Размещено на http://allbest.ru

5

Российский университет дружбы народов

Всероссийский государственный НИИ животноводства

Созревание и оплодотворение in vitro ооцитов крупного рогатого скота при действии биологически активных веществ

А.М. Ахмолдаева, Н.И. Сергеев, И.А. Порфирьев

Москва

Московская обл., п/о Дубровицы

Аннотация

Исследовали созревание и оплодотворение in vitro ооцитов коров при действии эстральной сыворотки и гонадотропных гормонов, а также развитие зародышей после экстракорпорального оплодотворения.

Оценивали возможность использования гепарина, различных сред для капацитации, время соинкубирования с ооцитами для повышения оплодотворяющей способности и выживаемости спермиев в культуральных средах.

Введение

Современные экономические условия обусловливают необходимость повышения интенсивности селекционной работы по совершенствованию племенных и продуктивных качеств животных, создания современных высокопродуктивных пород, линий и гибридов скота, отвечающих требованиям постоянно меняющейся конъюнктуры рынка (1). Однако низкий коэффициент размножения крупного рогатого скота и продолжительный интервал поколений существенно ограничивают возможности селекции. Эффективным биотехнологическим методом воспроизводства животных является трансплантация эмбрионов (2). При этом для предотвращения преждевременной выбраковки высокопродуктивных животных-вирусоносителей используют эмбриопересадки (3).

Применение новых биотехнологических методов сдерживается высокими материальными затратами получения эмбрионов на ранних стадиях развития. Одним из способов снижения стоимости эмбрионов является выделение при убое высокоценных коров яйцеклеток и оплодотворение их in vitro. При этом трансплантация эмбрионов по системе множественной овуляции и эмбриотрансплантации (МОЭТ) позволяет в 10 раз эффективнее использовать репродуктивный потенциал животных по сравнению с методом искусственного осеменения и в ближайшем будущем будет иметь важное значение в развитии скотоводства (4, 5).

Низкая эффективность получения эмбрионов вне организма (10 % живого потомства) обусловлена прежде всего неполноценным созреванием ооцитов in vitro. Для успешного культивирования ооцитов необходимо смоделировать условия, близкие к естественным, то есть обеспечить оптимальный состав культуральных сред, температурный и газовый режимы, выбрать благоприятные для извлечения яйцеклеток время года, возраст и генотип животного.

Целью нашей работы было совершенствование метода культивирования и оплодотворения вне организма ооцитов крупного рогатого скота. В связи с этим были поставлены следующие задачи: определить возможность созревания и оплодотворения ооцитов in vitro в зависимости от сезона года при использовании эстральной сыворотки и гонадотропных гормонов; выявить минимальную концентрацию биологически активных веществ, необходимых для созревания ооцитов; оценить оплодотворяющую способность и выживаемость спермиев в культуральных средах при действии гепарина; выбрать среды для капацитации (процесс созревания спермиев перед оплодотворением), время соинкубирования с ооцитами; проанализировать развитие зародышей после экстракорпорального оплодотворения ооцитов in vitro при взаимодействии с соматическими клетками, фолликулами и стенками последних.

Методика

Эксперименты проводили на аспирированных из яичников яйцеклетках крупного рогатого скота. При этом яичники доставляли в течение 1,5-2 ч после убоя в термосе с физиологическим раствором (t = 37 ^оС) из Подольского экспериментального мясокомбината. Отбраковывали яичники с геморрагическим желтым телом, фолликулярной кистой, жировой дистрофией, а также от стельных животных.

Для получения ооцитов яичники несколько раз промывали в физиологическом растворе, затем с помощью шприца объемом 5 мл и иглы № 18 аспирировали фолликулы диаметром 2-8 мм, причем фолликулярную жидкость сливали для отстаивания в пробирку для центрифугирования объемом 10 мл. Через 10-15 мин пастеровской пипеткой седимент переносили в чашку Петри (диаметр 35 мм) для отбора неповрежденных ооцитов под стереомикроскопом (X100).

