Изучение антигенности белков бруцелл в иммуноферментном анализе
Диагностика бруцеллеза животных. Изучение антигенности рекомбинантных белков бруцелл в непрямом иммуноферментном анализе на образцах сывороток крови крупного рогатого скота и овец, положительно реагирующих на бруцеллез в серологических реакциях.
| Рубрика | Сельское, лесное хозяйство и землепользование |
| Вид | статья |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 20.10.2020 |
| Размер файла | 1,4 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОСТИ БЕЛКОВ БРУЦЕЛЛ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ
1А.К. Булашев, доктор ветеринарных наук, профессор
1А.С. Сыздыкова, магистр технических наук
1Ж.А. Сураншиев, кандидат ветеринарных наук, доцент
1К.А. Турсунов, магистр ветеринарных наук, ассистент
2С.З. Ескендирова, кандидат ветеринарных наук, доцент
1Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина, Астана, Казахстан
2Национальный центр по биотехнологии, Астана, Казахстан
Реферат. Прижизненная диагностика бруцеллеза животных основана главным образом на использовании серологических реакций, таких как РА, РБП и/или РСК. В этих тестах антитела определяются с помощью антигена, изготавливаемого из S-клеток бруцелл, главным компонентом которых являются липополисахариды (ЛПС). Последние могут быть причиной перекрестных реакций с другими клинически значимыми грамотрицательными бактериями, что приводит к получению ложноположительных результатов. В этой связи белки внешней мембраны (БВМ) бруцелл находятся в центре внимания исследователей, занимающихся совершенствованием диагностики бруцеллеза. В работе приведены результаты изучения антигенности пяти рекомбинантных белков бруцелл (рБВМ19, рБВМ25, рБВМ31, рВР26 и рСОД) и экстрагируемого белкового антигена (ЭБА) B. abortus и/или В-melitensis в непрямом иммуноферментном анализе (н-ИФА) на сыворотках крови крупного рогатого скота и овец, реагирующих на бруцеллез в классических серологических реакциях. Среди использованных белковых препаратов наиболее антигенным оказался ЭБА, который обнаруживал антитела у 94,8 % крупного рогатого скота и 69 % овец. Антитела, специфичные крБВМ19, рБВМ25 ирБВМ31, детектировались лишь у 39; 50,6 и 76,6 % серопозитивных коров соответственно. Периплазматические белки -- рВР26 и рСОД оказались менее антигенными, чем внешнемембранные, выявляя наличие анти-Brucella антител только у 29,9 и 14,3 % крупного рогатого скота соответственно. Рекомбинантные белки не распознавались антителами серопозитивных овец. Антитела к рекомбинантным белкам в н-ИФА обнаруживались у незначительного количества крупного рогатого скота благополучной фермы (от 2,1 до 12,5 %). Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения экспериментального заражения животных с целью объективной оценки потенциала рекомбинантных белков в диагностике бруцеллеза.
ANTIGENICITY OF BRUCELLA PROTEINS BY THE ELISA TEST
JBulashev A.K., Doctor of Veterinary Sc., Professor
JSyzdykova A.S., MSc-student of Technical Sc.
^uranshiyev Zh.A., Candidate of Veterinary Sc., Associate Professor
JTursunov K.A., MSc-student of Veterinary Sc., Assistant
2Eskendirova S.Z., Candidate of Veterinary Sc., Associate Professor
1 S.Seifullin Kazakh Agrotechnical University, Astana, Kazakhstan
2National Centre for Biotechnology, Astana, Kazakhstan
Key words: brucellosis, cattle, sheep, diagnostics, serological tests, ELISA test, outer membrane proteins, antigenicity.
Abstract. Lifetime diagnostics of animal brucellosis is mainly based on serological reactions as SAT, RBPT and CFT. The tests determine antibodies by means of antigen producedfrom Brucella S-cells that mainly contain lipopolysaccharides (LPS). The LPS may cause cross-reactions with other clinically significant gram-negative bacteria; this leads to false-positive results. Due to this fact, the researchers involved in improving. The paper highlights the research results on antigenicity of 5 recombinant Brucella proteins (rOMP19, rOMP25, rOMP31, rBP26 and rSOD) and soluble protein preparations (CSP) of B. abortus and/or B. melitensis by indirect ELISA using cattle and sheep serum samples positive for brucellosis by classical serological tests. CSP appeared to be the most antigenic among the protein specimens; it determined antibodies in 94.8% of the cattle and 69% of sheep. Antibodies which were specific to rOMP19, rOMP25 and rOMP31 were detected in 39%; 50,6 and 76.6% of antibody-positive cows. Periplasmic proteins (rBP26 and rSOD) were observed as less antigenic than outer membrane proteins and revealed anti-Brucella antibodies in 29.9 and 14.3% of the cattle. Recombinant proteins were not detected by antibodies of sheep positive for brucellosis. Antibodies to recombinant proteins by i-ELISA were detected in the small number of the cattle kept at brucellosis free farm (from 2.1 to 12.5%). The results obtained outline the necessity to carry out experimental infection of animals in order to assess properly the capacities of recombinant proteins when diagnosing brucellosis.
