Эффективность инокуляции грибом Glomus intraradices и внутрипопуляционная изменчивость растений люцерны хмелевидной по показателям продуктивности и микоризообразования

Размещено на http://www.allbest.ru/

Эффективность инокуляции грибом Glomus intraradices и внутрипопуляционная изменчивость растений люцерны хмелевидной по показателям продуктивности и микоризообразования

А.П. Юрков, Л.М. Якоби, Г.В. Степанова, Н.И. Дзюбенко, Н.А. Проворов, А.П. Кожемяков, А.А. Завалин

Оценивали внутрипопуляционный полиморфизм двух дикорастущих популяций и двух сортопопуляций люцерны хмелевидной (Medicago lupulina L.) по показателям продуктивности и интенсивности образования микоризы с грибом Glomus intraradices. Отбирали близкородственные генотипы, различающиеся по симбиотическим признакам, в качестве объектов для изучения механизмов формирования эффективного симбиоза при возделывании люцерны на почве с низким содержанием доступного фосфора. Показано, что среди исследованных форм люцерны могут быть выделены растения с высокой эффективностью симбиоза с грибом G. intraradices, a дикорастущая популяция Павловская представляет интерес как источник контрастных по этому признаку генотипов.

Ключевые слова: арбускулярная микориза, Medicago lupulina, Glomus intraradices, генотипическая изменчивость, продуктивность растения, эффективность симбиоза.

Summary

Inoculation efficiency of Glomus intraradices and intrapopulation variability in plants of medicago lupulina L. on productivity and forming of mycorrhizal

A.P. Yurkov, L.M. Yakobi, G.V. Stepanova, N.I. Dzyubenko, N.A. Provorov, A.P. Kozhemyakov, A.A. Zavalin

On the background of low content of available phosphorus in soil the authors estimate the intrapopulation polymorphism of two wild population and two varietal populations of Medicago lupulina on productivity and activity of mycorrizal forming. It was shown that among studied alfalfa forms the individual plants have high-efficient symbiosis with Glomus intraradices, and the Pavlovskaya wild population is of interest as a source of genotypes contrasting on this characteristic.

Известно, что при низком содержании доступного фосфора (Р_д) в почве проблема фосфорного питания у многих растений (включая травы и кустарники) успешно решается посредством образования арбускулярной микоризы (АМ) с грибами порядка Glomales. Впервые роль АМ в адаптации растений к дефициту Р_д была установлена в 1943 году (1), однако научно обоснованная модель формирования эффективного микоризного симбиоза до сих пор не разработана, несмотря на прогресс в исследовании физиологии АМ. Для решения этой задачи необходимо располагать модельными растениями -- контрастными по симбиотической активности близкородственными генотипами. Их источником могут быть дикорастущие популяции в силу того, что в природе почвы характеризуются низким содержанием доступных для питания форм фосфора и растения эволюционировали совместно с микоризообразующими грибами, сохранив симбиотический потенциал. Однако сведения о внутрипопуляционной изменчивости эффективности микоризообразования у дикорастущих форм растений крайне ограничены. Например, показано, что у многих дикорастущих популяций и примитивных сортов гороха посевного формируется высокоэффективный симбиоз с активными штаммами грибов АМ: в вегетационном опыте прирост урожая зерна от инокуляции Glomus sp. на фоне заражения ризобиальными бактериями составил в среднем по 99 образцам 184±10 % (2).

Коммерческие сорта гороха характеризовались сравнительно низкой отзывчивостью на инокуляцию (цит. по 2), очевидно, вследствие того, что они создавались на фоне высоких доз минеральных удобрений и могли утратить гены, обеспечивающие способность к эффективному симбиозу, а селекция по симбиотическим признакам ранее не проводилась. В то же время эксперименты с яровой пшеницей свидетельствуют о значительном внутрисортовом полиморфизме растений по симбиотическим признакам: в производственных посевах встречаемость аборигенной микоризной инфекции в корнях растений варьировала в пределах 21-96 % (Cv = 29 %), причем растения с высокой и средней жизнеспособностью характеризовались наибольшими показателями микоризообразования и формировали 92 % урожая (3).

Как источник контрастных по симбиотическим признакам генотипов представляет интерес люцерна хмелевидная (Medicago lupulina L.): вид широко распространен в разных климатических зонах, характеризуется высокой изменчивостью, самоопылитель, диплоид, удобный объект для получения линейного материала, имеет хозяйственное значение -- во Всероссийском НИИ кормов им. В.Р. Вильямса (ВИК) ведется селекционная работа по созданию сортов для использования в луговодстве и в качестве сидерата (4).