Перед морфологической оценкой ооциты 3 раза промывали в модифицированной среде Паркера (МРМ), содержащей 20 % фетальной сыворотки. Критерием селекционного отбора ооцитов служило морфологическое состояние ооцит-кумулюсного комплекса, которое оценивали как хорошее, среднее или плохое. В эксперименте использовали округлые по форме ооциты с темной равномерно гранулированной ооплазмой, опалесцирующей оболочкой, плотным компактным кумулюсом. Период от взятия яичников до постановки ооцитов на созревание составлял 2-2,5 ч.

Для созревания ооцитов использовали среду МРМ, в которую добавляли 20 % фетальной или эстральной сыворотки (инактивировали в течение 30 мин при 56 ^оС), фолликулостимулирующий (ФСГ) и лютеинизирующий (ЛГ) гормоны соответственно в дозе 10 и 5 мкг/мл, или модифицированную среду Менезо (МММ) с аналогичными добавками (рН 7,3-7,4). Культуральные чашки со средой созревания (400 мкл), поверхность которой заливали минеральным маслом (400 мкл), на 1,5-2 ч помещали в СО₂-инкубатор для эквилибрации (t = 39 ^оС, содержание СО₂ -- 5 %, влажность воздуха -- 90-92 %). В подготовленную среду пастеровской пипеткой переносили 20-30 ооцитов, которые выдерживали в СО₂-инкубаторе в течение 24 ч. Приготовление сред, а также все манипуляции, связанные с получением ооцитов и их постановкой на созревание, проводили в стерильных условиях.

Репродуктивные органы для получения клеток (яичники, яйцеводы, рога матки) доставляли в лабораторию в среде ДМЕМ или физиологическом растворе с добавлением антибиотиков и антимикотиков (t = 4 ^оС).

Для получения клеток гранулезы фолликулы диаметром 3-8 мм препарировали глазным скальпелем под стереомикроскопом в ламинарном боксе. С внутренней части препарированного до теки фолликула снимали слой клеток и помещали в чашку Петри. Полученные клетки гранулезы трипсинизировали (среда ЭДТА + трипсин) и центрифугировали при 485 g в течение 10 мин. Посев клеточного седимента проводили в культуральных чашках на среду ДМЕМ (500 мкл), к которой добавляли 20 % фетальной сыворотки. Пассаж помещали в СО₂-инкубатор на 3-е сут. При получении монослоя клетки гранулезы обрабатывали митомицином С в концентрации 10 мкг/мл. оплодотворение ооцит корова гепарин

При сокультивировании ооцитов и монослоя клеток гранулезы культуральную среду предварительно (максимально за 3-е сут) заменяли на среду МРМ + 20 % инактивированной эстральной сыворотки коровы, для получения которой от нескольких коров или телок в пик охоты отбирали пробы крови в объеме 30-50 мл, которые выдерживали в холодильнике в течение 3-4 ч, центрифугировали 20 мин при 485 g, а затем осторожно отделяли сыворотку, которую расфасовывали по 1-1,5 мл и замораживали. Перед употреблением сыворотку оттаивали и инактивировали при 56 ^оС в течение 20-30 мин.

Для получения монослоя кумулюсных клеток использовали оставшиеся после оплодотворения ооцит-кумулюсные комплексы. После извлечения пастеровской пипеткой и перенесения оплодотворенных ооцитов в другую культуральную чашку среду заменяли и оставшиеся кумулюсные клетки культивировали в течение 7 сут до получения монослоя.