Республика Казахстан (РК) входит в десятку стран, где ежегодная заболеваемость бруцеллезом на 100 тыс. населения составляет от 8 до 50 случаев. Проблема бруцеллеза людей стоит достаточно остро и в Российской Федерации (РФ), особенно в ее кавказских регионах [1]. Кроме того, сохраняется угроза возникновения новых эпизоотических очагов в других округах РФ за счет заноса возбудителя болезни из других стран [2].
Эффективность борьбы с бруцеллезом зависит в первую очередь от своевременной диагностики. Традиционные серологические реакций (РБП, РА, РСК и др.) характеризуются низкой специфичностью из-за использования в них единого бруцеллезного антигена, изготавливаемого из S-клеток бруцелл, главным компонентом которых являются липополисахариды (ЛПС). Последние служат причиной перекрестных реакций с другими клинически значимыми грамотрицательными бактериями [3]. Тем не менее, относительная легкость получения данного антигена и/ или ЛПС бруцелл является привлекательным фактором для производителей традиционных диагностикумов и тестов, основанных на иммуноферментном анализе (ИФА-наборов).
В РК за пятилетний период (2008-2012 гг.) использования метода борьбы с бруцеллезом «ИФА-тест и убой» количество животных, положительно реагирующих на бруцеллез, возросло в 5-9 раз в зависимости от региона республики [4], однако улучшения эпизоотической ситуации не наступало. В настоящее время ИФА, в соответствии с ветеринарными (ветеринарно-санитарными) правилами РК, рекомендован только для серологических исследований 4-6-месячного молодняка благополучных по бруцеллезу хозяйств. Основным препятствием для широкого внедрения в диагностическую практику ИФА-наборов остается отсутствие антигена, специфичного для бактерий рода Brucella.
Анализ мировой литературы показывает, что среди компонентов клеточной стенки бруцелл наиболее перспективными в разработке как диагностических тестов, так и вакцинных препаратов являются белковые компоненты [5]. На современном этапе развития генной инженерии одним из эффективных подходов в получении Brucella-специфичных белков является создание штаммов-продуцентов рекомбинантных белков внешней мембраны (рБВМ) патогена. Так, в настоящее время изучены антигенные и иммуногенные свойства рБВМ с молекулярной массой 16 кДа (рБВМ16) [6], 19 кДа (рБВМ19) [7], 25 кДа (рБВМ25) [8], 31 кДа (рБВМ31) [9], а также периплазматических белков с молекулярной массой 28 кДа (рВР26 или рБВМ28) [10] и супероксиддисмутазы (рСОД) бруцелл [11]. Однако потенциал этих белков в ИФА при серологической диагностике животных все еще остается малоизученным, и полученные результаты весьма неоднозначны, а порой и противоречивы.
Целью работы явилось изучение антигенности рекомбинантных белков бруцелл в непрямом ИФА (н-ИФА) на образцах сывороток крови крупного рогатого скота и овец, положительно реагирующих на бруцеллез в традиционных серологических реакциях.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
бруцеллез иммуноферментный рогатый скот серологический
Инактивированная бактериальная масса Brucella abortus 19 и/или Brucella melitensis Rev-1 была любезно предоставлена НПО «Антиген» (Казахстан, Алматы).
Экстрагируемый белковый антиген (ЭБА) из клеток B. abortus 19 и/или B. melitensis Rev-1 получали по методу L. Tabatabai и D. Deyoe [12], основанному на элюировании белков клеточной стенки бруцелл 0,1 М раствором цитрата натрия, содержащим 1 М хлорида натрия и 0,1 % тритона Х-100.
В работе были использованы рекомбинантные белки, полученные в наших предыдущих исследованиях: рБВМ19 B. abortus, рБВМ25 B. abortus и рБВМ31 B. melitensis [13].
Синтез нуклеотидных последовательностей первого белка был выполнен компанией BioBasic (Канада), двух последующих белков - компанией Invitrogen (США). Кроме того, использовались периплазматические белки Brucella spp.: рВР26 [10] и рСОД [14], синтез которых был осуществлен de novo с помощью олигонуклеотидных праймеров, полученных на автоматическом ДНК-синтезаторе.
