Анаболические гормоны в животноводстве: метаболизм и методы определения

Размещено на http://www.allbest.ru/

АНАБОЛИЧЕСКИЕ ГОРМОНЫ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ: МЕТАБОЛИЗМ И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

А.А. КОМАРОВ

Анаболические агенты -- соединения, которые стимулируют синтез белка и способствуют увеличению массы мышечной ткани. Применение анаболиков при разведении сельскохозяйственных животных позволяет увеличить убойную массу и повысить конверсию корма. Тот факт, что половые гормоны обладают анаболическим действием, известен очень давно. В 60-х годах прошлого столетия были синтезированы многочисленные аналоги природного андрогена -- тестостерона, обладающие наиболее выраженным анаболическим действием, -- нандролон (19-нортестостерон), метилтестостерон, станозол, клостебол, тренболон и др. (1). В практике животноводства в качестве анаболиков применяют природный стероид эстрадиол-17, синтетический -- этинилэстрадиол, а также стильбены (диэтилстильбестрол, диенэстрол, гексоэстрол) и лактоны резорциловой кислоты (зеранол, талеранол). Широко используют также анаболические агенты с прогестагенной активностью -- прогестерон и меленгестрола ацетат; последний эффективен при пероральном введении с кормами (2).

Эффективность анаболических стероидов зависит от многих факторов: вида, пола, возраста животного, определяющего зрелость гормональной системы, а также условий кормления и содержания. Максимальная скорость прироста живой массы животных наблюдается при концентрации половых гормонов, характерной для молодых половозрелых особей. При этом андрогены наиболее эффективны для самок, а эстрогены -- для самцов. На практике наиболее широкое распространение получили так называемые гормональные «коктейли», в состав которых входят андрогены, эстрогены и прогестагены, которые очень эффективны при введении кастрированным животным (1, 3).

Использование анаболиков в качестве стимуляторов роста сельскохозяйственных животных запрещено в странах Европейского Союза (ЕС) с 1981 года (директивы №№ 81/602/ЕЭС, 96/22/ЕС, 96/23/ЕС). Запрет распространяется как на использование этих соединений в сельском хозяйстве стран ЕС, так и на импорт мяса животных, получавших анаболики (4, 5). В Российской Федерации запрет на использование гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в животноводстве введен в соответствии с «Правилами по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения» (6).

С 1 января 1995 года вступило в силу «Соглашение о мерах санитарного и фитосанитарного контроля» в рамках Всемирной торговой организации (ВТО), по которому странам-участницам позволяется выбирать меры и допустимые границы санитарной защиты на собственной территории. Участники этого соглашения могут отступать от международных стандартов, норм или рекомендаций для достижения необходимой санитарной защиты, если тому есть научное обоснование.

Принимая во внимание, что в США, Канаде, Австралии и Новой Зеландии некоторые природные (тестостерон, эстрадиол-17, прогестерон) и синтетические (тренболон, зеранол и меленгестрола ацетат) гормоны разрешены для использования в качестве стимуляторов роста (табл. 1), возникла конфликтная ситуация между этими странами и ЕС. США обратились в ВТО с протестом по поводу блокирования странами ЕС международной торговли и нарушения международного права (7, 8).

1. Анаболические препараты, зарегистрированные администрацией Федерального агенства по контролю за качеством продуктов питания и лекарственными средствами (FDA) США в качестве стимуляторов роста сельскохозяйственных животных (цит. по 9)

Программа контроля за использованием анаболиков на конных спортивных соревнованиях была впервые введена в Великобритании в 1976 году (10). Вначале усилия были направлены на выявление незаконного применения таких препаратов, как нандролон, тестостерон, болденон и тренболон, в качестве допинга для спортивных лошадей. В последние годы список контролируемых препаратов был расширен и стал дополнительно включать станозол, клостебол и другие синтетические стероиды. В спортивном коневодстве особое опасение вызывает отрицательное действие этих препаратов на репродуктивную систему животных, которые представляют большую ценность (11). В России до настоящего времени не существует программы контроля за применением анаболиков в спортивном коневодстве.

При использовании анаболиков в животноводстве риск воздействия остаточного количества этих препаратов на здоровье потребителей -- основная опасность, вызывающая беспокойство. Несмотря на то, что естественные стероиды (тестостерон, прогестерон, эстрадиол-17, эстрон) синтезируются у людей и животных эндогенно, риск, связанный с воздействием этих гормонов, поступающих извне, зависит не только от дозы, но главным образом от условий и продолжительности воздействия. Вновь появившиеся научные данные опровергают идею наличия фиксированного порога чувствительности для каждой ткани и/или физиологической функции. Например, чувствительность гипоталамо-гипофизарной системы к стероидам намного выше в детстве, чем в подростковом и зрелом возрасте (3).

До настоящего времени непредсказуемы отдаленные последствия случайного воздействия стероидов в препубертатном возрасте на репродуктивную функцию. Так, у самок крыс постнатальная андрогенизация после однократного введения тестостерона навсегда изменяет реакцию клеток матки на действие эстрогенов по принципу «гормонального импритинга» (12). Аналогично у самцов хомяков неонатальное введение диэтилстильбестрола (ДЭС) нарушает репродуктивную функцию в зрелом возрасте и навсегда изменяет степень андрогенного ответа тканей-мишеней, несмотря на нормальное пубертатное развитие (13). Интересно, что импритинг у крыс возможен только в первые 4 сут после рождения. Следовательно, этот процесс возникает только при воздействии в критический период -- так называемые «окна чувствительности».

