Теоретические и практические аспекты применения методов in vitro для интенсификации селекционного процесса у растений винограда

Размещено на http://www.allbest.ru/

Теоретические и практические аспекты применения методов IN VITRO для интенсификации селекционного процесса у РАСТЕНИЙ винограда (обзор)

В.А. Зленко, И.В. Котиков, Л.П. Трошин

Аннотация

Рассматриваются различные аспекты использования клеточных суспензий для генетической инженерии и селекции растений винограда in vitro. Обсуждается возможность создания селективных систем для отбора генотипов винограда с хозяйственно ценными признаками на уровне клеток, каллусных тканей, соматических и зиготических эмбриоидов и растений-регенерантов.

THEORETICAL AND PRACTICAL ASPECTS OF USING N VITRO METHODS TO INTENSIFY THE PROCESS OF GRAPE GENOTYPE SELECTION (review)

V.A. Zlenko, I.V. Kotikov, L.P. Troshin

Summary

The use of grape cell suspensions with a view of gene engineering and selection at the cell level is discussed. The possibility of creating systems for selection the grape genotypes resistant to biotic and abiotic factors of the environmental conditions with economical traits at the levels of cells, calluses, somatic and zygotic embryos and regenerated plants is demonstrated.

Селекционный процесс у растений Vitis vinifera L. (многолетний вид), вступающих в плодоношение на 3-5-й год онтогенетического развития, является очень длительным, что обусловлено высоким уровнем гетерозиготности, полигенным наследованием большинства хозяйственно ценных признаков, низкой частотой мейотического кроссинговера, доминированием генов дикого типа и сравнительно небольшой выборкой изучаемых популяций. В большинстве случаев в задачу селекционера входит создание форм, сочетающих небольшое количество генов устойчивости к биотическим и абиотическим факторам внешней среды и генов культурного сорта-реципиента. При половой гибридизации получают генотипы, характеризующиеся средней или повышенной устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам внешней среды, но неудовлетворительным качеством плодов (доминирует дикий тип). Привнести отдельные гены, контролирующие признаки устойчивости, сохранив полностью генотип культурного сорта, можно лишь на основе методов генной инженерии.

В настоящее время осуществлено клонирование и молекулярный анализ структурных генов, кодирующих ферменты для синтеза флавоноидов и стилбенов, принимающих участие в формировании признаков устойчивости к грибным и бактериальным болезням у растений винограда (1). Выделен молекулярный маркер устойчивости сеянцев этой культуры к Plasmopara viticola, который использовали для идентификации гена устойчивости к патогену (2). У Vitis rotundifolia Michx. идентифицирован ген устойчивости к Plasmopara viticola (3), который может быть выделен и перенесен в сорта Vitis vinifera L. с помощью различных векторов по достаточно хорошо разработанным методикам (4). Показано, что суспензионную культуру клеток винограда in vitro можно эффективно использовать для анализа работы промоторов генов (5).

У винограда выполнены исследования по генной инженерии методического плана. Так, эмбриогенные клеточные суспензии успешно трансформированы генами GUS и Npt-II (селективные маркеры) посредством «микробомбардирования» (biolistic-mediated) и получены растения-регенеранты, устойчивые к антибиотику канамицину (6, 7). Культуру соматических эмбриоидов in vitro использовали для получения трансгенных растений на основе интеграции Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens, содержащей селективные маркеры, в клетки эмбриогенного каллуса и соматических эмбриоидов с последующим формированием вторичных эмбриоидов (8, 9). Полисахарид хитин содержится в клеточных оболочках большинства грибов. Ген, кодирующий синтез хитиназы, разлагающей хитин, был встроен в Ti-плазмиду Agrobacterium tumefaciens и перенесен в клетки соматических эмбриоидов сорта Neo Muscut (V. vinifera L.). Затем из вторичных эмбриоидов, образовавшихся из трансформированных клеток, были получены растения, устойчивые к патогенным грибам Plasmopara viticola и Elsinoe ampelina (10).