Культивирование штаммов-продуцентов и очистка рекомбинантных белков. Культуры Еsherichia coli - штаммов-продуцентов рекомбинантных белков - выращивали в жидкой и твердой среде Лурия-Бертани, содержащей 1 % бакто-триптона, 0,5 % дрожжевого экстракта и 1 % NaCl (Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл (ОАО «Синтез», Россия). Рекомбинантный белок очищали с помощью металл-аффинной хроматографии с использованием коммерческих колонок HisTrap Columns (GE Healthcare Life Sciences, Англия) в соответствии с наставлениями производителя.
Сыворотки крови. В работе были использованы 144 образца сывороток крови крупного рогатого скота. Из них 77 образцов с положительными результатами на бруцеллез в РА и/или РБП были предоставлены ветеринарной лабораторией Житикаринского района Костанайской области. Эти сыворотки принадлежали невакцинированным коровам казахской белоголовой породы, содержавшимся в хозяйстве, где произошла вспышка бруцеллеза (свежий очаг инфекции). Сорок восемь образцов сывороток крови были взяты от коров этой же породы крестьянского хозяйства «Мерке» (Бухаржырауский район, Карагандинская область), оздоровленного от бруцеллеза в 2016 г. В данном хозяйстве крупный рогатый скот подвергается вакцинации штаммом B. abortus 19. В качестве негативного контроля при постановке н-ИФА были использованы 19 проб сывороток крови телок молочно-товарной фермы производственного кооператива «Родина» (Целиноградский район, Акмолинская область). Данный хозяйствующий субъект длительное время благополучен по бруцеллезу и не вакцинирует поголовье скота против бруцеллеза.
Сто образцов сывороток крови овец с положительными результатами на бруцеллез по комплексу РА, РБП и/или РСК и ИФА (тест-набор фирмы ID Vet, Франция), а также 8 овечьих негативных сывороток были предоставлены РГП «Национальный референтный центр по ветеринарии» (НРЦВ) КВКН МСХ РК.
Определение антигенности белковых препаратов бруцелл в н-ИФА. Лунки полистиролового планшета (Thermo Fisher Scientific, США) сенсибилизировали раздельно следующими антигенами бруцелл: рБВМ19, рБВМ25, рБВМ31, рВР26, рСОД и ЭБА B. abortus и ЭБА B. melitensis в концентрации 5,0 мкг/мл в 0,1М бикарбонатном буфере с рН 9,6. Планшет закрывали крышкой и оставляли в холодильнике (4 °С) на ночь, после чего содержимое лунок удаляли и отмывали 6 раз, заполняя лунки до верхнего края забуферен- ным физиологическим раствором с добавлением Твина-20 (ЗФР-Тв). Активные центры твердой фазы блокировали 1 %-м раствором бычьего сывороточного альбумина. Далее в лунках готовили разведения исследуемых и/или контрольных образцов сывороток крови 1:100 и 1:200 в ЗФР-Тв и оставляли на 1 ч при 37 °С. После отмывки планшет в лунки вносили рабочее разведение антивидовых (анти-бычьих или анти-овечьих) антител, меченых пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США) в ЗФР-Тв. Через 1 ч после выдерживания планшета в термостате (37 °С) повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанного конъюгата. Реакцию проявляли с помощью субстрата фермента - ортофенилендиамина (Sigma-Aldrich, США). Спустя 3-5 мин в лунки добавляли равное количество 2 М серной кислоты. Оптическую плотность (ОП) реакционной жидкости определяли при длине волны 492 нм с использованием планшетного ридера (Bio-Rad 680, США). Реакцию считали положительной, если показатель ОП исследуемой сыворотки (ОПис) в разведении 1:200 в два и более раз превышал среднее значение ОП контрольных сывороток (ОПкс) в этом же разведении.
Статистическая обработка цифровых данных выполнена с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 показаны результаты серологических исследований коров из свежего очага бруцеллезной инфекции в н-ИФА.
Рис. 1. Антигенность белковых препаратов в н-ИФА при исследовании сывороток крови серопозитивных коров (n=77) из свежего очага бруцеллеза
Данные рис. 1 демонстрируют различную агирующих на бруцеллез в РА и/или РБП. Так, антигенность белков в н-ИФА по отношению ЭБА B. abortus показал максимальную антик сывороткам крови коров, положительно ре- генность, обнаружив противобруцеллезные антитела у 73 (94,8 %) голов. Рекомбинантные белки - рБВМ19, рБВМ25 и рБВМ31 распознавались антителами лишь у 30 (39 %), 39 (50,6 %) и 59 (76,6 %) голов соответственно.