На крысах, мышах, хомяках, собаках, свиньях, крупном рогатом скоте, овцах и обезьянах экспериментально доказано, что экзогенные половые гормоны, включая натуральные стероиды, вводимые энтерально, парэнтерально или в форме имплантантов, оказывают дозозависимое негативное воздействие на репродуктивную функцию мужских и женских особей (14).

Главный дискутируемый в настоящее время вопрос -- оказывает ли потребление мяса животных, легально получавших гормоны, разрешенные в США и некоторых других странах, отрицательное воздействие на человека. В одном из отчетов JECFA (Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам) представлены расчеты избыточного максимального потребления эстрадиола, тестостерона и прогестерона, исходя из гормональных имплантантов, разрешенных в США (15). Показано, что использование этих препаратов ведет к дополнительному избыточному ежесуточному потреблению эстрогенов (эстрадиол-17 + эстрон) в количестве 1,1-83,9, прогестерона -- 64-467 и тестостерона -- 5-189 нг на одного человека. Стоит отметить, что эти данные касаются только основных соединений, не учитывая вклад метаболитов. Эти повышенные концентрации гормонов, вызванные имплантантами, ниже тех, которые могут возникнуть при потреблении мяса стельных коров, но таких животных, как правило, не забивают на мясо.

При оценке концентрации эндогенных стероидов в крови человека в разные физиологические периоды показано, что у женщин в препубертатный период и после наступления менопаузы, а у мужчин в препубертатный период и зрелом возрасте концентрация эстрогенов и прогестерона минимальная, то есть в случае экзогенного поступления этих гормонов они представляют группу повышенного риска (15).

Исследование трех гормонов эндогенного происхождения (эстрадиол-17, тестостерон и прогестерон) свидетельствует о том, что натуральное происхождение этих соединений не делает их более безопасными (16). Женщины, у которых повышена концентрация эстрогенов, подвержены риску заболевания раком молочной железы и эндометрия. В работах последних лет показано, что метаболиты основных гормонов обладают генотоксическим эффектом, независимо от наличия гормональных рецепторов (17). Это касается в первую очередь катехол-эстрогенов и соответствующих хинонов, в частности 4-гидроксипроизводных.

Общепризнано, что экспрессия ферментов, метаболизирующих лекарственные препараты, регулируется гормонами. Для различных видов животных, включая жвачных, описаны половые различия при распределении и метаболизме ветеринарных лекарственных препаратов (18-20). Доказано, что анаболические стероиды продлевают сроки элиминации лекарственных препаратов (21). В связи с этим использование гормонов для стимуляции роста может повышать остаточное содержание в животноводческой продукции нежелательных веществ (в частности антибиотиков), используемых при лечении животных.

Как известно, в местах размещения имплантантов содержится максимальное остаточное количество гормонов -- от 6 до 30 % от применяемых концентраций. При законном использовании стероидов эти участки обязательно удаляют, при незаконном -- они вряд ли будут обнаружены на бойне. Однократное потребление человеком мяса из участков имплантации гормонов приводит к длительному подавлению эндогенного синтеза последних в организме. При потреблении такого мяса в течение продолжительного времени могут появляться клинические признаки отравления, а попадание его в продукты детского питания может вызывать серьезные последствия для здоровья детей (22). Так, в Пуэрто-Рико за последние 30 лет описано более 10 000 случаев аномального полового развития, включая преждевременное развитие молочных желез (телархе) и оволосение лобка (пубархе), псевдораннее половое созревание, гинекомастию, синдром симуляции яичников (23). Эти аномалии были обусловлены загрязнением эстрогенами продуктов питания. Другие случаи увеличения размера молочных желез и псевдораннего полового созревания наблюдались в Италии, что также было обусловлено контаминацией пищи эстрогенами (24, 25). В 1980 году анализ детского питания итальянского производства, включающего гомогенизированную телятину, выявил наличие ДЭС, содержащегося в имплантантах, которые не были удалены до забоя скота (26).

Использование синтетических анаболиков, которые значительно медленнее метаболизируются по сравнению с природными аналогами, вызвало ряд новых проблем. Поскольку синтетические анаболики позволяют добиться значительного повышения продуктивности животных и снизить себестоимость продукции, это вызвало всплеск незаконного их использования в ряде стран. В то же время токсикологическое действие ряда синтетических анаболиков до настоящего времени недостаточно изучено и оценка рисков, связанных с их применением, очень сложная задача.

Данные бельгийских ученых позволяют получить представление об ассортименте анаболиков, незаконно использовавшихся в животноводстве в Европе в 90-е годы прошлого столетия (табл. 2).