Монослой эпителиальных клеток выделяли из препарированного яйцевода, который промывали раствором PBS, не содержащим ионов Са²⁺ и Мg²⁺ (20 мл), а затем один конец зажимали артериальной клеммой, а через другой пропускали среду ЭДТА, содержащую трипсин, в количестве 2-3 мл и предынкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем клемму снимали, яйцевод промывали в 10 мл среды ДМЕМ + 20 % фетальной сыворотки теленка, раствор центрифугировали в течение 10 мин при 485 g. Осадок ресуспензировали в 5 мл ДМЕМ с добавлением 20 % фетальной сыворотки, проводили посев клеток, которые культивировали в СО₂-инкубаторе. В зависимости от пролиферативной активности клеток среду культивирования меняли через 48 ч. При достижении монослоя клетки обрабатывали митомицином С и помещали в среду МРМ с 20 % эстральной сыворотки.

Для оплодотворения in vitro использовали глубокозамороженную сперму, полученную на Центральной станции искусственного осеменения от быков класса элита-рекорд голштино-фризской и немецкой черно-пестрой пород. Подготовку спермы к оплодотворению осуществляли по методике First с соавт. (6). При этом в каждом варианте опыта три гранулы спермы быка оттаивали на водяной бане в течение 1 мин при 37 ^оС. Пробирки объемом 1,8 мл, заполненные средой Sperm-Talp (1 мл), в которую вносили по 200-220 мкл спермоконцентрата, помещали в инкубатор на 1 ч при температуре 39 ^оС, после чего подвижные спермии поднимались наверх. Затем из каждой пробирки по 750-800 мкл среды осторожно сливали и центрифугировали в течение 10 мин при 20 ^оС, осадок ресуспензировали в среде Sperm-Talp и еще раз центрифугировали при тех же условиях. Отстой удаляли, оставляя до 200 мкл суспензии, в которую добавляли гепарин и предынкубировали 15 мин в СО₂-инкубаторе.

Оплодотворение ооцитов in vitro проводили в СО₂-инкубаторе в культуральных чашках. При этом поверх среды Fert-Talp (400 мкл) наносили минеральное масло (400 мкл), которое предварительно эквилибрировали со средой МРМ для стабилизации концентрации веществ. После эквилибрации в течение 1-2 ч добавляли пенициллин, гипотаурин, эпинефрин и гепарин соответственно в дозах 20, 10, 1 и 10 мкг/мл. В одну каплю среды Fert-Talp помещали по 20-25 ооцитов и в зависимости от активности спермиев добавляли 6-12 мкл спермоконцентрата. После 18-20 ч совместного культивирования спермиев и ооцитов последние переносили в среду МРМ или МММ (с эстральной сывороткой), промывали несколько раз и пастеровской пипеткой удаляли часть кумулюсных клеток, окружающих ооцит. Оплодотворенные ооциты культивировали в среде МРМ или МММ (400 мкл) в течение 7-8 сут в СО₂-инкубаторе.

Для сокультивирования с соматическими клетками репродуктивных органов на подготовленный монослой переносили по 20-35 оплодотворенных ооцитов (на одну ячейку) и культивировали при тех же условиях. Для цитогенетического анализа использовали ранние зародыши (от двухклеточных и старше), которые выдерживали в течение 2 мин в гипотоническом растворе (1 % цитрат натрия в дистиллированной воде), затем фиксировали в смеси метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), окрашивали по Романовскому-Гимза и отмывали от красителя дистиллированной водой. Оценку оплодотворения, критерием которого служило наличие двух пронуклеусов, двух полярных телец или хвоста спермия в перивителлиновом пространстве, проводили под микроскопом (X400).

Результаты

Для успешного культивирования ооцитов in vitro наиболее важным является качество исходного материала, поэтому при отборе яичников мы учитывали состояние здоровья и возраст коров и телок, а также стадию эстрального цикла. Так, Goto с соавт. получали на один яичник от 5 до 10 ооцитов, которые были пригодны для дальнейшего культивирования in vitro (7). В наших опытах было получено в среднем 5,3 ооцита, аспирированных с одного яичника, и только 3,6 из них были оценены как «хорошие» по морфологическому состоянию.

