Содержание фитогормонов, рост и развитие растений гречихи под действием импульсного давления

Размещено на http://www.allbest.ru/

Статья по теме:

Содержание фитогормонов, рост и развитие растений гречихи под действием импульсного давления

Е.Э. Нефедьева, Н.Г. Мазей, А.А. Мирошниченко, В.Н. Хрянин

Исследовали закономерности изменения морфологических признаков и гормонального баланса проростков гречихи разного возраста в зависимости от величины импульсного давления, возникающего в ударной волне. Оценивали семенную продуктивность растений гречихи, подвергнутых стрессу. Анализировали эмпирическое и нормальное распределение по частотам варьирования семенной продуктивности растений гречихи после воздействия импульсного давления.

Реакция растений на воздействие различных физических или химических факторов может быть неадаптивной или адаптивной в зависимости от запрограммированной устойчивости (1, 2). Стрессоры в малых дозах могут быть использованы в качестве стимуляторов физиологических процессов растений. Нами предложен способ обработки семян импульсным давлением, характеризующийся эффективностью и высокой воспроизводимостью результатов (3). Предполагается, что рецепторы, воспринимающие механическое сжатие и давление, связаны с мембранами клеток. После рецепции сигнала в клетках происходят как неспецифические стрессовые реакции, так и специфические изменения. Поэтому представляло интерес выяснить, какие физиологические изменения способствуют повышению урожайности.

Ранее нами было показано, что импульсное давление (ИД) в диапазоне 11-29 МПа стимулирует ростовые и продукционные процессы у растений гречихи (4). В частности, отмечено возрастание митотического индекса в 2,6-2,8 раза в корневых меристемах проростков в возрасте 48-58 ч, а также изменение гормонального баланса проростков, влияющее на формирование вегетативных и генеративных органов, что способствовало увеличению продуктивности растений.

Известно, что этапы онтогенеза растений находятся под контролем фитогормонов (5). Гормоны усиливают адаптивные возможности и приспособительные реакции растительных организмов к стрессовым факторам. В частности, абсцизовая кислота (АБК), получившая название «гормон стресса», играет ключевую роль в индукции синтеза более десятка стрессовых белков; протекторная роль большинства из них доказана (5, 6). Показано, что при выращивании растений ячменя в условиях клиностатирования в течение 7 сут наблюдается 23-кратное увеличение содержания АБК по сравнению с контролем, а также повышение в 10-16 раз концентрации этилена (7). К числу важных ответных реакций на воздействие разнообразных стрессовых факторов среды относятся сдвиги гормонального баланса растений, обусловленные не только накоплением АБК, но и снижением содержания индолилуксусной кислоты (ИУК) и цитокининов, что, по-видимому, связано с переключением функциональной активности клеток под влиянием стрессоров.

Целью настоящей работы было выявление закономерностей изменения морфологических признаков и гормонального баланса проростков гречихи в зависимости от ударно-волнового воздействия и оценка семенной продуктивности растений.

Методика. Исследования проводили на растениях гречихи Fagоpyrum esculentum Moench. сорта Аромат в мелкоделяночном опыте; семена сеяли 15-17 мая, урожай собирали 25-27 августа. Сухие семена перед посевом (15000 шт.) помещали в поролоновые кассеты (по 500 г в каждую), укладывали на дно контейнера из нержавеющей стали, заполненного водой, и обрабатывали импульсным давлением (ИД) с амплитудой 11-29 МПа по ранее разработанной методике (3).

Давление на фронте волны (Р) рассчитывали по формуле: P = = 5330(1/3Q:R)1,13 (МПа), где Q -- масса заряда взрывчатого вещества, кг; R -- расстояние от центра взрыва до поверхности семян, м. ИД создавали прохождением ударной волны, возникающей при детонации водостойкого взрывчатого вещества и распространяющейся в воде. Семена при этом испытывали кратковременное объемное сжатие в течение 15-25 мкс.