анаболик сельскохозяйственный животноводство корм

2. Частота встречаемости различных гормонов у сельскохозяйственных животных в местах имплантации анаболиков (% от общего числа исследованных проб) (цит. по 27)

Наиболее часто в последние годы применяли естественные стероиды, а также клостебола ацетат, станозол и флюоксиместерон; значительно снизилось использвание нортестостерона и его эфиров. Так, в 1983 году в Нидерландах при анализе участков имплантации в образцах мяса были обнаружены нортестостерон, тестостерон, эстрадиол-17, медроксипрогестерона ацетат, ДЭС, метилтестостерон, тренболон, прогестерон и диеноэстрол соответственно в 96, 45, 45, 30, 11, 6, 4, 2 и 1 % случаев. Из 100 образцов мяса, купленного в магазинах в Нидерландах в 1990 году, только в трех случаях был обнаружен нортестостерон, а в 1991 году в 5 образцах из 99 -- медроксипрогестерон; в 1994 году наиболее часто выявляли клостебола ацетат и метилболденон (28-30).

Резюмируя вышеизложенное можно заключить, что применение гормональных стимуляторов роста в животноводстве развивается по двум направлениям. Во-первых, это все более частое использование естественных стероидных гормонов из-за их относительной безопасности и трудоемкости обнаружения при нелегальном использовании, учитывая большие колебания содержания этих гормонов у животных различных видов и возраста в разные физиологические периоды, во-вторых, применение новых синтетических анаболиков (станозол, болденон и др.), обладающих наиболее выраженным анаболическим эффектом.

М е т а б о л и з м а н а б о л и ч е с к и х г о р м о н о в. В последние несколько лет получены многочисленные доказательства способности метаболитов эстрогенов повреждать ДНК и вызывать мутации, которые могут обусловливать возникновение рака (17). Существует два основных пути метаболизма эстрогенов: 16-гидроксилирование и обра-зование катехол-эстрогенов (31). Катехол-эстрогены (2- и 4-гидрокси-производные) инактивируются в основном о-метилированием, катализируемым катехол-о-метилтрансферазами. Инактивация может осуществляться посредством глюкуронизации и сульфатации катехол-эстрогенов. При недостаточной коньюгации существует возможность окисления катехол-эстрогенов до полухинонов и хинонов; последние могут соединяться с глютатионом. Другой процесс инактивации сопряжен с редукцией хинонов до катехол-эстрагенов, катализируемой хинонредуктазой. Эстроген-2,3-хинон и эстроген-3,4-хинон могут вступать в реакцию с ДНК и образовывать стабильные продукты, обладающие апуринизационным эффектом (32, 33). По одной из современных гипотез, реакция эстроген-3,4-хинона с ДНК инициирует возникновение некоторых видов рака у человека, в том числе рака молочной железы, эндометрия, яичников и предстательной железы (32).

После применения эстрадиола бензоата основные метаболиты, обнаруживаемые в мышечной ткани, были представлены 17-эстрадиолом и эстроном -- соответственно 38-70 и 17-45 % экстрагированной радиоактивности (34). Распределение метаболитов в жировой ткани было аналогично таковому в мышцах; высокие остаточные количества обнаружены в печени и почках. В наибольшем количестве были выделены 17-эст-радиол, 17-эстрадиолглюкуронид, эстрадиол-17 и эстрон; в печени основной метаболит не удалось идентифицировать (40 % экстрагированной радиоактивности). Оставшаяся радиоактивность приходилась на эстрадиол-17, эстрон и глюкурониды (34). При исследовании природы полярных метаболитов в печени молодых кастрированных бычков были выявлены следующие: -D-глюкопиранозид 17-эстрадиола (на который приходилась основная доля), 3-D-глюкуронат 17-эстрадиола и другие 17-глюко-зиды (34, 35).

В настоящее время доказано, что эстрогены обладают генотоксичным потенциалом. Например, в культурах клеток, обработанных эстрадиолом-17, и в эмбриональных клетках сирийского хомячка, которые впоследствии трансформировались в опухолевые клетки, наблюдали анеуплоидию и изменение структуры хромосом (36-38). Индукция микронуклеусов под воздействием эстрадиола-17 отмечена в клетках семенных пузырьков овцы и клетках ворсинок хориона человека (39, 40).

В культуре клеток MCF-7 под влиянием 2-метокси- и 2-гидрокси-метаболитов эстрадиола-17 возникают повреждения хромосом, нарушения веретена деления, фрагментация полюсов веретена и неравномерное расхождение хромосом (41). Некоторые гидрокси- и метоксиметаболиты эстрона и эстрадиола-17 разрушают цитоплазматические микротрубочки в клетках V79 (42). В настоящее время имеются убедительные доказательства, достаточные для того, чтобы классифицировать этот гормон как канцероген (43-45).

Синтетический эстроген ДЭС длительный период легально использовали в США в качестве стимулятора роста мясного скота, и только в 1979 году он был запрещен FDA (2). ДЭС является канцерогеном для человека и животных и в настоящее время применяется в качестве модели для изучения механизма действия гормонально активных канцерогенов. В процессе метаболизма ДЭС образуется несколько реактивных метаболитов: окиси, катехолы, 3'-гидрокси-ДЭС, ДЭС-4',4^”-полухинон, ДЭС-4',4^”-хинон. Исследования, выполненные на различных видах животных, показали, что окисленные метаболиты ДЭС играют ведущую роль в механизме развития вызванного этим эстрогеном рака (2).

