямое соединение (конъюгирование) энзима с первичным антителом (одноэтапный метод). Энзим может также присоединяться в дальнейшем к вторичному антителу, который вступает в реакцию с первичным антителом (двухэтапный метод) и который в данном случае выполняет роль антигена.

В иммуногистохимических исследованиях успешно используется и иммунофлюоресцентная техника, которая позволяет обнаруживать небольшое количество антител в пробах материала.

Однако наиболее оправдал себя и получил широкое применение во многих лабораториях мира авидин-биотиновый метод (Avidin-biotin complex - ABC). С помощью него можно быстро обнаруживать антигены. Он обладает высокой специфичностью и чувствительностью.

Последним достижением иммуногистохимии является метод гибридизации in situ (ISH), используемый, в частности, для детекции хламидиозных антигенов (A. Berndt, 2001). "In situ" гибридизация принадлежит к молекулярно-биологическому методу детекции хламидий в срезах ткани или в клеточных препаратах. Обнаружение окрашенных хламидий проводится с помощью светового микроскопа. ISH требует больших затрат времени и предполагает участие лабораторного персонала, владеющего молекулярно-биологическим опытом. Оценка препаратов при плохом морфологическом сохранении ткани, в том числе и клеточной культуры - затруднена.

Метод обнаружения спаренных видоспецифических ДНК- или РНК-зондов с комплементарными ДНК или РНК отрезками в гистологических препаратах. Для детекции зонды должны быть конъюгированы с маркирующими молекулами (например, дигиксигенином, биотином или флюоросцеином). В случае применения дигиксигенина (DJG) последний комплементарно спаривается с зондом целевой ДНК или РНК, и при добавление связанных с энзимом анти-DJG-антител энзим-субстрата -становится возможной реакция с соответствующим хромогеном. Кит-системы для этой реакции производятся фирмами Luxo в Доссенгейме и Kreatech в Гамбурге.

Тип использованного иммунногистохимического метода в исследованиях может быть различным и зависит как от возможностей, так и от характера поставленных задач.

Однако всё же нельзя не отметить, что наиболее рутинным становится авидин-биотиновый тест, которому отдают предпочтение большинство учёных, особенно в тех случаях, когда возникает необходимость выявить небольшое количество антигена. Этот тест стал также применяться для обнаружения антигенов возбудителей болезней в тканях при диагностике таких заболеваний как инфекционный ринотрахеит (G.H. Smith, J. K. Collirigirs, J. Carman, 1989), губчатая энцефалопатия скота, хламидиоза (A. Berndt, 2001).

Данных по применению иммуногистохимических методов для обнаружения в тканях антигенов сальмонелл в доступной литературе мы не обнаружили.

Однако имеются публикации о применении иммуногистохимических методов при изучении особенностей формирования иммунитета после вакцинации или заражении цыплят сальмонеллёзом. И среди них особый интерес представляют пока ещё немногочисленные работы по использованию методов иммуногистохимического анализа для определения изменений субпопуляций лимфоцитов при этом заболевании с применением моноклональных антител, позволяющих проводить их кластер-дифференциацию по поверхностным антигенам (Sasai К. и др., 1997).

Материалы и методы. Были проведены исследования в птицеводческом хозяйстве ЗАО «Краснояружский бройлер» Белгородской области на разновозростном поголовье птицы. Для проведения исследований брали по 100 голов птицы из двух площадок, куда входили иммунизированные и не иммунизированные против сальмонеллеза особи. Изучали изменения субпопуляций лимфоцитов при развитии постинфекционного и поствакцинального иммунитета с помощью общепринятых методов иммуногистохимии при развитии сальмонеллезной инфекции и специфического противосальмонеллезного иммунитета (A. Berndt U. Methner, 2001, Babu U. 2003). Также проводили иммунизацию лабораторных белых мышей и изучали соотношение CD4/CD8 субпопуляций лимфоцитов крови.