С целью предотвращения заражения вирусами получены трансгенные растения с интегрированными генами белка вирусов растений винограда (11-13). Обычно вместе с генами, контролирующими хозяйственно ценные признаки, переносят и гены устойчивости к антибиотикам канамицину или гигромицину в качестве селективных маркеров для отбора трансформированных генотипов винограда на клеточном уровне, вектором служит Ti-плазмида Agrobacterium tumefaciens или применяют «микробомбардирование» (4, 14).

Селекция на клеточном уровне in vitro. Клоновой селекции в полевых условиях можно противопоставить отбор устойчивых клеток в суспензионной культуре in vitro. Показано, что если проводить исследования в течение 1 года при объеме суспензионной культуры 3 л и использовании в качестве мутагенного фактора -облучения, то клеточная селекция по одному локусу гена будет приблизительно в 60 раз более эффективной, чем отбор среди 25 млрд растений в поле в течение 7 тыс. лет (15, 16).

На основе методов клеточной селекции получены растения-регенеранты сорта Шардоне (V. vinifera L.), обладающие повышенной хитиназной активностью, устойчивостью к E. ampelina (17). Разработаны методики селекции клеток винограда in vitro на устойчивость к пониженной температуре и щелочной реакции среды (высокая концентрация извести в почве) (18, 19).

Для эффективного практического применения методов генной инженерии и селекции на клеточном уровне необходимо разработать методы получения растений из устойчивых клеток суспензионных культур посредством соматического эмбриогенеза и способы диагностики селектируемых и других хозяйственно ценных признаков у растений-регенерантов in vitro.

Регенерация растений винограда из клеток суспензионной культуры. Для образования проэмбриогенного каллуса винограда применяли твердую среду Nitsch-Nitsch (NN) с добавлением регуляторов роста -- 2,4-дихлорфе-ноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и 6-бензиладенина (6-БА) (20). Затем каллус субкультивировали в жидкой среде и индуцировали образование из проэмбриогенных клеток суспензионной культуры соматических эмбриоидов (21-23).

Для оценки зависимости соматического эмбриогенеза от сортовых особенностей мы исследовали 28 генотипов винограда различных эколого-географических групп (24). В качестве исходных эксплантов использовали черешки листьев, взятые у растений, выросших in vitro. Для развития проэмбриогенной каллусной ткани среда NN была более эффективной по сравнению со средой Мурасиге-Скуга (МС) (25). В зависимости от генотипа для развития проэмбриогенной каллусной ткани требовались различные соотношения 2,4-Д и 6-БА в твердой среде NN (24). Ранее было показано, что 6-БА стимулирует развитие эмбриоидов из проэмбриогенных клеток как в жидкой, так и на твердой среде (23, 26, 27). Для развития глобулярных эмбриоидов проэмбриогенный каллус субкультивировали в жидкой среде NN с добавлением 0,5 мг/л 6-БА. При этом в 10 мл среды развивалось несколько тысяч глобулярных эмбриоидов размером 0,05-0,2 мм. Нам удалось индуцировать развитие глобулярных эмбриоидов у девяти генотипов винограда: Кобер 5ББ, 101-14, Зигфридребе, Бианка, Подарок Магарача, Первенец Магарача, Интервитис Магарача, Цитронный Магарача и Магарач 100-74-1-5 (24). У сортов Интервитис Магарача и Подарок Магарача в дальнейшем в этой же среде развивались и сердцевидные эмбриоиды; для массового образования последних у сорта Бианка требовалась еще одна инокуляция суспензии глобулярных эмбриоидов в такую же жидкую среду.