Андрогены обладают сильным анаболическим действием, в том числе усиливают синтез белка в мышечной и костной ткани (46). Основной представитель природных андрогенов -- тестостерон. В некоторых органах, например в простате, фермент 5-редуктаза способен превращать тестостерон в 5-дигидротестостерон (ДГТ), являющийся более сильнодействующим андрогеном. Как тестостерон, так и ДГТ действуют опосредовано, через высокоаффинное и высокоспецифичное связывание с внутриклеточным белком-рецептором андрогенов (РА) и его последующей активацией. Полагают, что РА участвует в развитии рака яичников, так как его обнаруживают в 67 % опухолей яичников. Важно также отметить, что в тканях, содержащих ароматазу CYP450 (CYP19), тестостерон может подвергаться реакции ароматизации с образованием эстрадиола. Экскреция тестостерона происходит главным образом с желчью и в меньшей степени с мочой. В большинстве случаев фракция гормона, экскретируемого с мочой, представляет собой конъюгированный тестостерон, тогда как в кале гормон присутствует в свободной форме (47).

О специфических путях метаболизма и скорости выведения тестостерона из организма крупного рогатого скота почти ничего неизвестно. У крыс существует семь путей окисления этого гормона: 2-, 2-, 6-, 15-, 16-, 18-гидроксилирование тестостерона и 17-окисление андростендиона. Скорости этих реакций у взрослых особей мужского пола в 7-200 раз выше, чем у самок; у неполовозрелых животных разного пола они не различаются. Более того, показано, что специфичные цитохром Р450-содержащие ферменты избирательно метаболизируют тестостерон в различных перечисленных положениях. Инактивация тестостерона происходит в основном в печени, где он превращается в андростендион и в конце концов -- в андростерон и другие соединения, экскретируемые в форме глюкуронидов и сульфатированных конъюгатов (48).

Метаболизм синтетических андрогенных стероидов изучен плохо. Исследования с меченными тритием 19-нортестостероном и болденоном, выполненные на скаковых лошадях, а также анализ у людей превращений болденона, метандиенона и оксиметолона показали, что метаболизм синтетических андрогенов существенно отличается от такового тестостерона. Так, тестостерон эффективно разрушается по 4,5-двойной связи и 3-кето-группе соответственно 5-редуктазой и 3/-гидроксистероидоксидо-редуктазой и окисляется по 17-гидрокси-группе 17-гидроксистероидде-гидрогеназой. Дополнительные двойные связи, алкилирование по 17-му положению или удаление С-19-метильной группы мешают этим метаболическим реакциям; как следствие -- разрушение А-кольца и гидроксилирование в 6-м и 16-м положениях. Эти данные нашли подтверждение в сравнительных исследованиях метаболизма меченных тритием тестостерона и нандролона в органах и тканях крыс (2).

В литературе отсутствует какая-либо информация о повреждениях ДНК, вызванных тестостероном или его метаболитами. Однако тестостерон подвергается реакции ароматизации с образованием эстрадиола, который метаболизируется в реакционноспособные формы, способные повреждать ДНК и вызывать мутации. По данным Noble, скармливание тестостерона вызывает образование опухолей матки и предстательной железы у лабораторных животных (49). На основании вышеперечисленного, андрогенные анаболические стероиды, включая и тестостерон, считаются вероятными канцерогенами для человека (IARC -- Международное агентство по изучению рака, группа 2А) (43).

Тренболона ацетат (17-гидроксиэстра-4,9,11-триен-3-он) (ТБА) -- это синтетический анаболический стероид, обладающий андрогенной активностью, в 8-10 раз более сильнодействующий, чем тестостерон (50). При попадании в кровеносную систему ТБА быстро подвергается гидролизу с образованием активной формы 17-тренболона (ТБ-ОН). У жвачных животных основным метаболитом, обнаруженном в кале, желчи и печени является 17-эпимер; в мышечной ткани преобладает 17-эпимер. Выведение с желчью и мочой происходит после образования конъюгатов главным образом с глюкуроновой кислотой (51). В плазме крови также был обнаружен конъюгированный ТБ-ОН, концентрация которого составляла 13 % от концентраций свободного ТБ-ОН. В желчи были идентифицированы еще несколько метаболитов, но главным образом -- трендион. В 1978 году Ryan с соавт. сообщили о поразительных расхождениях при оценке остаточных концентраций посредством введения радиактивной метки и методом радиоиммунного анализа (РИА) (52). Авторы пришли к выводу, что значительно более низкие значения при использовании РИА обусловлены образованием ковалентно-связанных неэкстрагируемых остатков. Это наблюдение получило дальнейшее подтверждение и в исследованиях in vitro, где было показано, что в образовании остатков этого типа задействованы цитохромы Р450 печени (53). Выяснилось, что метаболизм ТБА видоспецифичен и сложен, поэтому необходимы дальнейшие исследования, в которых предстоит определить как судьбу метаболитов, так и химическую природу ковалентно-связанных остатков.