Следует отметить, что периплазматические белки патогена: рВР26 и рСОД - оказались менее антигенными, чем внешнемембранные, детектируя наличие специфичных антител только у 23 (29,9 %), и 11 (14,3 %) коров соответственно. Эти различия, видимо, связаны с различной локализацией использованных белков в клетке бруцелл. Если рБВМ19, рБВМ25 и рБВМ31 являются поверхностными белками, то рВР26 и рСОД - периплазматическими, локализованными между пептидогликаном и внутренней мембраной клеточной стенки бруцелл, и поэтому менее доступными для иммунной системы, чем внешнемембранные компоненты. Поэтому у крупного рогатого скота, находящегося в свежем очаге инфекции, иммунный ответ в первую очередь развивается на белки внешней мембраны. Иммунный ответ на
глубинные» белки развивается позже, когда возбудители болезни начинают усиленно вырабатывать СОД с целью детоксикации супероксидных радикалов, генерируемых противомикробным иммунным ответом хозяина. Мы склонны считать, что антителообразование против периплазматических белков запаздывает по сравнению с реакцией организма на белки, расположенные на внешней мембране.
Корреляционный анализ результатов различных вариантов н-ИФА показал, что между антигенностью использованных белковых препаратов не наблюдается существенной корреляционной зависимости. Умеренная корреляционная связь отмечена между результатами ИФА/рБВМ25 и его вариантами на основе рБВМ19 (г=0,45), рБВМ31 (г=0,43), рСОД (г=0,40) и рВР26 (г=0,35).
Результаты изучения антигенности белковых препаратов бруцелл в н-ИФА на сыворотках крови коров благополучного по бруцеллезу хозяйства показаны на рис.2.
Рис. 2. Серологические показатели коров (n=48) благополучного по бруцеллезу хозяйства в н-ИФА Serologic parameters of cows (n=48) from Brucellosis free farm by ELISA test
Среди исследованных животных 11 голов были вакцинированы за 6 месяцев, а остальное поголовье - за 11 месяцев до серологических исследований в н-ИФА. Все животные, иммунизированные за 6 месяцев до исследования, за исключением одной головы (№ 144), показали положительные результаты по РБП (90,9 %), тогда как среди 37 голов, иммунизированных за 11 месяцев до исследования, только 10 голов (27,0 %) были серопозитивными по данной пробе.
Из рис. 2 видно, что антитела к ЭБА В abortus были найдены у 11 голов крупного рогатого скота (22,9 %). Результаты н-ИФА/ ЭБА B. abortus и РБП совпали у 6 голов из 20, положительных по данной пробе (30,0 %). Среди них 4 головы были вакцинированы за 11 месяцев и 2 за 6 месяцев до исследования в н-ИФА. Антитела к рБВМ19 и рБВМ25 были обнаружены в сыворотке крови у 6 (12,5 %) и 4 голов (8,3 %) соответственно. В двух случаях н-ИФА/рБВМ19 подтвердил результаты н-ИФА/ЭБА B. abortus и лишь в одном случае установлено совпадение показаний ИФА/ рБВМ25 и н-ИФА/ЭБА B. abortus. Кроме того, у одной головы (2,1 %) детектированы антитела к рБВМ31, а у другой (2,1 %) - к рВР26. Причем у этих животных установлена положительная реакция и по н-ИФА/ рБВМ25.
Таким образом, наши исследования показывают, что антитела к белковым компонентам могут вырабатываться и у вакцинированных животных. Эти данные не согласуются с результатами других исследователей, полученными на мышах. Так, на мышиной модели была описана возможность дифференциации инфицированных от вакцинированных индивидуумов с помощью н-ИФА на основе обнаружения антител против рБВМ у мышей, зараженных B. melitensis Rev-1 [15].
Обращает на себя внимание тот факт, что животные благополучной по бруцеллезу фермы не имели анти-СОД антител, что, на наш взгляд, является доказательством отсутствия инфекции. Интересно отметить, что если в группе крупного рогатого скота из свежего очага бруцеллеза антигенность рекомбинантных белков (по количеству выявляемых животных) возрастала по мере увеличения их молекулярной массы: рБВМ19 - 39, рБВМ25 - 50,6 и рБВМ31 - 76,6 %, то в группе вакцинированных животных благополучного стада наблюдалось обратное явление: 12,5; 8,3 и 2,1 % соответственно.