В дальнейшей работе суспензию глобулярных и сердцевидных эмбриоидов сортов Бианка, Интервитис Магарача и Подарок Магарача инокулировали в жидкую среду НТЕ, в состав которой входили следующие ингредиенты: NH4NO3, KNO3, MgSO47H2O, КН2РО4, СаСl2, мезоинозит, пиридоксин, тиамин, никотиновая кислота -- соответственно 308, 922, 597, 82, 331, 20, 5, 5, 0,5 мг/л, 10 г/л сахарозы, а также Fe-хелат и микроэлементы МС с дополнительным добавлением 0,1 мг/л -индолилуксусной кислоты (ИУК) (28). После 20 сут культивирования образовывались торпедовидные эмбриоиды длиной 2-3 мм, для увеличения количества которых иногда требовалась повторная инокуляция суспензии глобулярных, сердцевидных и торпедовидных эмбриоидов в такую же жидкую среду (24). ИУК стимулирует образование торпедовидных эмбриоидов винограда в жидкой и на твердой среде (23, 29).

Из соматических эмбриоидов винограда удалось получить побеги на средах, содержащих цитокинины -- 2-изопентениладенин или 6-БА (22-24, 26-28, 30). По данным наших исследований, из 48 % торпедовидных эмбриоидов сорта Подарок Магарача образовывались побеги после 50 сут культивирования на твердой модифицированной среде МС (МlМС), содержащей мезоинозит, пиридоксин, тиамин, никотиновую и парааминобензойную кислоты, 6-БА (соответственно 100, 5, 5, 0,5, 5, 0,5 мг/л), сахарозу и агар-агар (соответственно 30 и 7 г/л), а также минеральные элементы МС. На этой среде хорошо развивались побеги из торпедовидных эмбриоидов сорта Интервитис Магарача, но очень плохо из таковых сорта Бианка (24). Стимулирование развития проростков с гипокотилями и семядолями зеленой окраски в среде НТЕ посредством добавления 0,5 мг/л гибберелловой кислоты (ГА3) привело к тому, что после пересадки этих проростков на твердую среду М2МС (отличается от среды М1МС концентрациями тиамина и никотиновой кислоты -- соответственно 0,5 и 5 мг/л) не только ускорялось развитие побегов, но и увеличивалась их доля у сортов Бианка, Интервитис Магарача и Подарок Магарача (83-88 %) (28).

По данным Krul с соавт., на среде, не содержащей гормонов, происходило размножение торпедовидных эмбриоидов. Для регенерации растений торпедовидные эмбриоиды размером 1-2 мм культивировали 7 сут на среде с 0,5 мг/л 6-БА, а затем, когда семядоли приобретали зеленую окраску, их переносили на безгормональную среду (31). Мы использовали жидкую среду, содержащую 0,5 мг/л 6-БА, для развития глобулярных и сердцевидных эмбриоидов, из которых после инокуляции в среду с 0,1 мг/л ИУК формировались торпедовидные эмбриоиды (23, 24). Эти эмбриоиды при культивировании в жидкой среде с 0,5 мг/л ГА3 давали начало проросткам с гипокотилями и семядолями зеленой окраски, из которых при высадке на твердую среду с 0,5 мг/л 6-БА развивались побеги (23, 24, 28). Далее мы разрезали побеги на одноглазковые черенки с листом, которые высаживали на среду для получения растений. При необходимости растения размножали in vitro или пересаживали для адаптации к условиям in vivo по методикам Зленко с соавт. (32, 33).

Предлагаемую нами методику регенерации растений винограда посредством соматического эмбриогенеза в жидкой среде из клеток суспензионных культур можно применять для получения новых генотипов за счет сомаклональной изменчивости, генных и геномных мутаций под воздействием мутагенов (селекция на клеточном уровне), а также для регенерации растений из трансгенных проэмбриогенных клеток со встроенными в них генами, детерминирующими хозяйственно ценные признаки.