При изучении мутагенности и генотоксичности полярных метаболитов ТБА -- 17-ТБ-ОН и 17-ТБ-ОН -- получены одинаковые результаты. Поскольку 17-метаболит является более слабым андрогеном, можно сделать вывод о том, что генотоксичные эффекты ТБ-ОН не связаны с гормональной активностью. Lasne с соавт. выявлена способность 17-ТБ-ОН трансформировать эмбриональные клетки сирийского хомячка (54). В работе Tsutsui с соавт. при проверке всех концентраций были получены отрицательные результаты (55).

После инкубации [³H] 17-ТБ-ОН с постмитохондриальным супернатантом печени крысы и после введения этого соединения крысам (перорально или внутрибрюшинно) наблюдалось ковалентное связывание [³H] 17-ТБ-ОН с ДНК (56). Аналогичные данные получены и в работах других авторов (57, 58). Образование ДНК-аддуктов наблюдали также в гепатоцитах крысы, культивируемых in vitro в присутствии 30 мкм -ТБ-ОН.

При скармливании мышам ТБА в высоких дозах наблюдались многочисленные случаи гиперплазии и опухоли печени. У крыс отмечено незначительное повышение частоты возникновения инсуломы поджелудочной железы (59). В то же время в двухгодичном эксперименте на мышах и крысах не было получено никаких определенных результатов по канцерогенности -ТБ-ОН (60).

Информация о канцерогенности ТБА для человека до настоящего времени отсутствует. Для того чтобы оценить риск воздействия ТБА при многократном попадании этого соединения в организм человека с пищей, требуется более детальное исследование механизма действия полярных метаболитов, образуемых этим гормоном.

Прогестерон (наиболее сильнодействующий эндогенный прогестоген) назначают животным главным образом в комбинации с эстрогенными соединениями, для того чтобы ускорить прирост живой массы и повысить эффективность использования корма. Метаболизм прогестерона в организме жвачных изучали с использованием соединений, меченных радиоактивной меткой (61, 62). При этом бульшая часть радиоактивной метки во всех экстрактах соответствовала исходному соединению: в мышечной ткани 54 % свободной радиоактивности, в жировой -- 69 и 73 % соответственно свободной и конъюгированной радиоактивности. К основным метаболитам, обнаруженным в мышечной ткани (16 % от общей радиоактивности) относились следующие: 5-прегнан-3,20-дион; 20-гидрокси-4-прегнен-3-он; 3-гидрокси-5-прегнан-20-он и 3-гидрокси-5-прегнан-20-он -- соответственно 9, 8, 13 и 3 %. В жировой ткани основной метаболит (62 % от общей радиоактивности) был представлен 20-гидрокси-4-прегнен-3-оном (11 %) (62). О специфичных ферментах жвачных животных, метаболизирующих прогестерон, известно мало, хотя, по всей вероятности, в метаболическом клиренсе этого гормона задействованы цитохром-Р450 и ферменты печени.

Информация по мутагенности и генотоксичности прогестерона отсутствует, хотя в отчете JECFA за 1999 год имеется упоминание о том, что в исследованиях in vivo и in vitro прогестерон вызывал одноцепочечные разрывы ДНК и образование ДНК-аддуктов (15). Показано, что у лабораторных животных прогестерон повышает частоту возникновения опухолей в тканях молочной железы, влагалища, яичников и матки (63, 64).

О канцерогенности прогестерона в организме человека известно очень мало, но в IARC посчитали полученные на экспериментальных животных данные в пользу канцерогенности медроксипрогестерона ацетата достаточными для отнесения контрацептивных средств, содержащих прогестагены, в группу 2В, то есть веществ, потенциально канцерогенных для человека (43). В настоящее время этой информации недостаточно для того, чтобы дать количественную оценку риска, связанного с воздействием остаточного содержания прогестагенов в мясе и мясопродуктах животных, получавших эти гормоны в качестве стимуляторов роста.

Меленгэстрола ацетат (17-ацетокси-6-метил-16-метиленпрегнан-4,6-диен-3,20-дион) (МГА) -- синтетический прогестаген, используемый для повышения эффективности использования кормов, стимуляции роста и подавления эструса у предназначенных для откорма телок. В организме крысы прогестагенная активность МГА в 30 раз превосходила таковую прогестерона. МГА не обладает андрогенной активностью и имеет крайне низкую эстрогенную активность.

Образующиеся в организме жвачных животных метаболиты МГА обнаружены, но пока не идентифицированы (65). После назначения жвачным животным меченного МГА экскреция радиоактивного МГА и его метаболитов происходила главным образом с калом (87 %) и мочой (13 %); приблизительно 15 % МГА экскретировалось в неизмененном виде (66). Содержание неметаболизированного МГА в жировой ткани, мышцах, печени и почках составляло соответственно 86, 48, 29 и 29 % (65).

In vitro метаболизация МГА индуцированными арохлором микросомами печени крысы приводила к образованию семи моногидроксилированных и пяти дигидроксилированных метаболитов. Основные метаболиты, образующиеся в микросомальной фракции печени крысы, выявлены также в микросомах жвачных животных.

Наиболее высокое содержание МГА и его производных отмечено в печени, хотя в действительности мишенью для этого соединения служит жировая ткань. В экспериментах на стельных телках, получавших МГА при скармливании в дозе 0,4 мг/сут, содержание прогестагена в жировой ткани составляло 10-20 мкг/кг, однако через 48 ч после отмены препарата оно было ниже 10 мкг/кг (66).