В связи с этим нами были поставлены следующие задачи: у дикорастущих популяций и примитивных сортов (сортопопуляций) люцерны хмелевидной на основании агробиологических показателей индивидуальных растений при низком содержании Р_д в почве на фоне инокуляции G. intraradices оценить внутрипопуляционный полиморфизм растений по эффективности микоризного симбиоза, выявить взаимосвязь между показателями продуктивности и микоризообразования и отобрать близкородственные генотипы, различающиеся по симбиотическим признакам.

Методика. Объектом исследования служили четыре формы люцерны хмелевидной различного происхождения: три озимые -- сортопопуляция Мира (Московская обл.), дикорастущие популяции Павловская и Юнтоловская (Ленинградская обл.) и одна яровая -- сортопопуляция ВИК32 (Казахстан). Семена форм озимой люцерны получены из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР), яровой -- из коллекции ВИК. Для посева были отобраны одинаковые по размеру хорошо выполненные семена, что позволило свести к минимуму влияние массы семян на продуктивность растений. Семена стерилизовали серной кислотой в течение 8 мин, промывали и проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри в стерильных условиях. Для инокуляции использовали активный штамм G. intraradices -- изолят CIAM8 из коллекции Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии. Гриб размножали в горшечной культуре на плектрантусе (Plectranthus australis L.). Растения выращивали на стерильном субстрате -- смеси почвы с песком в соотношении 2:1 по массе. Почва дерново-подзолистая легкосуглинистая отобрана с участка пашни с низким естественным плодородием (содержание P₂0₅ и K₂O по Кирсанову -- соответственно 3,9 и 7,0 мг/100 г почвы, органического вещества -- 3 %, pH_KCl после известкования -- 6,1).

Двухсуточные проростки высаживали по 5 шт. на вегетационный сосуд (2,6 кг субстрата) и инокулировали грибом, внося 100 мг свежих микоризованных (в контроле -- немикоризованных) корней плектрантуса под каждое растение (опыт и контроль -- соответственно «+АМ» и «-АМ»). Полив осуществляли 1 раз в сутки кипяченой водой (по массе из расчета 60 % ПВ почвы). Растения помещали в бокс, оборудованный люминесцентными лампами белого света и OSRAM Fluora 36W77, которые обеспечивают оптимальные условия для фотосинтеза. Режим смены дня и ночи -- 18/6 ч при температуре воздуха соответственно 24/22 С. Условия опыта исключали спонтанное заражение клубеньковыми бактериями.

Всего высадили по 35 растений популяций Павловская и Юнтоловская и по 65 растений сортопопуляций Мира и ВИК32. Учет урожая проводили на 88-е сут после посадки в фазу кущения--начала стеблевания озимых и в фазу плодоношения яровых форм. Для каждого растения определяли высоту куста, кустистость и общую воздушно-сухую биомассу; отбирали пробы корней для учета микоризообразования (в варианте с инокуляцией), а также пробы листьев для определения содержания фосфора (у растений популяции Павловская). После учета озимые растения пересаживали на хорошо окультуренную почву для получения семян. Отзывчивость форм люцерны на инокуляцию грибом (эффективность АМ) рассчитывали по формуле Ю. Одума:

где X_+АМ, X_-АМ -- показатели продуктивности соответственно инокулированных и неинокулированных грибом растений (5). Валовое содержание фосфора в растениях оценивали по методу Труог и Мейер после озоления в смеси серной и хлорной кислот по К.Е. Гинсбург и Г.М. Щегловой (6), учет микоризообразования -- по методу A. Trouvelot с соавт. (7) с использованием авторской компьютерной программы Mycorrhiza 1.0 (А.П. Юрков, 2005) после мацерации и окрашивания корней согласно J.M. Phillips и D.S. Hayman (8). Для каждого растения в варианте с инокуляцией грибом определяли: встречаемость микоризной инфекции в корне (F, %), обилие арбускул и везикул в корне (соответственно A и B, %) и в микоризованной части корня (соответственно a и b, %) (7). Корреляционный и статистический анализы проводили по Доспехову (9).

Определяли коэффициенты вариации (Cv, %), асимметрии (As, %) и эксцесса (Ex, %) по показателям продуктивности и микоризации. Достоверность различий между средними значениями и между Сv оценивали по t-критерию Стьюдента. Морфотипический анализ озимых растений проводили в фазу цветения--плодоноше-ния. Фенотипы определяли по признакам: сроки цветения (раннее/позднее); вторичное кущение (наличие/отсутствие); третичное кущение (наличие/от-сутствие). При анализе влияния микоризации на морфотипическую структуру популяций оценку соответствия между наблюдаемыми и ожидаемыми распределениями проводили с помощью ²-критерия Пирсона.