Наиболее благоприятными периодами для получения морфологически нормальных эмбрионов, создания эмбриобанка и проведения эмбриопересадок является осень и зима (8). В наших экспериментах наименьшее количество созревших и оплодотворившихся ооцитов также приходилось на весенне-летние месяцы (10-12 %); в осенне-зимний период этот показатель составлял 37-41 % (табл. 1). Низкий выход ооцитов, вероятно, был обусловлен нарушением метаболических процессов в организме животных вследствие гиповитаминоза и сезонного гормонального дисбаланса весной и летом. Поэтому работы по культивированию ооцитов нужно проводить с учетом времени года.

1. Оценка созревания и оплодотворения ооцитов коров при культивировании in vitro в зависимости от сезона года

В связи с этим возникает необходимость в совершенствовании состава культуральных сред за счет введения различных биологически активных веществ в зависимости от времени года. По мнению First с соавт., для полного развития ооцитов и последующего оплодотворения питательная среда должна содержать сыворотку крови (6). При культивировании ооцитов коров обычно используют бычий сывороточный альбумин (БСА), фетальную сыворотку теленка и эстральную сыворотку коров, находящихся в охоте. По сравнению с БСА фетальная сыворотка в концентрации 2-20 % способствует лучшему развитию кумулюсных клеток, что в свою очередь повышает степень оплодотворения и жизнеспособность ооцитов. Однако более интенсивно эти процессы протекают при добавлении эстральной сыворотки.

2. Оценка созревания ооцитов коров при культивировании in vitro в зависимости от добавления в среду различных сывороток и гонадотропных гормонов

Созревание ооцитов проходило наиболее эффективно при добавлении к среде МРМ 20 % эстральной сыворотки, ФСГ (10 мкг/мл) и ЛГ (5 мкг/мл) (табл. 2).

3. Оценка оплодотворения ооцитов коров in vitro в зависимости от добавления в среду культивирования различных сывороток и гонадотропных гормонов

Для оплодотворения ооцитов in vitro мы использовали среду ТСМ-199 с добавлением 20 % фетальной или эстральной сыворотки, ФСГ и ЛГ (соответственно в дозах 10 и 5 мкг/мл) (табл. 3). Оплодотворенными считали ооциты, у которых сформировалось второе полярное тельце и два или более бластомеров. Использование эстральной сыворотки оказалось более эффективным, чем фетальной, что объясняется присутствием в первой биологически активных веществ (стероидные и гонадотропные гормоны, аминокислоты), оказывающих благоприятное влияние на оплодотворение.

Мы оценивали созревание ооцитов в среде с пониженной концентрацией эстральной сыворотки (5 %) при добавлении ФСГ (в дозах 5 и 20 мкг/мл) и глутамина (в дозе 150 мкг/мл) (табл. 4). При этом количество созревших ооцитов составляло 55-66 %. Этот показатель повышался на 4,7 % при добавлении ФСГ.

4. Оценка созревания ооцитов коров при культивировании in vitro в зависимости от стадии развития, концентрации эстральной сыворотки и гонадотропных гормонов в среде

Оплодотворяемость ооцитов при добавлении к среде 10 % эстральной сыворотки составляла 71,9 % (табл. 5). При уменьшении концентрации сыворотки до 5 % выход оплодотворенных ооцитов снижался до 30,8 %, а при добавлении 20 мкл/мл ФСГ -- повышался на 27,3 %. ФСГ и глутамин не оказывали влияния на этот показатель, однако выход зародышей увеличивался на 14,8 %.