Содержание фитогормонов (ИУК, зеатина, гиббереллина А3 и АБК) определяли на следующих фазах: прорастания семян на 2-е сут после замачивания (биотест); недифференцированного конуса нарастания на 8-е сут (метод ВЭЖХ); формирования листьев и пазушных вегетативных побегов на 11-е сут (биотест) (8-12). Материал фиксировали в жидком азоте и проводили три параллельных определения. В состав исходного образца входило 20-40 выборочных проб. Фитогормоны экстрагировали из гомогенизированного материала 5-кратным объемом 80 % этанола (трижды по 24 ч). Спиртовой экстракт отделяли фильтрованием и концентрировали до водного остатка при температуре не выше 40-50 оС. Водный остаток промораживали в течение 1 сут при температуре -25…-50 оС, закисляли 1 н. НСl до рН 2,8-3,0; ИУК, АБК, гиббереллины трижды экстрагировали равным объемом этилацетата. Суммарный этилацетатный экстракт упаривали до сухого остатка и растворяли в этаноле. Оставшийся после этилацетатной экстракции кислый водный раствор подщелачивали 1 н. NaOH до рН 8-9 и трижды экстрагировали цитокинины равным объемом водонасыщенного бутанола. Объединенный экстракт упаривали до сухого остатка и растворяли в этаноле.

Тонкослойную хроматографию ИУК, АБК и гиббереллина А3 (ГА3) проводили на пластинках Silufol-254 в смеси изопропанол, 28 % NН3 и Н2О (10:1:1); цитокининов -- в смеси бутанол, ацетат и Н2О (4:1:1). В качестве стандартов использовали спиртовые растворы ИУК, АБК, ГА3 («Sigma», США), зеатина («Calbiochem», США). После того как с хроматограммы элюировали ИУК, АБК, цитокинины, из оставшегося на пластинке силикагеля элюировали суммарное количество ГА3. В предварительной работе после опрыскивания хроматограммы 5 % H2SО4 и прогревания были выявлены пятна, флюоресцирующие в УФ-лучах, по которым идентифицировали положение ГА3 на хроматограмме. Элюирование проводили 80 % этанолом 2 ч при 25 оС. В полученных спиртовых растворах определяли содержание фитогормонов методом ВЭЖХ на приборе Милихром-4 с колонкой 2100 мм, заполненной сорбентом Нуклеосил С16 (диаметр частиц 5 мкм), используя вышеперечисленные стандарты.

Фитогормоны хроматографировали при соблюдении следующих условий: ИУК -- 96 % этанол (растворитель), 20 % ацетонитрил (элюент, расход 120 мкл/мин), = 220 нм; ГА3 -- 20 % этанол (растворитель и элюент) в 2 сМ трис-ацетате, pH 8,0 (расход 100 мкл/мин), = 204 нм; зеатин -- 20 % метанол (растворитель), 20 % ацетонитрил (элюент, расход 110 мкл/мин), = 270 нм; АБК -- 40 % водный метанол (растворитель), 30 % водный метанол (элюент, расход 110 мкл/мин), = 234 нм. Содержание фитогормонов определяли по соотношению площадей пиков проб и стандартов.

Для биотеста на ИУК семена пшеницы сорта Альбидум 48 замачивали в течение 24 ч при температуре 24 оС, а затем проращивали 2 сут в термостате при 25 оС. Из колеоптилей длиной 18-20 мм вырезали участки длиной 0,5 см (10 шт.), которые помещали в пузырьки из-под пенициллина вместе с зоной хроматограммы, заливали 2 мл 2 % раствора сахарозы и инкубировали 18-20 ч в темноте при 26 оС.

Биотест на ГА3 проводили на семенах салата сорта «Берлинский», которые проращивали 20 ч на свету при комнатной температуре и 48 ч в темноте при 26 оС до длины гипокотилей 4-5 мм. В чашки Петри заливали 0,75 % агар, после застывания делали 10 надрезов, в которые высаживали проростки салата, причем на семядоли наносили по 5 мкл экстрактов фитогормона. Чашки Петри накрывали стеклом и оставляли на 1 сут на свету при 26-28 оС, после чего измеряли длину гипокотилей.