Результаты исследований. Наши исследования клеточных композиций субпопуляций лимфоцитов крови (CD4+CD8+; CD4-CD8+; CD8+TcRl+; CD8TcRl+; CD8+TcRl-) после орального применения неаттенуированного штамма Salmonella typhimurium и аттенуированного вакцинного штамма Salmonella vac® однодневным цыплятам по сравнению с необработанными цыплятами с помощью метода проточной цитофлюорометрии согласовались с данными A. Berndt U. Methner (2001). Одновременно изучали Т-клеточные субпопуляции (CD4+, CD8+, TcRl+ (гд), TcR2+ (бв)) в слепой кишке, селезёнке и Фабрициевой бурсе) с применением методов иммуногистохимии. У цыплят, зараженных Salmonella typhimurium 421 или вакциной против сальмонеллёза, установлено увеличение процента CD8+TcRl+ в крови на 7-9 или на 10 день по сравнению с контрольными животными. Соотношение CD4 к CD8 состовляло около 3:1 у инфицированных животных 5-дневного возраста. В органах обработанных животных количество CD8+ и TcRl+ клеток заметно увеличивалось на 4 и 5 день в слепой кишке на 8 и 9 - в бурсе, на 9 и 12 - в селезёнке.

Следует сделать вывод, что иммунизация однодневных цыплят вакциной приводит к таким же изменениям в клеточном составе, как и после инфицирования неаттенуированным эпизоотическим штаммом сальмонелл. Заметное увеличение процента CD8+TcRl+ клеток с двойной позитивностью у обработанной птицы указывает на важную роль этой субпопуляции клеток в иммунологической защите против заражения сальмонеллёзом.

Увеличение соотношения CD4/CD8 наблюдали после иммунизации и инфицирования мышей Salmonella typhi, что согласуется с данными зарубежных исследователей. Эти данные коррелируют с исследованиями Babu U. с соавт. (2003) где было показано, что применение живой вакцины против сальмонеллёза сопровождается повышением содержания количества CD4 и TcR2 и соотношения CD4/CD8, уменьшением TcRl, в то время как введение убитой вакцины приводило к заметному увеличению CD8, TcRl и TcR2.

Выводы. Полученные данные по клеточному иммунитету при сальмонеллёзе и использовании живых и убитых противосальмонеллёзных вакцин, на основании определения изменений субпопуляций лимфоцитов в иммунитете этого заболевания, представляют большой научный интерес и в значительной мере определяют подходы к дальнейшему развитию этого перспективного направления исследований в ветеринарной и гуманной медицине.

Поверхностные маркеры лимфоцитов и макрофагов при сальмонеллёзе изучали и другие исследователи. Иммунохимическое изучение зоба при сальмонеллёзе птиц проводили К. Н. Seo с сотр. (2003), кластерные маркеры дендритных клеток селезёнки при этом заболевании исследовали U. Yrlid с соавт. (2002), индукция CD8+ лимфоцитов у иммунизированных мышей определялась Odilia L. C с соавт. (2002), динамику субпопуляций CD3+, CD8+ и CD4+, а также процентное содержание IgG+ и IgM+ в цекальной тонзиле после заражения цыплят S. enteritidis детально исследовали К. Sasai с соавт. (2000).

Литература

1. Babu U., Scott M. et al. Effects of live and killed Salmonella vaccine on lymphocyte mediated immunity in laying hens. // Veterinary immunology and immunopathology. - 2003, №91, - p.39 - 44.

2. Berndt A., Methner U. Gamma/delta T cell response of chickens after oral administration of attenuated and non-attenuated Salmonella typhimurium strains. // Veterinary immunology and immunopathology. - 2001, №78, - p. 143 - 161.

3. Berndt A. Microscopische Verfahren zum Nachweis von Chlamydien in Geweben und Zellkulturen. // Fachbeitrag Chlamydieninfectionen, W4, 2001, S.48 - 55.

4. Brigmon RL, Zam SG, Bitton G, Farrah SR. Detection of Salmonella enteritidis in environmental samples by monoclonal antibody-based ELISA. // J. Immunol. Methods. - 1992, №152(1), - p.135 - 142.

5. Brigmon RL, Zam SG, Wilson HR. Detection of Salmonella enteritidis in eggs and chicken with enzyme-linked immunosorbent assay. // Poult Sci. - 1995, №74 (7), - p.1232 - 1236.

6. Feld NC, Ekeroth L, Gradel КО, Kabell S, Madsen M. Evaluation of a serological Salmonella mix-ELISA for poultry used in a national surveillance programme. // Epidemiol. Infect. - 2000, №125(2), - p.263 - 268.