Результаты. В вегетационном опыте инокуляция растений люцерны хмелевидной грибом G. intraradices приводила к образованию микоризы (в контроле микоризацию не наблюдали). Показано, что у всех изученных форм люцерны колонизация кортекса грибом проходит одинаково по так называемому «арум»-типу, то есть с образованием арбускул, в отличие от «парис»-типа, для которого характерно формирование клубков гиф внутри клеток коры корня. Для всех популяций и сортопопуляций люцерны отмечали высокую частоту встречаемости микоризной инфекции в корнях (66-92 %) (табл. 1). При этом выявили некоторые различия в структуре микоризы у яровой люцерны по сравнению с озимой.

Так, у растений сортопопуляции ВИК32 обнаружили обилие везикул (b и B) и незначительное количество арбускул (a и A) в микоризе; у растений сортопопуляции Мира, популяций Юнтоловская и Павловская соотношение было обратным. Очевидно, это связано с фазами роста и контролем со стороны растения за развитием микоризы. По структуре микоризы у форм озимой люцерны оказалось, что в популяции Павловская у растений арбускулы развиты слабее, чем в популяции Юнтоловская и сортопопуляции Мира. Единственное растение без микоризы обнаружили в популяции Павловская. Для форм озимой люцерны (популяции Павловская и Юнтоловская, сортопопуляциия Мира) получены высокие значения Cv по всем показателям микоризообразования: F -- соответственно 35,6±4,3; 28,1±3,4 и 20,2±1,0; A -- 58,6±7,0; 61,7±7,4 и 70,3±6,3; a -- 43,6±5,2; 39,6±4,7 и 53,3±4,7; B -- 95,3±11,4; 89,9±10,7 и 56,0 ±5,0; b -- 72,3±8,6; 62,3±7,4 и 44,7±4,0. Яровая люцерна (сортопопуляция ВИК32) характеризовалась сравнительно низкими значениями Cv по встречаемости микоризы (10,4±1,2) и обилию везикул в микоризе (14,9±1,8), средними - по обилию везикул в корне (24,9±2,90) и высокими -- по обилию арбускул в корне (84,9±10,0) и микоризе (78,9±9,3).

Инокуляция грибом G. intraradices приводила к увеличению всех показателей продуктивности -- высоты растения, кустистости и накопления сухой биомассы (см. табл. 1). Наибольшую эффективность инокуляции по накоплению сухой биомассы (+2776 %) отмечали у растений яровой люцерны сортопопуляции ВИК32 (см. табл. 1) (в контроле без микоризы проявлялись признаки карликовости: слаборазвитая корневая система, мелкие темно-зеленые листовые пластинки, укороченный тонкий стебель, отсутствие бокового ветвления). Иными словами, эти растения не способны существовать в природе на бедных почвах без микоризы, на основании чего их можно отнести к облигатным симбионтам. Согласно гипотезе M. Tsimilli-Michael с соавт. (10), микоризная инокуляция в условиях низкого содержания Р_д в почве действует как стрессор, запускающий механизмы адаптивных перестроек в растении. Яровая люцерна сортопопуляции ВИК32 может служить объектом изучения адаптивных процессов, а также использоваться для получения мутантов с отклонениями в развитии микоризы, которые можно отобрать по признакам карликовости.

Формы озимой люцерны были лучше приспособлены к росту на почве с низким содержанием Р_д в отсутствие АМ по сравнению с растениями сортопопуляции ВИК32 и уступали им по показателям эффективности микоризации. Эти формы характеризовались высокой внутрипопуляционной изменчивостью по показателям продуктивности как в варианте с инокуляцией, так и в контроле (табл. 2). По кустистости абсолютные значения Cv в варианте с инокуляцией снизились по сравнению с контролем, что свидетельствует об оптимизирующем действии микоризы на показатель. По высоте стебля значения Cv в вариантах с инокуляцией, наоборот, возросли, что указывает на влияние микоризации на гормональный статус растений. По накоплению биомассы растений увеличение Cv в варианте с инокуляцией грибом АМ по сравнению с контролем (с 53 до 89 %) наблюдалось только у популяции Павловская. У остальных форм озимой люцерны значения Сv в контроле и опыте были высокими, но одинаковыми. Таким образом, по эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом популяция Павловская наиболее полиморфна.