Основой биотеста на активность цитокининов служила способность последних стимулировать увеличение массы изолированных семядолей. Для этого семена огурца сорта Успех замачивали на 2 ч в воде, затем высевали в кювету и проращивали в термостате при 28 оС. Через 6 сут при слабом освещении семядоли снимали, взвешивали по 10 шт. (выравнивая пробы по массе) и помещали в чашки Петри с экстрактами хроматограмм. Биотестировали в термостате при 28 оС в течение 1 сут, после чего семядоли взвешивали.

Для оценки активности АБК в чашки Петри раскладывали по 15 семян горчицы сорта Сарептская, которые заливали экстрактом хроматограмм (3-5 мл) и выдерживали в темновом термостате в течение 15-17 ч при 22-24 оС. О содержании АБК судили по процентному соотношению числа проросших семян в опыте и контроле.

Всхожесть семян, массу сухого вещества, длину побегов и корней, а также морфологические признаки конусов нарастания оценивали у проростков гречихи в возрасте 8 сут. Средние арифметические значения и стандартные ошибки представлены по трем биологическим повторностям.

Для определения продуктивности растений гречихи подсчитывали количество плодов на одном растении и массу 1000 семян. Выборка генеральной совокупности включала 41-49 вариантов. Число классов (k) для контрольной выборки определяли по правилу Старджеса: k = 1 + 3,3 logn, где n -- объем выборки. Величину классового интервала оценивали по соотношению степени варьирования признака и числа классов:

.

Для удобства сравнения классовый интервал для всех выборок был одинаковым и соответствовал контролю. При построении эмпирических кривых распределения частоту варьирования семенной продуктивности определяли по числу вариантов выборки, входящих в границы рассматриваемого класса. Теоретическую частоту при построении кривых нормального распределения рассчитывали по уравнению

где -- искомая ордината кривой (теоретическая частота); n - объем выборки; i -- классовый интервал; х -- значение признака в выборке, для которого определяли теоретическую частоту; М -- выборочная медия; -- среднее квадратическое отклонение. Соответствие эмпирического и нормального распределения выявляли по критерию 2 (13).

Результаты. При воздействии ИД на 2-суточные проростки гречихи наблюдалось снижение содержания в последних АБК (на 23-75 %) и ИУК (на 8-18 %), а также повышение содержания зеатина (на 20-87 %) (рис. 1а). Снижение содержания АБК вызвано подавлением синтеза гормона, а ИУК -- нарушениями метаболизма азота, так как при стрессе в клетках возрастает количество пероксидаз, являющихся компонентами ауксиноксидаз (1, 14). Повышение содержания зеатина свидетельствует об увеличении проницаемости клеточных мембран и активации клеточных делений (14).

Содержание ГА3 зависело от интенсивности стрессового воздействия: уменьшалось при ИД 11 и 23 МПа и возрастало при амплитуде 29 МПа. Последнее обстоятельство может быть косвенно обусловлено возрастанием содержания АБК в предшествующие периоды. Подтверждением этому служит тот факт, что всхожесть растений в опыте была значительно меньше, чем в контроле, и составляла 3-20 % (табл. 1).

1. Доля проросших семян гречихи на различных сроках выращивания под влиянием импульсного давления разной интенсивности (%)

На ячмене было показано, что АБК и ГА3 являются антагонистами в отношении роста и деления клеток, процессов клеточной дифференциации, синтеза РНК и белков (14). Мы предположили, что уменьшение содержания ГА3 при ИД 11 и 23 МПа вызвано запуском синтеза гидролаз в более ранние сроки (в возрасте менее 2 сут). Обратное соотношение ГА3 и АБК при ИД 29 МПа свидетельствует о том, что синтез ферментов ранее был нарушен, а затем восстанавливается, то есть через некоторое время следует ожидать усиления роста. При низкой амплитуде воздействия восстановление наступает раньше, чем при высокой, что согласуется с данными других исследователей (1).