5. Оценка оплодотворяемости ооцитов крупного рогатого скота после созревания в среде культивирования в зависимости от концентрации эстральной сыворотки крови и гонадотропных гормонов

Жизнеспособность ооцитов и ранних эмбрионов в значительной мере зависит от правильности подбора питательной среды. Для культивирования ооцитов коров можно использовать среды ТСМ-199, МРМ, МММ, Игла, Хэма F-10, F-12, пригодные для нормального завершения ядерного и цитоплазматического развития клеток вне фолликулов. При этом осмотическое давление и рН среды должны соответствовать физиоогической норме. В наших экспериментах для сравнения использовали среду ТСМ-199, модифицированные среды МРМ и МММ с буферными и энергетическими добавками, в том числе 20 % эстральной сыворотки; выход созревших ооцитов составлял соответственно 53,8; 61,9 и 63,6 %, то есть различия были несущественными. Однако среды ТСМ-199 и МММ являются более универсальными и в отличие от МРМ могут быть использованы также при капацитации спермиев.

Яйцеклетки млекопитающих, достигшие метафазы II, считаются готовыми к оплодотворению, что касается спермиев, то они должны быть капацитированы (пройти физико-химические преобразования), в результате чего у них появляется способность проникать в яйцеклетку. Капацитацию проводили в среде Sperm-Talp, в которую добавляли Na-пируват, БСА и гепарин.

Наибольшая оплодотворяющая способность спермиев отмечена при дозе гепарина 20-50 мкг/мл и времени капацитации 10-25 мин, а наибольшая доля дробящихся ооцитов (42,5 %) -- соответственно при 50 мкг/мл и 25 мин (табл. 6). При более высоких дозах гепарина выход оплодотворенных ооцитов снижался вследствие полиспермии и истощения энергетического запаса спермиев.

6. Оценка оплодотворяющей способности спермиев быков при культивировании ооцитов in vitro в зависимости от дозы гепарина и времени капацитации

Часто при культивировании предымплантационных эмбрионов многие исследователи сталкиваются с блокированием клеточного деления, когда развитие эмбриона останавливается на стадии 8-16 клеток, что связано по времени с качественными изменениями в белковом синтезе и появлением активного нуклеуса. Для того чтобы преодолеть этот барьер, используют различные методы, в том числе и промежуточных реципиентов, например кроликов (2). При этом эмбрион помещают в яйцеводы реципиентов и извлекают на более поздних стадиях развития, то есть после прохождения блокирования клеточного деления. В настоящее время применяют совместное культивирование соматических клеток и предымплантационных эмбрионов, что повышает степень дробления и развития последних.

Мы переносили эмбрионы на стадии шести-восьми бластомеров на монослой соматических клеток кумулюса, эпителиальных клеток яйцевода и клеток гранулезы с целью оценки возможности преодоления блокирования клеточного деления (табл. 7). Контролем служили эмбрионы на среде, не содержащей соматических клеток. Успешное преодоление блокирования деления на стадии 8-16 клеток достигалось при культивировании эмбрионов на монослое гранулезных клеток (на 13 % выше контроля). При сокультивировании эмбрионов с кумулюсными и эпителиальными клетками яйцевода различия оказались незначительными.

При введении в среду созревания клеток гранулезы (500 тыс/мл) количество созревших ооцитов составляло 80,0 % (на 13,3 % больше, чем в контроле). При этом в опыте было выявлено 20,8 % оплодотворенных ооцитов, в то время как в контроле таковые отсутствовали.

7. Оценка развития оплодотворенных ооцитов коров при культивировании в средах, содержащих монослой соматических клеток

Блокирование развития эмбрионов совпадает по времени с потребностью в новых элементах питания, поэтому усилия исследователей направлены на поиск различных природных и синтетических добавок в культуральные среды.

Показано, что культивирование ооцитов в среде, кондиционированной клетками гранулезы, создает оптимальные условия для созревания: высокий выход ооцитов (72,7 %), небольшое количество яйцеклеток с дегенерировавшими хромосомами (6 %) (9).

В нашем эксперименте использование ооцит-кумулюсных клеток обеспечивало нормальное развитие зародышей в том случае, когда для культивирования использовали аутогенную среду, то есть оплодотворенные ооциты помещали в ту среду, в которой они созревали (табл. 8).