У сортопопуляции ВИК32 коэффициенты вариации по всем показателям продуктивности при инокуляции были существенно ниже, чем в контроле. Анализ коэффициентов асимметрии и эксцесса показателей продуктивности также свидетельствует о влиянии AM на структуру исследуемых популяций (см. табл. 2).

Таблица 1. Показатели продуктивности, эффективности симбиоза и микоризации различных форм люцерны хмелевидной, не инокулированных и инокулированных эндомикоризным грибом Glomus intraradices

Примечание. -АМ и +АМ -- соответственно без инокуляции и при инокуляции грибом G. intraradices.

* P < 0,05, ** P < 0,01.

полиморфизм генотип люцерна микоризообразование

Таблица 2. Параметры изменчивости изученных показателей продуктивности у форм люцерны хмелевидной, не инокулированных и инокулированных грибом Glomus intraradices

Примечание. -АМ и +АМ -- соответственно без инокуляции и при инокуляции грибом G. intraradices. Подчеркиванием выделены значения, по которым зафиксирован полиморфизм по отзывчивости растений на инокуляцию G. intraradices. Cv, As, Ex -- соответственно коэффициенты вариации, асимметрии и эксцесса.

**, * и без звездочки -- Cv имеет соответственно высокое, среднее и низкое значение, As (Ex) значим соответственно при Р < 0,01, P < 0,05 и P < 0,10 (по t-критерию Стьюдента).

При сравнении контрольного (без инокуляции) и опытного (с инокуляцией грибом АМ) вариантов достоверные различия по Cv, As и Ex зафиксированы для сортопопуляции Мира и популяции Юнтоловская -- в трех случаях, для популяции Павловская и сортопопуляции ВИК32 -- соответственно в четырех и шести случаях (см. табл. 2). Существенные различия по этим коэффициентам между опытом и контролем в совокупности с высокими показателями отзывчивости растений на инокуляцию грибом АМ указывают на внутрипопуляционный полиморфизм всех исследованных форм люцерны по эффективности симбиоза с G. intraradices.

По результатам морфометрического анализа у форм озимой люцерны выделено четыре фенотипа: два основных (А и В) и два сопутствующих (К и С). Фенотип А: раннее цветение, слабо облиственный куст, стебли (сверху на ?) имеют мелкие сидячие листья. Фенотип В: позднее цветение, стебли хорошо облиственные, интенсивное боковое ветвление, листья с черешком до ? высоты стебля, выше -- сидячие. Фенотип К («вторичное кущение»): стебли высотой 20-40 см, хорошо облиственные, лист с черешком. Фенотип C («третичное кущение»): стебли высотой до 15 см, хорошо облиственные, лист с черешком. На основании указанных показателей были выделены следующие морфотипы: А, АС, АК, АКС, ВС, ВКС (рис. 1).

Рис. 1. Структура популяции люцерны хмелевидной Павловская по морфотипам A, AC, AK, AKC, BC, BKC: а и б -- соответственно растения при микоризации Glomus intraradices и без микоризы.

Озимые популяции в целом имели аналогичную морфотипическую структуру. Только для популяции Павловская влияние инокуляции растений грибом АМ на структуру популяции было достоверным (Р < 0,05). При микоризации (см. рис. 1) появлялся морфотипический класс ВС, снижалась доля класса ВКС в 3,5 раза, увеличивалась доля класса АС в 2,5 раза и исчезал класс А. Эти изменения относительно контроля свидетельствуют об ускорении роста растений и более полной реализации потенциального кущения за счет образования микоризы.

Наиболее часто применяемый показатель F (встречаемость микоризы) не имел достоверных прямолинейных или криволинейных связей с показателями продуктивности растений. При анализе популяции Павловская была выявлена достоверная (Р < 0,05) положительная взаимосвязь между обилием арбускул и накоплением сухой биомассы, обилием везикул и накоплением сухой биомассы, обилием везикул и высотой растения, обилием арбускул в микоризе и кустистостью (табл. 3).