У 8-суточных проростков содержание АБК после обработки ИД возрастало в 2,5-2,8 раза относительно контроля. По данным литературы, содержание АБК у растений при стрессе существенно варьирует, причем максимум отмечен в возрасте проростков 24 ч и 7-8 сут (14). Изменение синтеза фитогормонов под влиянием ИД носило не эпизодический характер, а продолжительное время оказывало воздействие на физиологические процессы (табл. 2). Так, повышение содержания АБК сопровождалось замедлением ростовых процессов в возрасте проростков гречихи 8 и 11 сут.

Содержание зеатина у 8-суточных проростков возрастало на 10-34 % (см. рис. 1б). Известно, что эквимолярное содержание АБК и зеатина устраняет антагонизм между этими соединениями. В наших опытах наблюдалось значительное превышение концентрации АБК относительно зеатина, что вызывало торможение физиологических процессов.

Снижение содержания ИУК на 30 % при ИД 23 МПа и повышение содержания зеатина у 2- и 8-суточных проростков гречихи способствовало ослаблению апикального доминирования и инициированию закладки примордиев в конусе нарастания. Содержание ГА3 возрастало на 41 % при интенсивности ИД 23 МПа и снижалось на 25 и 36,4 % при ИД соответственно 29 и 11 МПа. Увеличение содержания ГА3 и зеатина активировало деление конуса нарастания и рост стебля (см. табл. 2). У 11-суточных побегов при ИД 11 и 23 МПа содержание АБК уменьшалось соответственно

2. Морфометрические показатели проростков гречихи на различных сроках выращивания под влиянием импульсного давления разной интенсивности

на 29 и 50 % по сравнению с контролем; при ИД 29 МПа различий не обнаружено. Содержание гормонов-активаторов при ИД 11 МПа соответствовало контролю, а при 23 и 29 МПа превышало таковой (см. рис. 1в).

Повышение содержания ГА3 послужило причиной интенсивного роста проростков (см. табл. 2). Увеличение содержания ИУК могло быть обусловлено большим количеством мест синтеза кислоты.

Высокое содержание зеатина, возможно, вызвано усилением его синтеза в апикальных меристемах корней, где возрастала митотическая активность у проростков в возрасте 8 сут (4).

Рис. 1 - Содержание фитогормонов (индолилуксусной кислоты, зеатина, гиббереллина А3 и абсцизовой кислоты) в проростках гречихи разного возраста под влиянием импульсного давления различной интенсивности: а, б, в и г -- соответственно 2-, 8-, 11-суточные побеги и 11-суточные корни; 1, 2, 3 и 4 -- соответственно контроль, 11, 23 и 29 МПа.

гречиха фитогормон ударный волновой

В корнях 11-суточных проростков содержание ИУК повышалось при ИД 23 МПа на 23 %, что индуцировало закладку боковых корней в перицикле (см. рис. 1г). Снижение содержания зеатина при ИД 29 МПа на 13-23 % обеспечивало образование боковых корней. Содержание ГА3 и АБК не оказывало влияния на рост корней в длину, однако под влиянием АБК снижалась активность ферментов, в частности Н+АТФазы.

У проростков, обработанных ИД в возрасте 3 сут, длина и масса побегов превышали таковые в контроле; аналогичные показатели корня уменьшались (см. табл. 2). При прорастании клетки корня первыми начинали делиться, а ранний выброс АБК тормозил этот процесс. У 8-суточных проростков длина и масса побега в опыте были выше, чем в контроле при ИД 11 и 29 МПа; длина корней во всех вариантах опыта оказалась больше, чем в контроле, причем после обработки ИД раньше начиналось образование боковых корней. В возрасте 12 сут прирост побегов и корней проростков в опыте замедлялся относительно контроля, а также снижалась их масса. Торможение роста могло быть следствием формирования примордиев в конусах нарастания. Длина побегов к концу периода вегетации растений гречихи при ИД 11 МПа соответствовала контролю, а при ИД 23 и 29 МПа -- превышала последний. Воздействие ИД на семена гречихи способствовало интенсивному делению апикальных меристем и закладке большого количества примордиев, что свидетельствует об активации формообразовательных процессов.