Как и следовало ожидать, белковые препараты бруцелл более интенсивно связывались с антителами сывороток крови коров из свежего очага бруцеллезной инфекции. Об интенсивности связывания белков с антителами судили по показателям кратности превышения ОПис над средним значением ОПкс (табл. 1).
Из табл. 1 следует, что антигенность белковых препаратов бруцелл была более выраженной при тестировании сывороток крови крупного рогатого скота из свежего очага инфекции, нежели из благополучного хозяйства. Например, если у благополучного стада значение ОПис/ОПкс в н-ИФА/ЭБА B. abortus было равно 1,55±0,68, то у животных из свежего очага инфекции данный показатель достиг 6,63±0,23 (Р<0,001). Существенные различия между двумя группами животных были отмечены и по интенсивности связывания противобруцеллезных антител с рекомбинантными белками: рСОД (Р<0,05), рБВМ31 и рВР26 (Р<0,01), рБВМ25 и рБВМ19 (Р<0,05).
Антигенность ЭБА другого вида бру- целл - B. melitensis и рекомбинантных белков изучалась на образцах сывороток крови овец в количестве 100 гол., положительно реагирующих на бруцеллез в РА, РСК и/или РБП.
Для определения ОПкс в н-ИФА на основе рБВМ19, рБВМ25, рБВМ31, рВР26, рСОД и/или ЭБА B. melitensis были использованы негативные сыворотки крови 8 овец, предоставленные НРЦВ КВКН. Среднее значение ОПкс находилось в пределах 0,142±0,010; 0,300±0,026; 0,346±0,029; 0,233±0,032; 0,306±0,027; 0,129±0,005 соответственно при разведении 1:200, а предельно минимальное (пограничное) положительное значение ОПис было определено на уровне 0,284; 0,600, 0,692; 0,466; 0,612; 0,258, что в два раза выше среднего ОПкс.
Таблица 1
Интенсивность связывания белковых антигенов бруцелл с антителами сывороток крови крупного рогатого скота в зависимости от эпизоотического состояния стада, ОПис/ОПкс
|
Эпизоотическое состояние стада |
Белковые антигены бруцелл, использованные в н-ИФА |
||||||
|
ЭБА B. abortus |
рБВМ19 |
рБВМ25 |
рБВМ31 |
рВР26 |
рСОД |
||
|
Благополучное по бруцеллезу (п=48) |
1,55±0,68 |
1,66±0,05 |
1,35±0,67 |
1,16±0,36 |
1,07±0,25 |
0,91±0,32 |
|
|
Свежий очаг бруцеллеза (п=77) |
6,63±0,23*** |
2,56± 0,13* |
2,55±0,08* |
3,50±0,12** |
2,66±0,17** |
3,50±0,12* |
*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
Результаты н-ИФА, полученные при исследовании овец, реагирующих на бруцеллез по показаниям традиционных серологических реакций и коммерческого ИФА-набора (ID Vet, Франция), обобщены в табл. 2.
Таблица 2
Антигенность белков бруцелл в н-ИФА при исследовании сывороток крови серопозитивных овец (n=100)
|
Показатель |
Виды белковых препаратов |
бруцелл, использованных в н-ИФА |
|||||
|
ЭБА B. melitensis |
рБВМ19 |
рБВМ25 |
рБВМ31 |
рВР26 |
рСОД |
||
|
Количество овец с положительными результатами в н-ИФА |
69 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
|
Средние значения ОП реакционной жидкости |
0,320± |
0,172± |
0,293± |
0,265± |
0,207± |
0,336± |
|
|
100 голов |
0,013* |
0,006 |
0,007 |
0,009 |
0,008 |
0,011 |
* Среднее значение ОП у 69 голов с положительными результатами в н-ИФА составило 0,396±0,008.
Как показали результаты исследований, н-ИФА/ЭБА B. melitensis подтвердил положительные показания традиционных серологических реакций и коммерческого ИФА-теста у 69 голов, тогда как ни в одном случае не были обнаружены антитела, связывающиеся с рекомбинантными белками внешней мембраны и/или периплазматическими антигенами. По всей вероятности, белки клеток B. melitensis вызывают развитие не гуморального, а клеточного иммунитета. Кроме того, эти антитела могут иметь вакцинное происхождение и поэтому в большей мере быть направленными против ЛПС-компонента бруцелл.