Таблица 3. Коэффициенты корреляции (r) по изученным показателям у растений люцерны хмелевидной популяции Павловская при инокуляции грибом Glomus intraradices

Несмотря на то, что при инокуляции грибом в растениях люцерны значительно увеличилось содержание фосфора (в среднем в 1,8 раза -- с 4,90 мг Р₂О₅ на 1 г массы в контроле до 8,65 мг в опыте), не выявлено корреляционной связи между этим показателем и интенсивностью микоризации (см. табл. 3). На первый взгляд, это не соответствует современным представлениям о роли арбускулы в обмене продуктами метаболизма и фосфором между растением-хозяином и микосимбионтом (11). Возможное непротиворечивое объяснение подобного факта -- накопление резервного запаса фосфора у микоризованных растений в результате адаптивных перестроек. Такой же вывод следует из сравнения коэффициентов корреляции между показателями продуктивности и содержанием фосфора у микоризованных и немикоризованных растений: в первом случае не выявлено корреляционных связей между этими показателями, во втором -- получена достоверная положительная корреляция (см. табл. 3). Соотношение Cv по содержанию фосфора в растениях популяции Павловская в контроле и опыте (соответственно 26,9 и 6,6 %) также свидетельствует об оптимизации содержания фосфора микоризой.

Для популяции Юнтоловская, сортопопуляций Мира и ВИК32 не выявили достоверных линейных взаимосвязей между показателями продуктивности и микоризации, однако обнаружили достоверную (Р < 0,01) криволинейную зависимость между обилием арбускул и сухой биомассой растений: = 0,62±0,11 (сортопопуляция Мира); = 0,64+0,13 (популяция Юнтоловская); = 0,60+0,14 (сортопопуляция BИK32) (криволинейность подтвердили по F-критерию Фишера, P < 0,05). По этим показателям у растений наиболее многочисленной морфотипической группы АКС сортопопуляции Мира (n = 30; в остальных популяциях, где n_АКС < 30, такой анализ не проводили) установили тот же характер корреляций, что для всей выборки (рис. 2), и отобрали три группы линий с различной продуктивностью (М4м3 и М4м5; М7м4 и М13м5; М5м3 и М7м1) с целью последующего изучения эффективности симбиоза.

Рис. 2. Изменение сухой биомассы в зависимости от обилия арбускул (а, з = 0,27+0,18, P > 0,05) и обилия арбускул в зависимости от сухой биомассы (б, з = 0,62+0,15, P < 0,01) у растений люцерны хмелевидной морфотипа АКС сортопопуляции Мира при микоризации Glomus intraradices. M4m3, M4m5, M5m3, M7m1, M7m4, M13m5 -- линии с различной продуктивностью.

Таким образом, в условиях низкого содержания доступного для питания растений фосфора в почве все изученные дикорастущие популяции и сортопопуляции люцерны хмелевидной образуют эффективную арбускулярную микоризу с Glomus intraradices, характеризуются высоким внутрипопуляционным полиморфизмом по показателям продуктивности и интенсивности микоризообразования и представляют интерес как исходный материал для селекции эффективных симбиотических систем, а дикорастущая популяция Павловская -- как источник контрастных по этому признаку генотипов.

Литература

1. Koide R.T., Mosse B. A history of research on arbuscular mycorrhiza. Mycorrhiza, 2004, 14: 145-163.

2. Якоби Л.М., Кукалев А.С., Ушаков К.В. и др. Полиморфизм форм гороха посевного по эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом Glomus sp. в условиях инокуляции ризобиями. С.-х. биол., 2000, 3: 94-102.

3. Ширинкина Л.Г. Интенсивность микоризной инфекции у здоровых и пораженных пыльной головней растений пшеницы. Микориза растений, 1975, 142: 143-149.

4. Степанова Г.В. Хозяйственное использование люцерны хмелевидной. Сел. и сем., 1998, 3: 18-20.

5. Одум Ю. Основы экологии /Под ред. Н.П. Наумова. Пер. с англ. М., 1975.

6. Агрохимические методы исследования почв /Под ред. А.В. Соколова. М., 1975.

7. Trouvelot A., Kough J.L., Gianinazzi-Pearson V. Mesure du taux de mycorhization VA d'un systeme radiculaire. Recherche de methodes d'estimation ayant une signification fonctionnelle. In: Physiological and genetical aspects of mycorrhizae /V. Gianinazzi-Pearson, S. Gianinazzi (eds.). Paris, 1986: 217-221.

8. Phillips J.M., Hayman D.S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transact. British Mycor. Soc., 1970, 55: 158-161.

9. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М., 1973.

10. Tsimilli-Michael M., Strasser R.J. Mycorrhization as a stress adaptation procedure. In: Mycorrhizal technology in agriculture. From genes to bioproducts /S. Gianinazzi, H. Schьepp, J.M. Barea e.a. (eds.). Basel, 2002: 199-210.

11. Jakobsen I. Transport of phosporus and carbon in arbuscular mycorrhiza. In: Mycorhiza: structure, function, molecular biology and biotechnology. Berlin, 1999: 305-332.

Размещено на Allbest.ru