Число и масса плодов растений гречихи существенно возрастали под влиянием ИД, что обусловливало повышение продуктивности: при интенсивности ИД 11, 23 и 29 МПа -- соответственно на 14 %, в 3 и 2,4 раза (табл. 3).

3. Урожай растений гречихи под влиянием импульсного давления разной интенсивности

Эмпирическое распределение по частотам варьирования семенной продуктивности растений гречихи отличалось от нормального при уровне значимости 99,9 % (2 = = 25,54 при 7-классовых интервалах) (рис. 2а). Кривая эмпирического распределения была двувершинной, минимальное число плодов на растении составляло 6, максимальное -- 88 шт. Наличие двух вершин могло быть связано с биологическими особенностями растений гречихи.

Известно, что созревание плодов продолжается в течение длительного времени и происходит неодновременно (8). Часть созревших плодов осыпается до сбора урожая, особенно это явление неблагоприятно для среднепродуктивных растений. Большинство значений признака группировалось не около средней арифметической, а в области ветвей кривой распределения. При этом возникал сильный отрицательный эксцесс, который и приводил к двувершинности. Действительно, теоретическая кривая нормального распределения частот оказалась одновершинной, но пологой, что свидетельствует об отрицательном эксцессе (см. рис. 2а).

Кривая эмпирического распределения по частотам варьирования семенной продуктивности растений гречихи при ИД 11 МПа соответствовала нормальному распределению (2 = 7,96 при 10-классовых интервалах), причем отрицательный эксцесс увеличивался, а признаки двувершинности уменьшались (см. рис. 2б). При этом всхожесть семян не изменялась, но число низкопродуктивных растений (область первой вершины) незначительно уменьшалось относительно контроля. Следовательно, низкопродуктивные растения проявляли чувствительность к ИД, что благоприятно отражалось на их продуктивности. Увеличение урожая было связано с появлением высокопродуктивных растений (максимум -- 122 плода на одно растение), то есть ИД стимулировало увеличение продуктивности у растений гречихи. Аналогичные изменения отмечены при ИД 17 МПа: эмпирическое распределение частот соответствовало нормальному (2 = = 4,47 при 11-классовых интервалах), отрицательный эксцесс увеличивался относительно контроля и двувершинность «сглаживалась», что специфично для низкой интенсивности ИД.

Рис. 2 - Эмпирическое и нормальное распределение по частотам варьирования продуктивности растений гречихи по классам интервалов под влиянием импульсного давления различной интенсивности: а, б и в -- соответственно контроль, 11 и 23 МПа; 1 и 2 -- соответственно эмпирическое и нормальное распределение

При ИД 23 и 29 МПа наблюдались многовершинность кривой распределения частот и усиление отрицательного эксцесса, в связи с чем кривые были более пологими (см. рис. 2в). Следовательно, давление отбора действует на растения, продуктивность которых приближается к средним значениям. Кривая распределения при ИД 23 МПа соответствовала нормальной по критерию 2 = 18,93 при 14-классовых интервалах, а при 29 МПа -- отличалась от нормального распределения на уровне значимости ? 95,0 % (2 = 26,50 при 19-классовых интервалах), причем число низкопродуктивных плодов уменьшалось, что могло быть связано с выбраковкой при стрессе. Однако значительное влияние на повышение урожая оказывало появление высокопродуктивных растений (максимум -- 176 и 239 плодов на одно растение при ИД соответственно 23 и 29 МПа). При этом кривая смещалась в область более высоких значений продуктивности. Следовательно, эффект повышения продуктивности в значительной мере зависит от интенсивности закладки цветковых почек в конусах нарастания побегов и обеспечения их трофических потребностей.