Информация о мутагенности и генотоксичности МГА отсутствует. Подкожная имплантация МГА самкам мыши линии SMN (10 мг в форме гранул, 1 раз в 2 мес) приводила к незначительному повышению частоты опухолей молочной железы, в которых не выявлено увеличения количества пренеопластических гиперплазированных альвеолярных узелков (67). Этих данных недостаточно для того, чтобы судить о канцерогенности МГА.

Анализ содержания МГА в различных тканях животных не позволяет сделать окончательных выводов как относительно остаточного количества этого соединения, так и о природе токсикологических эффектов. В связи с этим не представляется возможности оценить риск для потребителя, использующего в пищу мясо и мясопродукты, содержащие этот гормон.

Зеранол (-зеараланол) -- эстрогенное производное микоэстрогена зеараленона. В организме свиньи, крысы и цыпленка зеранол связывается с рецепторами эстрогена, при этом его аффинность близка к таковой ДЭС, то есть намного выше, чем у эстрадиола (68). Период полувыведения зеранола вместе с метаболитами из крови составляет 26 ч для новозеландских кроликов и 18 ч для макак-резус (69). В моче обнаружены конъюгаты-глюкурониды и конъюгаты-сульфаты. В организме жвачных животных выявлены метаболиты зеранола -- зеараленон и талеранол (70, 71). Метаболизация зеранола микросомами (неиндуцированными или индуцированными арохлором) печени крысы позволила обнаружить пять новых метаболитов, которые, по предварительным данным, являются в основном моногидроксилированными производными зеранола и в небольшом количестве -- талеранола и зеараленона. Три из пяти моногидроксилированных производных зеранола выявлены в микросомах печени жвачных.

У жвачных животных, которым вводили под кожу уха имплантант, содержащий 30 мг меченного тритием зеранола, остаточное количество анаболических веществ в тканях достигало максимума в период с 5-х по 15-е сут после обработки, а затем медленно снижалось. Через 65 сут в области имплантации оставалось приблизительно 60 % (от исходной дозы) анаболиков; максимальное остаточное количество отмечено в печени. Проведены лишь немногочисленные исследования метаболизма зеранола, на основании которых был сделан вывод о том, что остаточное содержание в почках, мышечной и жировой тканях в пересчете на зеранол в среднем не превышает соответственно 2,0; 0,2 и 0,3 мкг/кг (72).

После однократного введения крысам меченного тритием зеранола в дозе 60 мкг/кг обнаружено связывание этого соединение с ДНК печени (57). После однократной дозы (2 мкг/кг) зеараленона (метаболитом которого является зеранол) у мышей выявлены ДНК-аддукты этого гормона в почках (или печени) самок, а после многократных доз -- в яичниках (73). В экспериментах на крысах линии Фишер 344/N, получавших при скармливании зеранол в дозе 25 мг/кг, не удалось выявить неопластических образований, связанных с действием этого препарата. При скармливании мышам линии B6C3F1 зеранола в дозах до 100 мг/кг у самцов какие-либо эффекты отсутствовали, тогда как у самок в ряде тканей наблюдались эффекты, характерные для эстрогенов, например миелофиброз костного мозга (74). У самцов и самок армянского хомяка отмечалась дозозависимая индукция аденом и карцином печени под влиянием зеранола (75). В настоящее время отсутствуют какие-либо сведения о взаимосвязи между употреблением мяса с остаточным содержанием зеранола и риском возникновения онкологических заболеваний у человека.

В заключение отметим, что имеющиеся данные не позволяют дать количественную оценку риска, связанного с воздействием остаточных количеств зеранола в мясе. Кроме того, необходима дополнительная информация о природе метаболитов, образующихся в организме жвачных животных.

М е т о д ы о п р е д е л е н и я а н а б о л и ч е с к и х с о е д и н е н и й. Стратегия контроля анаболиков в продукции животноводства в странах Европы включает скрининг с помощью РИА или ИФА, причем в случае положительной реакции образцы подвергают анализу методами хроматографии или масс-спектрометрии (76). Учитывая, что анаболические стероиды метаболизируются главным образом с образованием коньюгатов (глукоронидов и сульфатов), подготовка проб обычно включает гидролиз этих коньюгатов. Наиболее часто проводят ферментативный гидролиз с использованием сока Helix pomatia, обладающего как глюкоронидазной, так и сульфатазной активностью. Применяют также глюкоронидазу, выделенную из E. сoli, в комбинации с сольволизом для гидролиза сульфатов (10).

Le Bizec с соавт. детально исследовали ферментативный гидролиз тестостерона-17-сульфата, 19-нортестостерона-17-сульфата и соответствующих 17-глукоронидов (77). При этом было показано, что активность -глюкоронидазы не меняется в широком диапазоне рН и температур (10-80 ^оС). Напротив, у сульфатазы наблюдался максимум активности по отношению к тестостерону-17-сульфату при рН 5,2 и температуре 52 ^оС; при любых других рН в диапазоне от 4 до 7 активность фермента была очень низкой. Однако даже при оптимальных условиях эффективность ферментативного гидролиза сульфатов была значительно ниже, чем глюкоронидов. По данным Teale с соавт., использование сольволиза с помощью серной кислоты позволяет эффективно гидролизовать сульфаты в течение 30 мин при 50 ^оС (78).