Выращивание сеянцев винограда из трудно прорастающих семян и отбор устойчивых генотипов на уровне зародышей. По-прежнему является актуальным создание бессемянных сортов винограда с применением культуры in ovule (34). Для выведения бессемянных, а также столовых сортов винограда с мелкими и мягкими семенами растения выращивают из семян с недоразвитым зародышем и/или эндоспермом. Предложенный нами ранее способ выращивания растений винограда из труднопрорастающих семян позволяет снизить затраты труда по сравнению с обычной методикой вычленения и культивирования изолированных зародышей, а также увеличить приживаемость последних (35). Способ заключается в следующем: семена разрезают поперек и части с зародышами высаживают на жидкую питательную среду in vitro. Если, например, при селекции на бессемянность образуются недоразвитые зародыши (глобулярные, сердцевидные или торпедовидные), то такие части семян с зародышами высаживают в жидкие среды с регуляторами роста, способствующими дальнейшему развитию. В случае высадки частей семян с зародышами на ранней стадии развития последовательно меняют жидкие среды, что способствует дальнейшему развитию зародышей, и только развившиеся проростки длиной около 1 см с семядолями зеленой окраски и гипокотилями по отдельности извлекают пинцетом и высаживают на твердую среду с агаром и добавлением 0,5 мг/л 6-БА для индукции развития побегов. Введение в питательную среду селективных факторов по признаку, например, устойчивости к засолению почвы дает возможность увеличить число изучаемых сеянцев, так как на селекционные участки в поле, имеющие ограниченные площади, будут высаживаться сеянцы, уже отобранные на уровне культивируемых in vitro зиготических зародышей, проростков и растений (19).

Диагностика хозяйственно ценных признаков на уровне клеток и тканей (каллус), а также у сеянцев и растений - регенерантов in vitro. Hoos с соавт. использовали суспензионные культуры единичных клеток растений винограда с убитым мицелием Botrytis cinerea для диагностики устойчивости различных генотипов к грибам этого вида и оценки защитной реакции клеток (пероксидазная активность, синтез виниферина и резвератрола) (36). Диагностику устойчивости к токсинам Botrytis cinerea также можно проводить на уровне растений, культивируемых in vitro (37).

В каллусных тканях устойчивых генотипов винограда к Plasmopara viticola содержится больше производных галлокатехина, чем в таковых неустойчивых генотипов (r = 92,2 %). Производные галлокатехина индуцируют синтез флавоноидов и суберина в клеточных стенках и играют главную роль в устойчивости каллусов (38). Инокуляцию листьев растений in vitro спорангиями P. viticola можно использовать для определения устойчивости генотипов винограда к этому виду грибов (39).

Мякоть ягод винограда на стадии физиологической зрелости состоит из паренхиматических клеток с большими вакуолями, где накапливаются углеводы, антоцианы и ароматические вещества (40). В культуре ткани при определенном составе среды можно вызвать образование каллусной ткани паренхиматического типа (41). Антоцианопластов содержится больше в цитоплазме, чем в вакуолях клеток суспензионных культур винограда (42). Каллусы, образующиеся in vitro из эксплантов листьев и черешков сортов, формирующих ягоды с кожицей и соком белой окраски, имели белую окраску; окрашенную кожицу и не окрашенный сок -- красную окраску (в условиях освещения); окрашенные кожицу и сок -- красную окраску (как в темноте, так и на свету) (43). О синтезе красящих веществ в каллусной ткани лозы винограда сообщали Изворска с соавт. и Haydu (44, 45). Выявленная корреляционная зависимость между содержанием антоцианов (моногликозидов и дигликозида мальвидина) в кожице ягод и каллусе, развившемся из эксплантов междоузлий, листьев и черешков различных сортов винограда, позволяет селекционеру проводить раннюю диагностику этих признаков (46).

Одним из направлений селекционной работы в плане повышения засухоустойчивости, адаптивного потенциала и продуктивности является создание сортов, характеризующихся интенсивным развитием корневой системы. Выявлены контрастные различия по способности образовывать корни из каллусной ткани, развившейся из эксплантов листьев и черешков на среде Шенка-Хильдебрандта (47) с добавлением 1 мг/л -нафтил-уксусной кислоты (НУК) и 0,2 мг/л 6-БА, между сортами с сильной и слабой корневой системой. Разработан способ диагностики генетической специфичности интенсивности развития корневой системы у сеянцев и сортов винограда (48, 49). По способности различных генотипов винограда образовывать каллусную ткань и корни in vitro на среде с добавлением NaCl (3 г/л) или сахарозы (100 г/л) определяют генетически детерминированные признаки устойчивости к засолению почвы или повышенной способности поглощать воду из почвы при засухе (15, 16).