Отрицательные результаты н-ИФА на основе рекомбинантных белков бруцелл при исследовании сывороток крови отдельных коров и овец, положительно реагирующих на бруцеллез в РА РСК и/или РБП, на наш взгляд, подтверждают возможность получения ложноположительных реакций при использовании единого бруцеллезного антигена, состоящего из типичных бруцелл гладких форм. Как известно, S-ЛПС бруцелл в антигенном отношении весьма сходны с таковыми других грамне- гативных бактерий, что может быть причиной получения ложноположительных результатов при использовании традиционных серологических тестов [3]. ЭБА бруцелл, полученный нами по методике L. Tabatabai и D. Deyoe [12], хотя и считается белковым препаратом, также не лишен полисахаридного компонента клеточной стенки. Поэтому мы предполагаем, что более объективной диагностики бруцеллеза можно достичь при использовании в ИФА рекомбинантных белков патогена. Тем не менее, основываясь на результатах исследований сывороток крови серопозитивных овец, можно предположить, что ЭБА B. melitensis более специфичен, чем ЛПС коммерческого ИФА-набора ID Vet (Франция), поскольку н-ИФА не подтвердил наличие специфических антител в сыворотке крови у 31 % овец.
Рекомбинантные белки не всегда одновременно связывались с антителами одного и того же серопозитивного крупного рогатого скота. Кроме того, среди них не было отдельно взятого белка, который ни в одном случае не уступал бы другим белкам по своей антигенности. Следовательно, хотя использование отдельных рБВМ и придает специфичность н-ИФА, но снижает его чувствительность при серологических исследованиях животных на бруцеллез. В этой связи для повышения чувствительности иммуноанализа следует использовать не один отдельно взятый белок, а комбинацию из нескольких рекомбинантных белков. Таким образом, полученные результаты указывают на необходимость продолжения исследований по определению диагностической ценности им-муноферментных диагностикумов на основе рекомбинантных белков бруцелл.
ВЫВОДЫ
1. Среди использованных белковых препаратов бруцелл наиболее антигенным в н-ИФА оказался ЭБА B. abortus и/или B. melitensis, обнаруживая антитела у 94,8 % крупного рогатого скота и/или 69 % овец, положительно реагирующих на бруцеллез в РА, РБП и/или РСК.
2. Антитела, специфичные к рБВМ19, рБВМ25 и рБВМ31, детектировались в образцах сывороток крови лишь у 39; 50,6 и 76,6 % серопозитивных коров соответственно. Периплазматические рекомбинантные белки - рВР26 и рСОД - оказались менее антигенными, чем внешнемембранные, выявляя наличие анти-Brucella антител только у 29,9 и 14,3 % серопозитивного крупного рогатого скота соответственно.
3. Периплазматический белок рСОД может быть использован в н-ИФА для дифференциации поствакцинальных антител от постинфекционных.
4. Белки внешней мембраны и/или пери- плазматические белки бруцелл в н-ИФА не распознавались антителами овец, положительно реагирующих на бруцеллез по показаниям традиционных серологических реакций.
5. Отрицательные результаты н-ИФА при исследовании сывороток крови животных с положительными показаниями РА, РСК и/или РБП свидетельствуют о низкой специфичности единого бруцеллезного антигена, используемого в традиционных серологических реакциях.
6. Объективная оценка потенциала рекомбинантных белков в диагностике бруцеллеза может быть дана на основе результатов экспериментального заражения лабораторных и/ или сельскохозяйственных животных.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Pappas G. Brucellosis in the world today [Электрон. ресурс] // HCDCP E-bulletin. - Режим доступа: http://www2.keelpno.gr/blog/?p=2033.
2. Диагностическая ценность РИД с разными О-ПС антигенами при бруцеллезе крупного рогатого скота / П. К. Аракелян, Г. В. Разницына, Т. А. Янченко [и др.] // Ветеринария. -2016. -№ 7. - С. 25-30.
3. Humoral immune response against lipopolysaccharide and cytoplasmic proteins of Brucella abortus in cattle vaccinated with B. abortus S19 or experimentally infected with Yersinia enterocolitica serotype O:9 / P. C. Baldi, G. H. Giambartolomei, F.A. Goldbaum [et al.] // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. - 1996. - Vol. 3. - Р 472-476.
4. Мониторинг и анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу крупного рогатого скота в Республике Казахстан за 2007-2015 годы / А. Е. Ешмухаметов, К. К. Бейсембаев, Ж. С. Асауова [и др.] // Вестн. Костанай. гос. ун-та им. А. Байтурсунова. - 2016. - № 2. - С. 36-41.
5. Immunogenic proteins of Brucella abortus to minimize cross reactions in brucellosis diagnosis / K. Y. Ko, J. W. Kim, M. Her [et al.] // Veterinary Microbiology. - 2012. - Vol.156. - Р. 374-380.