Tang c соавт. описали новый одноступенчатый метод гидролиза глюкоронидов и сульфатов в моче (метанолиз), который заключается в нагревании коньюгатов с хлористым водородом в безводном метаноле (79). Хотя метанолиз дает несколько меньшую эффективность гидролиза по сравнению с ферментативным гидролизом/сольволизом, этот метод является более быстрым, эффективным и простым, чем обусловлено его широкое применение в конном спорте (80).

Для очистки и экстракции анаболиков из органов, тканей и физиологических жидкостей животных широко используют такие методы пробоподготовки, как жидкостная экстракция, хроматография на Sephadex LH-20, адсорбционная хроматография на неионной полистероловой смоле Amberlite XAD-2, твердофазная экстракция (ТФЭ) на патронах с обращенной и смешанной фазай, иммуноафинная хроматография и твердофазное диспергирование, позволяющее проводить экстракцию аналита и очистку образца в одну стадию (10, 81-92). В ряде работ для дополнительной очистки проб после ТФЭ на обращеннофазных патронах (С₁₈) удачно применяли полярные сорбенты: силикагель, окись алюминия, аминопропилсиликагель (85, 93-96).

Для скрининг-определения анаболиков наиболее широкое применение получили РИА и ИФА (81, 86, 91, 92, 94, 97-101). До недавнего времени большинство подтверждающих анализов при оценке остаточных количеств анаболиков было основано на сочетании двух или нескольких методов, обеспечивающих дополнительные гарантии при идентификации аналитов. Например, иммунограмма, когда иммунохимическими методами (РИА, ИФА) проводят количественное определение искомых анаболиков после разделения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Это позволяет совместить относительно высокую эффективность хроматографического разделения и высокую чувствительность анализа, характерную для иммунохимических методов (89, 102-104). Так, описан метод определения ВЭЖХ 60 различных стероидов в составе гормональных препаратов с одновременной записью УФ-спектра веществ на диодной матрице, что значительно повысило надежность идентификации гормонов (105).

В последние годы предпочтение отдают молекулярно-спектро-метрическим подтверждающим методам определения анаболиков, которые позволяют проводить прямую идентификацию аналитов. Идеальным подтверждающим методом является хромато-масс-спектрометрия, в котором сочетаются капиллярная газовая хроматография и масс-спектрометри-ческое детектирование, особенно в режиме тандемной масс-спектромет-рии (МС-МС), позволяющей значительно снизить требования к предвари-тельной очистке пробы и на порядок повысить чувствительность метода (77, 86-89, 93, 95, 96, 106-111). Анализ анаболиков методом газовой хроматографии требует дериватизации гидрокси- и кето-функциональных групп в молекуле стероида перед анализом. Дериваты обладают повышенной термостабильностью и улучшенными хроматографическими характеристиками.

Для образования триметилсилан-производных гормонов (ТМС) наиболее часто используют смесь N-метил-Т-триметилсилилтрифтораце-тамида (МСТФА) и йодтриметилсилана (ИТМС) (112). Однако с этой целью предпочтительнее применять смесь йодистого аммония (NH₄J) с МСТФА, чем непосредственно ИТМС, так как NH₄J более стабилен при хранении. В качестве антиоксидантов наиболее эффективны дитиоэритритол (ДТЕ) или этантиол (10, 92).

Заключение

Широкое использование ряда природных и синтетических анаболических гормонов в США и других странах в качестве стимуляторов роста сельскохозяйственных животных способствовало всестороннему изучению побочных эффектов, связанных с остаточным содержанием этих соединений в животноводческой продукции. Имеющиеся опасения основаны на все увеличивающейся информации об уязвимости гормонального равновесия на разных стадиях онтогенеза, а также потенциальной генотоксичности этих соединений и их метаболитов. Проводившиеся ранее оценки риска были основаны на том, что природные гормоны образуются в организме человека эндогенно, а их содержание характеризуется значительными индивидуальными различиями. С учетом среднего количества эндогенных гормонов, образующихся ежесуточно в организме человека, воздействие, связанное с употреблением в пищу мяса животных, получавших гормоны, считалось крайне незначительным. На основании этих данных допустимое суточное потребление синтетических гормонов рассчитывали по уровню неэффективного гормонального воздействия.

Однако полученная в последние годы информация об индивидуальных особенностях эндокринной системы свидетельствует о необходимости дифференцированного подхода к людям различного пола и возраста при оценке гормонального воздействия, особенно детям препубертатного возраста. При этом следует учитывать, что побочные эффекты гормонов могут быть опосредованы не только механизмами, в которых задействованы рецепторы гормонов, но и непосредственно связаны с образованием метаболитов, обладающих генотоксичностью. Существуют также второстепенные риски, так как назначение гормонов сельскохозяйственным животным вызывает изменение распределения, выделения и элиминации ксенобиотических соединений -- антибиотиков, ветеринарных препаратов и др.