Дальнейшие исследования по разработке селективных систем отбора клеток с измененным генотипом, а также методов оценки хозяйственно ценных признаков на уровне суспензий клеток, каллусных тканей и растений, культивируемых in vitro, наряду с применением методов генной инженерии, позволят создать сорта винограда, устойчивые к биотическим и абиотическим факторам внешней среды, обладающие высоким качеством урожая. клеточный суспензия селекция виноград

Литература

1. S p a r v o l i F., M a r t i n С., S c i e n z a A. e.a. Cloning and molecular analysis of structural genes involved in flavonoid and stilbene biosynthesis in grape, Vitis vinifera L. Plant Mol. Biol., 1994, 24: 743-755.

2. Luo S.L., H e P.C., Z h o u P. e.a. Identification of molecular genetic markers tightly linked to downy mildew resistant genes in grape. Acta Genetica Sinica, 2001, 28, 1: 76-82.

3. D o n a l d T.M., P e l l e r o n e F., A d a m - B l o n d o n A.F. e.a. Identification of resistance gene analogs linked to a powdery mildew resistance locus in grapevine. Theor. and Appl. Genetics, 2002, 104, 4: 610-618.

4. F r a n k s Т., H e D.G., T h o m a s M. Regeneration of transgenic Vitis vinifera L. Sultana plants: Genotypic and phenotypic analysis. Mol. Breed., 1998, 4, 4: 321-333.

5. T o r r e g r o s a L., V e r r i e s C., T e s n i e r e C. Grapevine (Vitis vinifera L.) promoter analysis by biolistic-mediated transient transformation of cell suspensions. Vitis, 2002, 41, 1: 27-32.

6. K i k k e r t J.R., H e b e r t - S o u l й D., W a l l a c e P.G. e.a. Transgenic plantlets of Chancellor grapevine (Vitis sp.) from biolistic transformation of embryogenic cell suspensions Plant Cell Rep., 1996, 15: 311-316.

7. S t r i e m M.J., R e i s c h B.J., K i k k e r t J.R. Differences in GUS expression among grapevine transformants. Acta Hort., 2000, 526: 437-443.

8. M o z s б r J., V i c z i б n O., S ь l e S. Agrobacterium-mediaied genetic transformation of an interspecific grapevine. Vitis, 1998, 37: 127-130.

9. H a r s t M., B o r n h o f f В.-A., Z y p r i a n E. e.a. Influence of culture technique and genotype on the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos (Vitis vinifera) and their conversion to transgenic plants. Vitis, 2000, 39: 99-102.

10. Y a m a m o t o Т., I k e t a n i H., I e k i H. e.a. Transgenic grapevine plants expressing a rice chitinase with enhanced resistance to fungal pathogens. Plant Cell Rep., 2000, 19: 639-646.

11. L e G a l l O., T o r r e g r o s a L., D a n g l o t Y. e.a. Agrobacterium-mediated genetic transformation of grapevine somatic embryos and regeneration of transgenic plants expressing the coat protein of grapevine chrome mosaic nepovirus (GCMV). Plant Sci., 1994, 102: 161-170.

12. S p i e l m a n n A., K r a s t a n o v a S., D o u e t - O r h a n d V. e.a. Analysis of transgenic grapevine (Vitis rupestris) and Nicotiana benthamiana plants expressing an Arabis mosaic virus coat protein gene. Plant Sci. (Limerick), 2000, 156, 2: 235-244.

13. M a r t i n e l l i L., C a n d i o l i E., C o s t a D. e.a. Stable insertion and expression of the movement protein gene of Grapevine Virus A (GVA) in grape (Vitis rupestris S.). Vitis, 2002, 41, 4: 189-193.