6. Cloning, Expression and Characterisation of Recombinant Outer Membrane Protein 16 from Brucella spp. / G. Kaur, R. Verna, B.V.S. Kumar [et al.] // Proc. Natl. Acad. - 2015. - Vol. 85. - Р 853-858.
7. Mohammadi E., Golchin M. Detection of Brucella abortus by immunofluorescence assay using anti outer membrane protein of 19 kDa antibody //Adv Clin Exp Med. - 2018. - Vol. 27. - P. 643-648.
8. Nucleotide sequence and expression of the gene encoding the major 25-kilodalton outer membrane protein of Brucella ovis: Evidence for antigenic shift, compared with other Brucella species, due to a deletion in the gene / A. Cloeckaert, J. M. Verger, M. Grayon [et al.] // Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64. - P. 2047-2055.
9. Effective use of recombinant Brucella ovis Omp31 antigen to detect cattle serum antibodies by the ELISA indirect test / M.C. Navarro-Soto, R. Gomez-Flores, A. Morales-Loredo [et al.] // Proceedings of Biotechnology Summit. - Mexico, 2014. - P.139-143.
10. Expression, purification and immunochemical characterization of recombinant OMP28 protein of Brucella species / Y. Manat, A. V. Shustov, E. Evtehova, S. Z. Eskendirova // Open Veterinary Journal. - 2016. - Vol. 6. - P. 71-77.
11. Structural, Functional, and Immunogenic Insights on Cu, Zn Superoxide Dismutase Pathogenic Virulence Factors from Neisseria meningitidis and Brucella abortus / A. J. Pratt, M. DiDonato, D. S. Shin [et al.] //J. Bacteriol. - 2015. - Vol. 197, № 24. - Р. 3834-3847.
12. Tabatabai L.B., Deyoe D. L. Biochemical and biological properties of soluble protein preparations from Brucella abortus //Developments in biological standardization. - 1984. - Vol. 56. - P. 199-211.
13. Получение штамма продуцента рекомбинантного БВМ19 Brucella abortus и изучение его антигенности / А. К. Булашев, К. Т Турсунов, Ж. К. Каирова [и др.] // Вестн. КазАТУ им. С. Сейфуллина. - 2018. -№ 3. - C. 117-127.
14. Пат. № 30873 РК, МПК C12N 15/52, C12N1/21 Рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21 (DE3) /pET22/SOD, продуцирующий Cu/Zn-зависимую супероксиддисмутазу / С. З. Ескендирова, А. В. Шустов, Е. Б. Евтыхова, Е. Манат; заявитель и патентообладатель Национальный центр по биотехнологии РК. -№ 2014/1335.1; заявл. 17.10.2014; опубл. 25.12. 2015, Бюл. № 12. - 5 с.
15. Serological diagnostic potential of recombinant outer membrane proteins (rOMPs) from Brucella meliten- sis in mouse model using indirect enzyme-linked immunosorbent assay / I. Ahmed, S. Khairani-Bejo, L. Hassan [et al.] // BMC Vet. Res. - 2015. - Vol. 11:275. - DOI: 10.1186/s12917-015-0587-2.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Определение понятия о комплексной оценке питательности кормов при анализе биологической полноценности протеина. Характеристика бахчевых культур и их значение в кормлении животных. Классификация пород крупного рогатого скота по направлению продуктивности.
контрольная работа [21,4 K], добавлен 21.01.2011Характеристика бруцеллеза овец и коз. Противоэпизоотические мероприятия. Эпизоотологическое обследование территории Шушенского района. Комплекс противоэпизоотических мероприятий против бруцеллеза мелкого рогатого скота в хозяйствах Шушенского района.
курсовая работа [2,5 M], добавлен 19.04.2017Роль отдельных цитокинов в формировании противобруцеллезного иммунитета на фоне применения разных вакцинных штаммов бруцелл. Патогенез, течение и симптомы развития болезни у крупного рогатого скота и домашних животных; методы лечения и профилактики.
курсовая работа [112,7 K], добавлен 31.01.2013Методы диагностики, дифференциальная диагностика и лечение при эмфизематозном карбункуле крупного рогатого скота. Лейкоз крупного рогатого скота. Определение, распространение, экономический ущерб и этиология, течение и симптомы цирковирусной болезни.
контрольная работа [25,7 K], добавлен 20.04.2012Общая характеристика крупного рогатого скота, распространенного в исследуемом хозяйстве. Описание характеристики по одной основной породе крупного рогатого скота и овец, разводимых в зоне расположения хозяйства. Влияние кормления животных на их развитие.