Таким образом, в проростках гречихи разного возраста после обработки импульсным давлением наблюдается варьирование по содержанию фитогормонов, вызванное воздействием стрессора. В контрольном варианте отмечены колебания по содержанию гормонов, имеющие меньшую амплитуду, что обусловлено эффектами положительных и отрицательных обратных связей, обеспечивающих осуществление онтогенетических программ. Импульсное давление изменяет программу развития растений, оказывая влияние на разных уровнях организации последних. Нарушение гормонального равновесия повлекло за собой морфофизиологические изменения и повышение продуктивности растений. Следствием сдвига гормонального баланса являются раннее торможение роста побегов («ростовой покой»), ускорение развития, закладка большего числа как примордиев в конусах нарастания, так и боковых корней. Выявлена зависимость реакции растений на импульсное давление от интенсивности воздействия: при низкой амплитуде воздействия (11 МПа) репарационные процессы заканчиваются раньше, чем при высоких (23 и 29 МПа). Обработка семян гречихи импульсным давлением способствует повышению семенной продуктивности главным образом за счет увеличения числа и массы плодов.

Литература

1. Levitt J. Responses of plants to enviromental stresses. Chilling, freezing and high temperature stresses. N.Y., 1980.

2. Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка. М., 1984.

3. Атрощенко Э.С., Хрянин В.Н., Атрощенко Е.Э. и др. Способ предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур. Патент RU 2083073 С1 6А01 С 1/00 А01 G 7/04. Бюл. изобр. и откр., 1997, 19.

4. Нефедьева Е.Э., Хрянин В.Н. Особенности стрессовой реакции растений гречихи на ударно-волновое воздействие. ДАН, 1999, 2: 286-288.

5. Кулаева О.Н. Фитогормоны как регуляторы активности генетического аппарата и синтеза белка у растений. В сб.: Новые направления в физиологии растений. М., 1985: 62-83.

6. Шакирова Ф.М. Участие фитогормонов и лектина пшеницы в ответе растений на стрессовые воздействия. Автореф. докт. дис. СПб, 1999.

7. Ракитина Т.Я., Власов П.В., Жалилова Ф.Х. и др. Гормональная реакция Arabidopsis thaliana на УФ-Б стресс. Тез. докл. Всер. конф. фотобиологов. Пущино, 1996: 87-89.

8. Алексеева Е.С., Паушева З.П. Генетика, селекция и семеноводство гречихи. Киев, 1988.

9. Берестецкий В.А., Варшавская В.Б. Методические рекомендации по определению абсцизовой кислоты хроматографическими методами. Киев, 1988: 46-53.

10. Генералова В.Н. Методические рекомендации по определению ИУК методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Киев, 1988: 17-29.

11. Негрецкий В.А. Методические рекомендации по определению цитокининов. Киев, 1988: 31-40.

12. Нефедьева Е.Э., Хрянин В.Н., Гудков А.С. Определение содержания гиббереллина А3 в растениях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. С.-х. биол., 1998, 5: 77-79.

13. Шмидт В.М. Математические методы в ботанике. Л., 1984.

14. Doerffling K. Das Hormonsystem der Рflanzen. Stuttgard, N.Y., 1982.

Summary

Phytohormones content, growth and development of buckwheat plants under the influence of impulse pressure

E.E. Nefedieva, N.G. Mazei, A.A. Miroshnichenko, V.N. Khryanin

The authors investigated the regularity in changes of morphological attributes and hormonal balance in buckwheat seedlings at varied ages in connection with value of impulse pressure of air-blast. The seed productivity of buckwheat plants after stress action was estimated. Empirical and normal distribution on the frequencies of variations of seed productivity after impulse pressure action were analyzed. It was shown, that the acceleration of cell division, the consequent inhibition of growth and lowering of apical dominating, forming of larger numbers of primordia, increase of root acidification activity and enhance of plant productivity to value to 2-3 times were the results of changes in hormonal systems.

Размещено на Allbest.ru