14. T o r r e g r o s a L., L o p e z G., B o u q u e t A. Antibiotic sensitivity of grapevine: a comparison between the effect of hygromycin and kanamycin on shoot development of transgenic 110 Richter rootstock (Vitic Berlandieri Vitis rupestris). South African J. for Enology and Viticulture (Stellenbosch), 2000, 21, 1: 32-39.

15. Z l e n k o V.A., T r o c h i n e L.P. Selection clonale de la vigne. In: 74е Assemblйe Gйnйrale de 1'OIV (Paris). Viticulture, 1994, 1: 1-14.

16. З л е н к о В.А., Т р о ш и н Л.П. Клоновая селекция винограда in vitro. Виноградарство и виноделие, 1995, 1: 12-19.

17. J a y a s a n k a r S., L i Z., G r a y D.J. In vitro selection of Vitis vinifera Chardonnay with Elsinoe ampelina culture filtrate is accompanied by fungal resistance and anhanced secretion of chitinase. Planta, 2000, 211: 200-208.

18. Z h a n g M., R a j a s h e k a r C.B. Selection of cold tolerant cells of grapes in suspension culture. Plant Sci. (Shannon), 1994, 97: 69-74.

19. З л е н к о В.А., К о т и к о в И.В., Т р о ш и н Л.П. Размножение оздоровленного посадочного материала винограда в культуре in vitro. Садоводство и виноградарство, 2005, 2: 21-23.

20. N i t s c h J.P., N i t s c h С. Haploid plants from pollen grains. Science, 1969, 163: 85-87.

21. R a j a s e k a r a n K., M u l l i n s M.G. Embryos and plantlets from cultured anthers of hybrid grapevines. J. Exp. Bot., 1979, 30: 399-407.

22. L e b r u n L., R a j a s e k a r a n K., M u l l i n s M.G. Selection in vitro for NaCl-tolerance in Vitis rupestris Scheele. Ann. Bot., 1985, 56: 733-739.

23. З л е н к о В.А., Т р о ш и н Л.П., Л е в е н к о Б.А. Методические указания по регенерации растений винограда в жидкой среде in vitro. M., 1990.

24. З л е н к о В.А., Т р о ш и н Л.П. Соматический эмбриогенез в суспензионной культуре винограда in vitro. Цит. и ген., 1993, 27, 3: 53-63.

25. M u r a s h i g e Т., S k o o g F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plantarum, 1962, 15: 473-497.

26. M u l l i n s M.G., S r i n i v a s a n С. Somatic embryos and plantlets from an ancient clone of the grapevine (c.v. Cabernet Sauvignon) by apomixis in vitro. J. Exp. Bot., 1976, 27: 1022-1030.

27. S a l u n k h e C.K., R a o P.S., M h a t r e M. Induction of somatic embryogenesis and plantlets in tendrils of Vitis vinifera L. Plant Cell Rep., 1997, 17: 65-67.

28. Z l e n k o V.A., K o t i k o v I.V., T r o s h i n L.P. Efficient GA3 -- assisted plant regeneration from cell suspensions of three grape genotypes via somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 2002, 70, 3: 295-299.

29. M a r t i n e l l i L., B r a g a g n a P., P o l e t t i V. e.a. Somatic embryogenesis from leaf and petiole-derived callus of Vitis rupestris. Plant Cell Rep., 1993, 12: 207-210.

30. G r a y D., M o r t e n s e n J. Initiation and maintenance of long term somatic embryogenesis from anthers and ovaries of Vitis longii «Microsperma». Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1987, 9: 73-80.

31. K r u l W.R., N a r r a g a n s e t t R.I. In vitro propagation of grape. Pat. USA, 1987, 4, 714, 679.

32. Z l e n k o V.A., T r o s h i n L.P., K o t i k o v I.V. An optimized medium for clonal micropropagation of grapevine. Vitis, 1995, 34: 125-126.

33. S l e n k o W.A., T r o s c h i n L.P., K o t i k o w I.V. Der Einfluss der Nдhrmedienzusammensetzung bei der in vitro-Vermehrung verschiedener Rebgenotypen. Mitteilungen Klosterneuburg, 2001, 51, 1: 15-26.