контрольная работа [30,4 K], добавлен 19.06.2014Воспаление околосердечной сумки у крупного рогатого скота. Регистрация больного животного. Дифференциальная диагностика различных перикардитов. Патологоанатомические изменения при нетравматическом перикардита. Неправильный уход и эксплуатация животных.
курсовая работа [181,6 K], добавлен 13.05.2015Краткая характеристика возбудителя бруцеллеза. Основные особенности патогенеза и клинической картины, патологоанатомические изменения. Методика ветсанэкспертизы мяса и субпродуктов. Послеубойный осмотр органов и туш крупного и мелкого рогатого скота.
курсовая работа [54,8 K], добавлен 07.12.2011Анатомо-морфологические особенности фасциол. Их биологический цикл развития. Фасциолез как трематодозное заболевание крупного рогатого скота. Эпизоотология фасциолеза, его течение и симптомы. Патогенное воздействие возбудителя на крупного рогатого скота.
курсовая работа [27,5 K], добавлен 16.04.2010Экономические потери от незаразных болезней, падеж животных и снижение продуктивности. Постановка диагноза "травматический перикардит" на основании анамнеза, клинических признаков и исследований крови. Методы лечения перикардита крупного рогатого скота.
курсовая работа [41,1 K], добавлен 24.05.2019Протозойные болезни крупного рогатого скота, кровепаразитарные болезни (пироплазмидозы). Морфология и биология возбудителя бабезиоза, размножение бабезиид в эритроцитах. Клиническое обследование животных, диагностика, профилактика и лечение заболевания.
реферат [343,6 K], добавлен 30.01.2012Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота как прионная болезнь животных. Историческая справка о ее возникновении и фактах распространения. Описание возбудителя. Симптомы заболевания, течение, клиническое проявление, диагностика и профилактика.
реферат [18,0 K], добавлен 26.09.2009Разведение и генетика животных. Краткая характеристика холмогорской и голштинской пород крупного рогатого скота. Технологии заготовки и хранения кормов. Структура и анализ рационов различных групп животных. Механизация и электрификация в животноводстве.
отчет по практике [47,0 K], добавлен 01.09.2013Понятие о конституции, экстерьере и интерьере крупного рогатого скота. Способы оценки крупного рогатого скота по экстерьеру и конституции. Линейный метод оценки телосложения молочного крупного рогатого скота. Метод глазомерной оценки, фотографирование.
курсовая работа [701,9 K], добавлен 11.02.2011Методы оценки животных по конституции, экстерьеру и интерьеру, их ведущее место отборе и подборе животных для различных целей (воспроизводительной, продуктивной). Характеристика статей крупного рогатого скота комбинированного направления продуктивности.
курсовая работа [36,1 K], добавлен 10.12.2009Описание демодекоза крупного рогатого скота как инвазионной болезни, вызываемой паразитированием условно патогенного клеща. Жизненный цикл возбудителя и эпизоотология заболевания. Диагностика, профилактика, терапия и методы борьбы с демодекозом скота.
контрольная работа [19,2 K], добавлен 19.02.2011Возбудитель туберкулёза крупного рогатого скота. Резистентность организма животного к болезни, ее клинико-морфологические признаки. Микроскопическая картина туберкулов в зависимости от стадии. Патологоанатомические характеристики туберкулезных пневмоний.
курсовая работа [4,2 M], добавлен 22.09.2016Процесс выделения ДНК из крови свиней и крупного рогатого скота. Характеристика серологических реакций, протекающих с укрупнением или нейтрализацией антигена, а также с участием фагоцитов. Основные компоненты, необходимые для проведения ПЦР-диагностики.
отчет по практике [261,1 K], добавлен 13.12.2011Гиподерматоз как хронически протекающая болезнь крупного рогатого скота, морфология и биология возбудителя. Факторы, влияющие на численность оводов и пораженность животных личинками. Патогенез и клиническая картина данного заболевания, его лечение.
реферат [33,4 K], добавлен 26.12.2010Историческая справка о парагриппе-3, его распространение и причиняемый им экономический ущерб. Свойства вируса и пути заражения крупного рогатого скота, эпизоотологические данные. Патологоанатомические изменения в ходе болезни, ее диагностика и лечение.
реферат [15,7 K], добавлен 15.02.2012Проведение эпизоотологического анализа при лейкозе крупного рогатого скота. Разработка мероприятий по профилактике и ликвидации болезни среди молочного скота фермерского хозяйства. Обнаружение у крупного рогатого скота клинических признаков болезни.
презентация [2,9 M], добавлен 20.03.2019