В связи с этим ни для одного из гормонов сегодня не может быть установлен пороговый уровень, а следовательно, и уровень допустимого суточного потребления. Поэтому с целью снижения риска требуется постоянный надзор за использованием гормонов, для чего необходимы адекватные программы контроля за остаточным содержанием анаболических веществ в животноводческой продукции. У нас в стране такая программа контроля анаболиков в продукции животноводства разрабатывается во Всероссийском государственном НИИ контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов -- Центр качества ветеринарных препаратов и кормов. В настоящее время проходят испытания иммуно-ферментные тест-системы для скрининг-определения анаболических гормонов в продукции животноводства, причем для окончательного анализа присутствия анаболиков в положительных ИФА-пробах предлагается использовать метод капиллярной газовой хроматографии с масс-спектраль-ным детектированием.

Литература

1. R a n g H.P., D a l e M.M. The reproductive system. In: Pharmacology. Churchill Livingstone, Edinburgh, 1987, ISBN 0-443-03407-9: 413-432.

2. M e t z l e r M. Metabolism of some anabolic agents: toxicological and analytical aspects. J. of Chromatography,1989, 489: 11-21.

3. Assessment of potential risks to human health from hormone residues in bovine meat and meat products. In: Opinion of the Scientific Committee on Veterinary Measures Relating to Public Health. European Commission, 1999.

4. Council Directive 96/22/EU. Off J. European Commission, 1996, L 125: 3-9.

5. Council Directive 96/23/EU. Off J. European Commission, 1996, L 125: 10-32.

6. Правила по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения, Приказ Минсельхозпрода России № 604 от 18 августа 1999 года.

7. Europeen Commission. Measures concerning meat and meat products (hormones), panel report. World Trade Organization. Documents WT/DS26/R/USA and WT/DS48/R/CAN. Geneva, 18-8-1997.

8. European Commission. Measures concerning meat and meat products (hormones), report of the appellate body. World Trade Organization. Documents WT/DS26/AB/R and WT/DS48/AB/R. Geneva, 16-1-1998.

9. M a r a s h S., O p p e n b e r g B., T a k e i N. Animals: chemical inputs for nutrition and health (overview). CEN Marketing Research Report., 1999: 201.8004Q-201.8004R.

10. G o w e r D.B., H o u g h t o n E., K i c m a n A.T. Anabolic steroids: metabolism, doping and detection in equestrian and human sports. In: Steroid Analysis. ISBN 0-7514-0128-5. Glasgow, 1995: 468-526.

11. S n o w D.H. Anabolic steroids. Veterinary Clinics of North America, 1993, 9: 563-576.

12. M e n a M.A., A r r i a z a C.A., T c h e r n i t c h i n A.N. Early postnatal androgenization imprints selective changes in the action of estrogens in the rat uterus. Biol. Reprod., 1992, 46: 1080-1085.

13. H a h n B.N. Systemic lupus erythrematosus. In: Harrison's Principle of Internal Medicine /Eds. A.S. Fauci e.a. 14^th edition. MacGraw-Hill, N.Y., 1998: 1874-1880.

14. JECFA-Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, Residues of Some Veterinary Drugs in Animals and Foods. Food and Nutrition Paper № 41. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Roma. 1998.

15. JECFA-Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, Fifty-Second Meeting. Summary and Conclusions. Rome, 1999.

16. H e n d e r s o n B.E., R o s s R., B e r n s t e i n L. Estrogens as a cause of human cancer: the Richard and Hinda Rosenthal Foundation award lecture. Cancer Research, 1988, 48: 246-253.

17. S e r v i c e R.F. New role for estrogen in cancer? Science, 1998, 279: 1631-1633.

18. W i t k a m p R.F, L o h u i s J.A., N i j m e i j e r S.M. e.a. Species- and sex-related differences in the plasma clearance and metabolite formation of antipyrine. A comparative study in four animal species: cattle, goat, ratand rabbit. Xenobiotica, 1991, 11: 1483-1492.

19. V a n^, t K l o o s t e r G., B l a a u b o e r B.J., N o o r d h o e k J. e.a. Cytochrome P450 induction and metabolism of alkoxyresorufins, ethylmorfine and testosterone in cultured hepatocytes from goat, sheep and cattle. Biochem. Pharmacol., 1993, 46: 1981-1990.

20. M o n t e s s i s s a C., A n f o s s i P., V a n^, t K l o o s t e r G. e.a. The use of cultured hepatocytes from goats and cattle to investigate xenobiotic oxidative metabolism. Vet. Res. Comm., 1996, 20: 449-460.

21. M i e r t v a n A s j p a n, P e t e r s R.H.M., B a s u d d e C.D. e.a. Effect of trenbolone and testosterone on the plasma elimination rates of sulfamethazine, trimethoprim, and antipyrine in female dwarf goats. American J. Vet. Res., 1988, 49: 2060-2064.

22. European Commission, Directorate-General VI (Agriculture), Proceedings of the Scientific Conference on Growth Promotion in Meat Production, Brussels (November 29-December 1, 1995). Office for Official Publications of the European Communities. ISBN 92-827-6321-8. Luxembourg, 1995: 271-296.