34. D i n g H a n f e n g, Q i G u i m e i. Ovule culture and plant formation of hybrid progeny of seedless grapes. J. of Agriculture in the Tropics and Subtropics, 2001, 102, 2: 147-152.

35. З л е н к о В.А., К о т и к о в И.В., Т р о ш и н Л.П. и др. Способ выращивания растений из труднопрорастающих семян. Пат. Украины № 17919 с приоритетом от 11.01.1995 г. Опубл. 28.02.2000 г. Бюл. изобр. и откр. № 1; пат. России № 2113111 с приоритетом от 26.01.1995 г.. Опубл. 20.06.1998 г. Бюл. изобр. и откр. № 17.

36. H o o s G., B l a i c t h R. Metabolism of stilbene phytoalexins in grapevines: oxidation of resveratrol in single-cell cultures. Vitis, 1988, 27: 1-12.

37. V a n n e l D., B a r b i e r M., B e s s i s R. Etude de la toxicitй du filtrat de culture de Botrytis cinerea sur des vitroplants de vignes: I. Effect du filtrat brut. Vitis, 1991, 30, 3. 167-175.

38. D a i G.H., A n d a r y C., M o n d o l o t - C o s s o n L. e.a. Involvement of phenolic compounds in the resistance of grapevine callus to downy mildew, Plasmopara viticola. European J. of Plant Pathol., 1995, 101, 5: 541-547.

39. D a i G.H., A n d a r y C., M o n d o l o t - C o s s o n L. e.a. Histochemical responses of leaves of in vitro plantlets of Vitis spp. to infection with Plasmopara viticola. Phytopathol., 1995, 85, 2: 149-154.

40. С т о е в К.Д. Физиологические основы виноградарства. София, 1973, Т. 2.

41. К а л и н и н Ф.Л., С а р н а ц к а я В.В., П о л и щ у к В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980.

42. C a l d e r у n A.A., P e d r e n o M.A., M u т o z R. e.a. Evidence for non-vacuolar localization of anthocyanoplasts, anthocyanin-containing vesicles, in suspension cultured grapevine cells. Phyton (Argentina), 1993, 54: 91-98.

43. Г о л о д р и г а П.Я., З л е н к о В.А., К а л у ц к а я Т.А. и др. Способ диагностики окраски кожицы и цвета сока ягод винограда. А.с. СССР № 948339, МКИ3 AOIG 7/00. № 3232084/30-15. Заявлено 04.01.1981; опубл. 07.08.1982. Бюл. изобр. и откр. № 29.

44. И з в о р с к а Н., Л и л о в Д. Образоване на пигментирани калуси от изолирани меристемни тькани от лоза. Физиол. на растенята, 1980, 4: 44-51.

45. H a y d u Z. Application of in vitro cultures in the research on grapevine genetics. In: 4-th International symposium on grape-vine breeding. Verone (Italie), 1985: 25.

46. Г о л о д р и г а П.Я., К о с т и к М.А., З л е н к о В.А. Прогнозирование некоторых компонентов качества урожая сортов и сеянцев винограда по каллусной ткани. Физиол. и биохим. культ, раст., 1986, 18, 5: 510-515.

47. S c h e n k R.U., H i l d e b r a n d t А.С. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dycotyledonous plant cell cultures. Can. J. Bot., 1972, 50: 199-204.

48. Г о л о д р и г а П.Я., З л е н к о В.А., Н и л о в Н.Г. Способ диагностики генотипической специфичности интенсивности развития корневой системы винограда. А.с. СССР № 1384285, МКИ3 А01Н 1/04. № 3965088/30-15. Заявлено 16.10.1985; опубл. 30.03.1988. Бюл. изобр. и откр. № 12.

49. G l e b a U.U., P i v e g n e N.M., G e n e e v S.U. e.a. Emploi de la culture in vitro dans la selection de la vigne. In: 68 Assemblйe Gйnйrate de 1'OIV (Paris). Viticulture, 1988, 1: 1-21.

Размещено на Allbest.ru