Несмотря на высокую степень оплодотворяемости в контроле, дробление зародышей наблюдалось лишь в кондиционных средах (14,5 и 19,2 % оплодотворенных ооцитов), причем 75 и 80 % зародышей от числа дробящихся достигали стадии ранней морулы. В гетерогенной кондиционной среде оплодотворенные зародыши развивались только до стадии ранней морулы, а в аутогенной среде -- до бластоцисты (20 %).

8. Оценка оплодотворяемости и развития ооцитов коров при культивировании в кондиционных средах

Таким образом, при культивировании in vitro ооцитов крупного рогатого скота необходимо учитывать сезон года, так как он оказывает существенное влияние на выход созревших ооцитов. Наиболее эффективной для созревания и оплодотворения ооцитов является эстральная сыворотка крови, полученная от коров в раннем эструсе.

При снижении в среде концентрации эстральной сыворотки до 5 % и добавлении 20 мкг/мл фолликулостимулирующего гормона можно получать in vitro до 59,7 и 58,1 % соответственно созревших и оплодотворенных ооцитов. Универсальные среды ТСМ-199 и модифицированную Менеза можно использовать при капацитации спермиев в течение 10-25 мин с гепарином (оптимальная доза 10-50 мкг/мл), в результате чего достигается высокая степень оплодотворяемости. Использование однослойных культур клеток репродуктивных органов позволяет преодолевать блокирование развития предымплантационных эмбрионов на стадии 8-16 бластомеров.

Литература

Хилькевич С.Н, Тяпугин Е.А. Экономические аспекты трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве. Молочное и мясное скотоводство, 1992, 5-6: 16-17.

Эрнст Л.К., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. М., 1989.

Решетников а Н.М. Трансплантация эмбрионов как аналитический метод воспроизводства стада. В сб.: Биология воспроизведения и биотехнологические методы разведения. М., 1992: 4-7.

Решетникова Н.М., Мороз Т.А., Малиновский А.М. и др. Проблема интенсификации воспроизводства в племенном скотоводстве. В сб.: Современные аспекты селекции, биотехнологии, информации в племенном животноводстве. М., 1997: 121-130.

Lonergan P., Carolan C., Mermillod P. Development of bovine embryos in vitro following oocyte maturation under defined conditions Reproduction. Nutrition Development, 1994, 34, 4: 329-339.

First N.Z., Parrish J.J. In vitro fertilization of ruminants. J. Reprod. Fert. Suppl. 1987, 34: 151-165.

Goto K., Kajihara Y. Pregnancies after coculture of cumulus cells with bovine embryos derived from in vitro fertilization of in vitro matured follicular oocytes. J. Reprod. Fertil. 1988, 83: 753-758.

Гавриков А.М., Кинзеев В.Н. Влияние сезона года на результаты трансплантации эмбриона. Молочное и мясное скотоводство, 1993, 5: 19-21.

Позднякова Т.Э. Мейотические преобразования хромосом при культивировании ооцитов коров с клетками гранулезы. Автореф. канд. дис. СПб--Пушкин, 1994.

Summary

Maturing and fertilization in vitro of oocytes in cattle under the influence of biological active substances

A.M. Akhmoldaeva, N.I. Sergeev, I.A. Porfir'ev

The authors investigated the maturing and fertilization in vitro of oocytes under the influence of different serums and gonadotropic hormone, and also the embryos development after extracorporal fertilization. The high efficiency of estrous serum was revealed as compared with fetal and the minimum of its concentration was determined as 5 % with addition of 20 mkg/ml of follicle-stimulating hormone. During cultivation of oocytes in vitro it is essential to take into account the year's season. For increase of sperm capacity and survival the authors proposed the heparin addition of 50 mkg/ml to cultural media. It was shown, that blocking of cell division in embryos on the stage of 8-16 blastomeres may be overcome with the use of monolayer of granulose cells.

Размещено на Allbest.ru