7. Isomaki O, Vuento R, Granfors K. Serological diagnosis of Salmonella infections by enzyme immunoassay. // Lancet. - 1989, №1, - p.1411 - 1414.

8. Jesudason MV, Sridharan G, Arulselvan R, Babu PG, John TJ. Diagnosis of typhoid fever by the detection of anti-LPS @ anti-flagellin antibodies by ELISA. // Indian. J. Med. Res. - 1998, №107, - p.204 - 207.

9. Nicholas RA, Cullen GA. Development and application of an ELISA for detecting antibodies to Salmonella enteritidis in chicken flocks. // Vet. Rec. - 1991, №128(4), - p.74 - 76.

10. Odilia L.C. Wijburg, Nico van Rooijen, Richard A. Strugnell. Induction of CD8+ T-lymphocites by Salmonella typhimurium is independent of Salmonella pathogenecity island 1-mediated host cell death. // The Journal of Immunology. - 2002, №169, - p.3275 - 3283.

11. Proux K, Houdayer C, Humbert F, Cariolet R, Rose V, Eveno E, Madec F. Development of a complete ELISA using Salmonella lipopolysaccharides of various serogroups allowing to detect all infected pigs. // Vet. Res. - 2000, №31(5), - p.481 - 490.

12. Sachsenweger O, Lohr JE, Kosters J. Evaluation of three commercial ELISA test kits for the detection of antibodies against Salmonella enteritidis. // Tierarztl. Prax. - 1994, №22(4), - p.350 - 357.

13. Sasai K., Yoshimura K., Liklehoy H.S., Withanage G.S., Fukata Т., Baba E., Arakawa A. Analysis of splenic and thymic lymphocite subpopulations in chicken infected with Salmonella enteritidis. // Vet. Immunol. Immunopathol. - 1997, №59, - p.359 - 367.

14. Sasai M., Vohra H., Kiniar L., Ganguli W. K. Inducrion of systemic and mucosal immune response in mice immunised with porins of Salmonella typhi. // J. Vet. Microbiol. - 1999, №48, - p.79 - 88.

15. Sasai K, Aita M, Lillehoj H. S., Miyamoto T, Fukata T, Baba E. Dinamics of lymphocite subpopulation changes in the cecal tonsils of chickens infected with Salmonella enteritidis. // Veterinary Microbiology. - 2000, №74, - p.345 - 351.

16. Seo K.-H, Holt P.S., Vaughn L. E., Gast R. K., Stone H. D. Detection of Salmonella enteritidis-specific immunoglobulin A antibodies in crop samples from chickens infected with Salmonella enteritidis. // Poultry Science. - 2003, №82, - p.67 - 70.

17. Smith GH,. Collirigirs JK,. Carman J. Use of an immunoperoxidase test for the detection of bovine herpesvirus - 1 in aborted fetal tissue.// J. Vet. Diagn. Invest. - 1989,№l, - p.39 - 44.

18. Solano C, Gallindo J, Sesma B, Alvarez M, Solsona MJ, Gamazo С Enzyme-linked immunosorbent assay with a Salmonella enteritidis antigen for differentiating infected from vaccinated poultry.// Vet. Res. - 2000, №31(5), - p.491 - 497.

19. Steinbach G, Staak C, Bahn P.Possibilities for standartization of ELISA for detection of Salmonella antibodies in sera and meat juices of pigs. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. - 2000, №113(9), - p.331 - 334.

20. Vandesande F. Peroxidase-antiperoxidase techniques. // Immunohistochemistry. - 1983, - p.101 - 109.

21. Van Zijderveld FG, Van Zijderveld - Van Bemmel AM, Anakotta J. Comparison of four different enzyme-linked immunosorbent assays for serological diagnosis of Salmonella enteritidis infections in experimentally infected chickens. // J. Clin. Microbiol. - 1992, №30(10), - p.2560 - 2566.

22. Yrlid U, Wick MJ. Antigen presentation capacity and cytokine production by murine splenic dendritic cell subsets upon Salmonella encounter. // The Journal of Immunology. - 2002, №169, - p.108 - 116.

23. Actual questions of application of immunoenzyme and immunohistochemical methods of research at agricultural animals diseases, especially at Salmonellosis, and data of carried out research on entrainment of T-lymphocites, B-lymphocites and macrophages subpopulations in immune response at this disease were considered.

Размещено на Allbest.ru